Sumário

Fundo

exsudados de tecidos contêm baixos níveis de proteínas do complemento sérico e seus efeitos reguladores no câncer de próstata progressão são em grande parte desconhecido. Foram examinados componentes específicos de complemento sérico na coordenação da ativação de supressores de tumor p53 e WWOX (também nomeado para ou WOX1) e cinases ERK, JNK1 e STAT3 em células DU145 da próstata humana.

Metodologia /Principais Achados

células DU145 foram cultivadas durante a noite em 1% de soro humano normal, ou em soro humano esgotado de uma proteína do complemento indicada. Sob complemento C1q- ou condições livres de C6, WOX1 e ERK foram principalmente presente no citoplasma sem fosforilação, enquanto que JNK1 fosforilado foi grandemente acumulados nos núcleos. Exógeno C1q rapidamente restaurada a activação WOX1 (com Tyr33 fosforilação) em menos de 2 horas. Sem complemento sérico C9, p53 tornou-se activado, e hialuronano (HA) reverteu o efeito. Sob condições de livre-C6, HA induz a activação da STAT3, um intensificador de metástases. Notavelmente, exógeno C1q induzida significativamente a apoptose de células que sobre-expressam DU145 WOX1, mas não células que expressam veículo. Um mutante negativo e Y33R dominante da WOX1 bloqueou o efeito apoptótica. C1q não intensificar a apoptose mediada por p53. Por microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRF), determinou-se que a C1q desestabilizado aderência de células que expressam DU145 WOX1 destacando parcial e induzir a formação de microvilosidades agrupado para adesão focal, em particular entre as células. Essas células, em seguida, foram submetidos a encolhimento, vesiculação da membrana e morte. Notavelmente, como determinado por imunocoloração, hiperplasia benigna da próstata e câncer de próstata foram mostrados para ter uma expressão significativamente reduzida de tecido C1q, em comparação com tecidos da próstata normais da mesma idade.

Conclusões /Significado

Concluímos que o complemento C1q pode induzir a apoptose de células cancerosas da próstata, ativando WOX1 e adesão celular desestabilizadora. Regulação negativa de C1q aumenta a hiperplasia da próstata e formação cancerosa devido a uma falha de activação WOX1

citação:. Hong Q, Sze, C-I, Lin S-R, Lee M-H, Ele R-Y, Schultz L, et ai. (2009) Complemento C1q Ativa supressor de tumor WWOX para induzir a apoptose em células de cancro da próstata. PLoS ONE 4 (6): e5755. doi: 10.1371 /journal.pone.0005755

editor: Nils Cordes, da Universidade de Tecnologia de Dresden, Alemanha |

Recebido: 04 de janeiro de 2009; Aceito: 05 de maio de 2009; Publicação: 01 de junho de 2009

Direitos de autor: © 2009 Hong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A investigação foi apoiado em parte pela Fundação Guthrie de Educação e Pesquisa, do Conselho Nacional de Ciência, Taiwan (NSC96-2320-B-006-014, 96-2628-B-006-041-MY3 96-2628-B-006- 045-MY3), o Instituto Nacional de Pesquisa em Saúde, Taiwan (NHRIEX97-9704BI), os Cheng Kung University Projectos Nacionais Marcos (C0167) e do Departamento de Defesa, EUA (BC075692) para NS Chang. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

de ácido hialurónico ou de hialuronano (HA) participa numa notavelmente multiplicidade de eventos celulares e fisiológicos, incluindo o desenvolvimento embrionário, a morfogénese, a diferenciação, a inflamação, a cura ferindo, resposta imune, e progressão do cancro e metástase [1] – [ ,,,0],4]. HA está envolvido na iniciação e progressão da inflamação em ambos os níveis celulares e extracelulares [5], [6]. Nos níveis celulares da inflamação, HA recruta neutrófilos, macrófagos e activa estimula a maturação das células dendríticas. No entanto, no soro HA podem interagir com proteínas de complemento. que ocorre naturalmente glicosaminoglicanos polissulfatados, tais como a heparina, restringir a activação do complemento no soro por meio das vias tanto clássica e alternativa durante a inflamação [7] – [10]. A potência de glicosaminoglicanos na inibição da activação do complemento depende da sua extensão e as posições de polysulfation. A menos que com alterações conf ormacionais, de HA não sulfatado, mesmo em altas concentrações (1-5 mg /ml), não pode restringir a activação do complemento [7], [11] – [13]. A indução da activação do complemento do soro tem sido considerada como estratégias importantes em matar células cancerígenas in

in vivo

[14], [15]. inibidores de cancro de células-derivadas para bloquear os componentes do complemento iniciais são conhecidos para aumentar o crescimento do cancro [16]. Expressão do factor H alternativa inibidor da via em células de cancro de pulmão parece ser crítico para a sua sobrevivência [17]. No entanto, o papel funcional de cada componente do complemento de soro individuais na regulação da sobrevivência de células de cancro é em grande parte desconhecida.

Tal como outros tecidos, da próstata é exposto a exsudados a partir do sangue, o qual contém níveis baixos de proteínas circulantes do complemento. Se as proteínas de complemento controlar o crescimento de células da próstata e hiperplasia com a idade é desconhecida. Aqui, através da utilização de soros com supressão seleccionado de proteínas de complemento, foi investigado se cada indivíduo proteína de complemento regula a activação de supressores de tumor e proteínas quinase em células DU145 da próstata humanos. Estas proteínas incluem por sinal extracelular regulado /quinase quinase ativada por mitógeno proteína (ERK ou MAPK) [18], WW oxidorredutase contendo domínio (WWOX, PARA, ou WOX1) [19] – [21], p53 [22], c -jun

N

quinase-terminal (JNK1) e transdutor de sinal e ativador de transcrição 3 (STAT3) [23] – [25]. Determinou-se que, sem complemento de soro de C1q ou C6, os níveis basais de acumulação nuclear ou activação de ERK e WOX1 foram reduzidos de forma significativa, ao passo que a activação constitutiva de JNK1 ocorreu. WOX1 é um supressor tumoral e proteína pró-apoptótica [19] – [21; rever]. Curiosamente, na ausência de complemento de soro C9, activação de p53 ocorreu constitutiva. tamanho molecular elevado HA induzida significativamente a activação da STAT3 em DU145, apenas quando a C1q estava ausente no soro. STAT3 promove a invasão do cancro da próstata [23] – [25]. Finalmente, C1q sozinho foi capaz de ativar WOX1 ectópica em matar células cancerosas da próstata. Nós discutimos o cenário provável para a circulação ou pericelular HA e complementar proteínas na regulação do crescimento de células de câncer e morte através da activação de p53, WOX1, JNK1, e STAT3.

Resultados

Complemento C1q ativa supressor de tumor WWOX /WOX1 em células DU145 próstata humana

Nós determinado se C1q ativa WOX1 endógena para a acumulação nuclear. A evidência substancial que revela WOX1 é um supressor de tumores [19] – [21], [26]. Fosforilação de WOX1 em Tyr33 (p-WOX1) é essencial para a sua actividade apoptótica ambos

in vitro

e

in vivo

[27] – [31]. No entanto, durante a hiperplasia inicial e cancerosas fases, há uma regulação positiva significativa da expressão e fosforilação WOX1 Tyr33 na próstata, pele e mama, e que a expressão é reduzida drasticamente durante a neoplasia e metástase

In vivo

[21] , [29], [32]. WOX1 murino /WWOX é crítica para a sobrevivência pós-natal, na medida em que os ratinhos knockout poderia sobreviver por apenas um mês [20], [33]. Além disso, esta proteína é essencial para o metabolismo normal do osso [33]. Os mecanismos sobre o controlo para WOX1 para exercer funções prosurvival ou proapoptóticos ainda não está estabelecida.

células DU145 humano foram cultivadas durante a noite na presença de soro fetal de bovino inactivado pelo calor (10%), seguido por inanição durante 1 h sem soro. Estas células foram então tratadas com C1q purificada durante 1 h. A localização de p-WOX1 foi determinada por microscopia de imunofluorescência. Estas células esfomeados tinha níveis muito baixos de citoplasmática de p-WOX1 (Fig. 1A). Exógeno C1q rapidamente induzido a acumulação de p-WOX1 no núcleo (Fig. 1B). Em comparação, quando as células foram cultivadas em jejum em 1% de C1q-empobrecido (ΔC1q) soro humano durante 1 h, P-WOX1 foi localizada principalmente no citoplasma (Fig. 1C). Reconstituição de soro ΔC1q com C1q rapidamente induzido a acumulação de p-WOX1 purificada no núcleo (Fig. 1D).

(A, B) células DU145 foram cultivadas na tampa de vidro e cultivadas durante a noite em 10% de fetal inactivado pelo calor de soro de bovino. As células foram, em seguida, pela fome sob condições isentas de soro, durante 1 hora, seguido por tratamento com ou sem C1q purificado (1 ug /ml) durante 1 h. Localização dos endógena WOX1 Tyr33-fosforilada (p-WOX1) foi determinada por microscopia de imunofluorescência. (C, D) Além disso, as células foram então cultivadas em jejum em 1% de soro humano (soro ΔC1q) C1q-empobrecido durante 1 hora, na presença ou ausência de C1q exógena (1 ug /ml). (E) A presença de p-WOX1 nos núcleos é mostrada a partir de -100 a contagem de células em 3 experiências (média ± desvio padrão).

complemento C1q activa WOX1 ectópica para induzir apoptose de células DU145

Nós determinado se C1q ativa WOX1 ectópica para induzir apoptose. células DU145 foram transfectadas com EGFP-WOX1 (marcado com EGFP) ou EGFP sozinho por eletroporação. Estas células foram cultivadas durante a noite (em 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor), seguido por tratamento com C1q purificado durante 24 h. C1q aumentada apoptose e crescimento supressão induzida por WOX1 de células DU145 de um modo relacionado com a dose, tal como revelado por uma população aumentada de células na fase SubG1 e uma população reduzida na fase G0 /G1 do ciclo celular (Fig. 2A e 2B e suplementar Fig. S1). Em controlos, C1q não induziu a apoptose em células que sobre-expressam EGFP DU145 apenas com vector (Figs. 2A e 2B).

(A) As células DU145 foram transfectadas com EGFP-WOX1 (marcado com EGFP) ou EGFP sozinho por electroporação , cultivadas durante a noite, e depois tratada com C1q purificado (1 ug /ml) durante 24 h. C1q aumentada apoptose induzida por WOX1 de células DU145 (ver aumentos na fase SubG1). No controle de vetores, C1q não aumentou a apoptose em células DU145 com superexpressão EGFP. (B) A partir de dados representativos constituídos 3 experiências é mostrado no gráfico de barras. Resultados semelhantes foram observados por transfecção de células DU145 com várias quantidades de WOX1, seguido por tratamento com 1 ug /mL de C1q dia para o outro (ver a Fig suplementar. S1). WOX1: EGFP-WOX1. Vector: somente EGFP. Sem ep: células sem eletroporação. (C) foram estabelecidas transfectantes estáveis ​​de células de BCC para expressar EGFP ou EGFP-hWOX1 (WOX1 humano /WWOX). Por microscopia de lapso de tempo, C1q (1 mg /ml) a morte induzida de células hWOX1 expressam, mas as células não EGFP-expressando. Estas células que expressam hWOX1 apareceu a sofrer apoptose típica, enquanto exibiram encolhimento celular e formação de bolhas de membrana de uma forma relacionada com o tempo. Um dados representativo é mostrado a partir de 5 experiências.

O aumento da apoptose por C1q não foi devido a sua activação da cascata do complemento no soro fetal de bovino, na medida em que o soro foi inactivado por calor. Além disso, sob condições isentas de soro, exógeno C1q aumentada apoptose mediada por WOX1 ectópica (dados não mostrados). Estas observações sugerem que WOX1 é um efector a jusante de apoptose mediada por C1q, sem o envolvimento de activação do complemento.

Em condições experimentais semelhantes, que mostrou que a C1q aumentou a apoptose em células que sobre-expressam WOX1. Estes incluíram MCF7 da mama (Recurso Fig. S2), e de neuroblastoma SH-SY5Y (Recurso Fig. S3) e células SK-N-SH (dados não mostrados). Mais uma vez, nenhum efeito foi observado usando células com superexpressão única EGFP.

Em paralelo, transfectantes estáveis ​​de carcinoma basocelular da pele (BCC) células para expressar EGFP ou WWOX humana /WOX1 (hWOX1 marcado com EGFP) foram estabelecidos utilizando G418 seleção. Por microscopia de lapso de tempo, que mostrou que as células que expressam EGFP BCC foram resistentes à morte celular mediada por C1q, enquanto que hWOX1-expressam células foram sensíveis a C1q (Fig. 2C). Estas células que expressam hWOX1 apareceu a exibir morfologia típica de apoptose, incluindo o encolhimento celular e formação de bolhas de membrana.

N-terminal

domínio WW Tyr33-fosforilada de WOX1 é responsável por apoptose induzida por C1q de células DU145

Nós determinamos qual domínio (s) em WOX1 participa na apoptose C1q mediada por células DU145. Humana e murina WWOX /FOR /WOX1 é composto por dois domínios WW-terminal

N

, um sinal de localização nuclear, e uma

C-terminal

álcool de cadeia curta desidrogenase /reductase (SDR) domínio [19-21,34; rever]. A negativa WOX1 dominante (dn-WOX1) foi projetado anteriormente, com alterações no

N

primeiro domínio WW-terminal [27]. DN-WOX1 é conhecido por bloquear a função apoptótica de p53 e impedir a fosforilação de WOX1 endógena em Tyr33 [27]. Quando as células DU145 foram transientemente sobre-expresso com DN-WOX1 (EGFP tag), as células de apoptose induzida por resistiu a C1q (Fig. 3). Em controlos, as células foram transfectadas apenas com um vector de EGFP, e as células não sofrem apoptose em resposta a C1q (dados não mostrados ou ver Fig. 2). Em controlos positivos, as células não transfectadas foram tratadas com estaurosporina de induzir apoptose de células DU145 (Fig. 3).

(A) foram electroporadas com várias quantidades de DN-WOX1 (tag EGFP) ou sozinho EGFP, seguido por cultura durante 24 horas. -DN-WOX1 expressando as células foram tratadas com C1q (1 ug /ml) durante a noite, e a análise do ciclo celular foi realizada. EGFP-expressando as células foram tratadas de modo semelhante (dados não mostrados). Além disso, as células de controlo não transfectadas foram tratadas com ou sem estaurosporina (1 uM) durante a noite. (B, C) Um banco de dados representativos estabelecidos tanto para SubG1 e G0 /G1 fases é mostrado (a partir de 3 experiências).

Assim, com base nas observações acima, o

N

domínio WW -terminal de WOX1 é provável que seja responsável pela activação induzida por C1q de WOX1 para matar células cancerosas. células DU145 foram transfectadas com o

N-terminal do domínio

WW de WOX1 (WOX1ww com uma tag de EGFP) ou apenas EGFP por electroporação e foram cultivadas durante 24 h. Por microscopia de lapso de tempo de células vivas, exógeno C1q induzida a apoptose das células que expressam os domínios WW (Fig. 4a). encolhimento celular e condensação nuclear ocorreu aproximadamente 100-130 minutos após a exposição das células a C1q. Este é um caso típico da apoptose. Quando as células foram co-transfectadas com DU145 WOX1ww e DN-WOX1, a apoptose induzida por C1q foi reduzido (Fig. 4B). Tyr33 fosforilação em WOX1 desempenha um papel-chave na apoptose ambos

in vitro

e

in vivo

[27] – [31]. Nós alterada Tyr33 para Arg33 no primeiro domínio WW [27], [35], e determinaram que a C1q não mediou a apoptose quando células expressa esta proteína mutante (Fig. 4C). Nas células de controlo do vector, não foi observada apoptose (Fig. 4D). morte celular mediada por C1q não foi observada nestas células de controlo depois de um tempo de incubação de mais de 24/08 horas, o que é semelhante às observações acima mencionados (Fig. 2).

(A) Live DU145 cells- expressando o

N-terminal do domínio

WW (WOX1ww; EGFP tag) foram tratados com C1q (1 ug /ml), seguido de registo de alterações morfológicas por microscopia de lapso de tempo automático (um quadro por 10 min). encolhimento celular e condensação nuclear ocorreu aproximadamente 100-130 minutos após a exposição das células a C1q. (B) Quando as células foram co-transfectadas com DN-WOX1ww e WOX1, a apoptose induzida por C1q foi significativamente reduzida. (C) Alteração de Tyr33 para Arg33 no WOX1 não causou morte celular C1q mediada. (D) n apoptose foi observada em células que expressam EGFP apenas mediante exposição a C1q. Em comparação com as experiências anteriores, a concentração C1q foi aumentada para os experimentos de microscopia de lapso de tempo. Um conjunto de dados representativo é mostrado a partir de 5 experiências. Cerca de 100 células foram examinadas no final de microscopia de lapso de tempo. A foto resultante da fusão da célula que expressa a imagem de campo claro fluorescência verde e é mostrado (antes do desafio com C1q).

A /apoptose induzida por WOX1 C1q foi ainda confirmada por análise de DNA fragmentação internucleossômica usando agarose electroforese em gel. Os resultados mostraram as escadas de ADN clivados como induzida por C1q em DU145 e SH-SY5Y células que expressam WOX1 (Fig. 5 e Suplementar Fig. S4). Nas células de controlo adequadas que expressam EGFP ou nada, C1q não induziu a fragmentação do ADN (Fig. 5 e Suplementar Fig. S4).

(A) células DU145 foram electroporadas com construções de WOX1, dn-WOX1 expressão de cDNA ( DN), e /ou p53. 24 horas mais tarde, as células foram expostas a C1q, durante 8 h. Em controlos apropriados, as células foram electroporadas com meio (Sham) ou sem electroporação (Cont). Nenhuma fragmentação do DNA foi mostrado nestes controlos. C1q aumentou a fragmentação de ADN em células que expressam WOX1, mas não p53. C1q suprimida p53 /fragmentação do DNA aumentou-WOX1. DN-WOX1 inibiu a morte celular causada por p53. (B) A intensidade da fragmentação do ADN foi quantificado pelo Photoshop, e uma média de resultados apresentados no gráfico de barras foram de duas experiências. O controle “Sham” (sem tratamento C1q) é considerado como 0%.

C1q não aumenta mediada por p53 apoptose

Nós mostramos que supressor tumoral p53 interage fisicamente com WOX1 , e ambas as proteínas podem causar a apoptose de uma forma sinergética [26], [27], [30]. Importante, WOX1 estabiliza p53 e impede a sua degradação [30]. Nós determinamos o papel de p53 e WOX1 na morte celular C1q-regulado. Quando as células DU145 foram transientemente sobre-expresso com p53, C1q não aumentou significativamente o grau de fragmentação de ADN (Fig. 5A e 5B). Em combinação, tanto p53 e WOX1 aumentada a fragmentação de ADN. Curiosamente, C1q suprimiu a fragmentação do ADN nas células que expressam p53 /-WOX1. De acordo com as nossas observações anteriores [27], DN-WOX1 foi demonstrado inibir a fragmentação de ADN mediada por p53 (Figs. 5A e 5B).

WOX1 ectópica induz a formação de microvilosidades agrupado entre células DU145 e aumenta a C1q a formação do cluster

Foram examinadas as alterações morfológicas celulares causados ​​pela expressão ectópica com EGFP ou EGFP-WOX1 em células DU145, mais o efeito de C1q. microscopia de lapso de tempo mostrou que C1q induzida encolhimento e formação de bolhas de membrana de células DU145 e BCC expressando WOX1 durante o tratamento por 2-4 horas ou mais (Fig. 2C e 4A). Quando as células DU145 foram sobre-expressos com EGFP e cultivadas durante a noite, estas células em repouso aderiram de modo plano sobre a superfície de cobertura de vidro, tal como determinado por microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRF) (Fig. 6A). medidas de imagem TIRF os eventos dinâmicos de proteína na membrana celular e áreas do citoesqueleto [36], [37]. Curiosamente, transitoriamente sobre-expresso de EGFP-WOX1 induzida formação ponteada na superfície da célula, e estes punctates, contendo EGFP-WOX1, foram principalmente agrupadas em entre as células (Fig 6B;. Ver setas). Numa ampliação maior, estas foram de facto punctates microvilosidades, os quais são necessários para a adesão focal (Fig. 6C). Notavelmente, muitas destas células que expressam WOX1 aderentes sobre a superfície da tampa de vidro principalmente por microvilosidades pericelular, como as suas áreas ventrais foram descoladas a partir da superfície. Durante o tratamento, durante 1 h, a C1q aumentou significativamente a formação de microvilosidades agrupado entre células (Fig 6B;. Ver seta). Esta ação parece desestabilizar a adesão celular de encolhimento posterior, formação de bolhas de membrana e eventual morte. De acordo com nosso relatório recente [38], WOX1 pode ser associada a hialuronidase superfície celular Hyal-2.

(A) Quando as células DU145 foram transfectadas com EGFP e cultivadas durante a noite, essas células aderidas categoricamente sobre a tampa de vidro superfície, tal como determinado por microscopia TIRF para medir a fluorescência verde sobre a membrana celular e áreas do citoesqueleto (600 × ampliação). Epi: epifluorescência. (B) Em contraste, transitoriamente sobre-expresso de EGFP-WOX1 induzida a formação de punctates, como apareceu em aglomerados, na superfície da célula (ver setas; 600 × de ampliação). C1q aumentou significativamente a formação punctata, particularmente entre as células (ver seta). Os aumentos nos números de pontua são aproximadamente 3-6 vezes. (C) Os punctates cluster, que são ricos em expressão EGFP-WOX1, são, de facto microvilosidades na superfície da célula (600 × ampliação por microscopia e ampliação digital 3x).

C1q é expresso no arquivo amostras e tecido da próstata é significativamente regulada negativamente em tecidos hiperplasia e próstata cancerosa

As observações acima sugerem que sérica ou derivadas de tecido complemento C1q pode induzir a ativação WOX1

in vivo

, restringindo assim a progressão canceroso. Enquanto alterações humana

gene WWOX

ocorrem mais frequentemente na próstata e de mama [20], [21], [34], examinamos a expressão de C1q em tecidos da próstata de arquivamento de pacientes pós-morte. Por microscopia de imunofluorescência, determinou-se que em comparação com tecidos da próstata pareados por idade, C1q é significativamente regulada negativamente na hiperplasia prostática benigna (BPH) e câncer de próstata (Figuras 7A e 7B;. 100 × ampliação). Com uma ampliação maior, C1q foi mostrado para expressar nas basais epiteliais e células das amostras de tecido da próstata de arquivo, e C1q foi colocalized com p-WOX1 nessas células (Fig. 7C).

(A) da próstata tecidos, incluindo próstata normal, hiperplasia prostática benigna e o cancro da próstata, foram coradas com um anticorpo específico contra C1q e depois com anticorpo secundário fluorescente. Os núcleos foram coradas com DAPI (100 vezes). (B) C1q é significativamente regulada negativamente em BPH e cancro da próstata, em comparação com os tecidos da próstata com a mesma idade (

P

0,0001, n = 5;

t

teste de Student). Quando soro não-imune foi usado como a fonte para o anticorpo primário, não se observou qualquer sinal (dados não mostrados). (C) C1q é expressa no basal e células epiteliais das glândulas prostáticas normais de arquivo (400 × ampliação). Ambos C1q e p-WOX1 são colocalized nestas células. Os núcleos foram corados com DAPI. Resultados semelhantes foram observados com as células da glândula de arquivo de BPH. Em comparação com os tecidos da próstata normais, foi aumentado o tempo de exposição para tirar as fotos para BPH. barra de escala, 100 mm.

Serum complementar C1q e C6 são essenciais à manutenção da fosforilação basal de ERK e WOX1 em células DU145

Nós investigamos se a regulação baixa de C1q

in vivo

pode reduzir a ativação de supressores de tumor

in vitro

, proporcionando assim uma melhor sobrevivência para células cancerosas da próstata. células DU145 foram cultivadas durante a noite sob condições isentas de soro, na presença de 1% de soro humano normal, ou 1% de soro humano com depleção de C1q, C6, C7, C8, C9 ou. Por Western blotting, foi determinado que ambos ΔC1q e soros ΔC6 não poderia suportar a expressão constitutiva de WOX2 (uma isoforma de WOX1) e p-ERK em células DU145 (Figs. 8A e 8B), o que sugere que C1q e C6 componentes do soro são essenciais para a expressão destas proteínas. Em comparação, C7 componente, C8 e C9 não suportam a expressão de WOX2 e p-ERK (Figs. 8A e 8B). Expressão de ERK, WOX1, MEK1, e p53 não foi significativamente afectada pelas condições acima mencionadas de cultura (Figs 8A e 8B;. Dados não mostrados para a MEK1).

(A, B) células DU145 foram cultivadas durante a noite sob condições isentas de soro (SF), ou em 1% de normal de soro humano (NHS) ou NHS empobrecido com C1q (ΔC1q), C6 (ΔC6), C7 (ΔC7), C8 (ΔC8), ou C9 (ΔC9). Foi observada redução significativa da expressão da isoforma WOX2 em células DU145 quando cultivadas in ΔC1q ou soro ΔC6 (versus controles SF;

p Art 0,001;

t

teste de Student), enquanto ΔC7, ΔC8, ou soro ΔC9 era menos eficaz. Activação ou fosforilação de ERK (p-ERK) era dependente da presença de C1q ou C6 no soro (versus controles SF;

p Art 0,001;

t

teste de Student). Um conjunto representativo de dados a partir de 3 experiências é mostrado. Os gráficos de barras mostram a média de 3 experimentos. As células acima (C) foram também cultivadas na tampa de vidro sob condições idênticas de soro. Por microscopia de imunofluorescência, soro, sem C1q ou C6 não poderia apoiar a expressão constitutiva de WOX2 (

p Art 0,0001, como contra SF ou NHS;

t

teste de Student). Cerca de 200 células foram quantificadas individualmente por microscopia de fluorescência, e a medida de fluorescência foi subtraído (ou normalizado) a partir de controlos negativos (células coradas com anticorpo secundário apenas). Os núcleos foram corados com DAPI. (D, E) As mesmas células, tal como indicado em (A), foram coradas com anticorpo P-WOX1 e o grau de expressão da proteína foi quantificado. (F) Mais uma vez, as experiências idênticas foram realizadas por Western blotting. Sub-C1q livre condições (soro ΔC1q), a ativação basal de WOX1 foi significativamente reduzida (redução de ~ 50%;

p Art 0,001 de contra SF e NHS;

t

teste de Student; n = 3).

Para confirmar as observações acima mencionadas, microscopia de imunofluorescência foi realizada. As células da experiência acima foram cultivadas na tampa de vidro sob condições idênticas de soro, em seguida, fixo, e coradas com anticorpos fluorescentes específicos. Mais uma vez, determinou-se que, na ausência de soro de C1q e C6, WOX2 expressão foi significativamente regulada negativamente em células DU145 (Fig. 8C). Além disso, quando as células DU145 foram cultivadas em soro sem C1q ou C6, os níveis de p-WOX1 foram significativamente diminuída em células DU145, em comparação com outras condições de cultura, tal como determinado por microscopia de imunofluorescência (Fig. 8D e 8E). Estas observações foram ainda confirmados por transferência de Western, que revelou a regulação negativa de p-WOX1-C1q sob condições livre (Fig. 8F). Sob estas condições, p-WOX1 estava presente principalmente no citoplasma das células DU145. Não foi observada apoptose nestas células durante 24 h em cultura, conforme determinado pela morfologia de núcleos corados com DAPI.

depleção do complemento C9 promove a acumulação nuclear de p53, e hialuronano estimula exportação nuclear

WOX1 interage fisicamente com p53 tanto

in vitro

e

in vivo

, e pode induzir a apoptose em sinergia [21], [26], [27], [30]. Embora exógeno C1q não pode aumentar a apoptose mediada por p53 (Fig. 5), examinou-se o efeito do complemento C1q e soro C6 em aumentar os níveis basais de acumulação nuclear de p53 ou de activação. Quando as células DU145 foram cultivadas em soro normal de 1% ou em soro sem C1q ou C6, acumulação de p53 nos núcleos foi reduzida, em comparação com condições isentas de soro (Fig. 9a e 9c). Notavelmente, sem soro C9, p53 foi acumulado no núcleo (Fig. 9B e 9C), o que sugere que C9 complemento de soro é capaz de restringir a activação de p53. Sob condições C9-deficientes, exógena de elevado peso molecular de HA induzida exportação nuclear de p53 para o citoplasma (Fig. 9B e 9C). Em contraste, HA restaurado p53 acumulação nuclear sub-C6 livre condições (Fig. 9A e 9C).

células DU145 foram cultivadas durante a noite em cada soro indicado com o esgotamento de uma proteína do complemento específico. localização de p53 nas células foi determinada por microscopia de imunofluorescência. (A) Na ausência de C6 complemento (soro ΔC6), p53 estava presente principalmente no citoplasma. tamanho molecular elevado de HA (50 ug /ml) induziu acumulação nuclear de p53 durante o tratamento, durante 1 h. (B) Na ausência de C9 soro (soro ΔC9), p53 foi localizada principalmente nos núcleos, e HA (50 ug /ml) induziu exportação nuclear em 1 h. (C) Para determinar a localização nuclear de p53, a cerca de 200 células foram contadas. Mostrado no gráfico de barras é uma média de resultados do formulário dois experimentos. (D) Em controlos negativos, as células foram coradas com anticorpo secundário conjugado com vermelho do Texas única. SF, sem soro; NHS, soro humano normal.

complemento de soro C1q e C6 esgotamento induz a ativação JNK1 constitutiva

Nós mostramos que JNK1 interage fisicamente com WOX1, e que a ligação é aumentada com a estimulação de células com luz UV ou anisomicina (ativador de JNK1)

in vitro

[27]. Curiosamente, dopaminérgico neurotoxina 1-metil-4-fenil-piridinio (MPP

+) reduz a ligação de WOX1 com JNK1 em cérebros de rato [31]. blocos JNK1 a função apoptótica de WOX1

in vitro

[27], ao passo que o antagonismo funcional

in vivo

é desconhecida. JNK1 e isoformas estão envolvidos em respostas de stress e apoptose, proliferação celular, e diversos tipos de doenças [39]. Embora os resultados acima mostraram que complemento C1q e C6 suportado a activação de WOX1 (Fig. 8), estas proteínas são previstos para bloquear a activação de JNK1, e depleção de C1q e C6 a partir de soros irá causar a activação de JNK1. Em condições experimentais semelhantes, quando as células foram cultivadas em DU145 ΔC1q ΔC6 ou soro, a activação de JNK1 constitutiva ocorreu, como determinado tanto por transferência de Western (Fig. 10A) e de microscopia de imunofluorescência (Fig. 10B).

(A) células DU145 foram cultivadas sob condições isentas de soro (SF), ou em 1% de soro de NHS, ΔC1q ou ΔC6 durante 16-24 hr. Na ausência de C1q e C6, de activação de JNK1 espontânea ocorreram (SF versus controlos;

P

0,001;

t

teste de Student), como determinado por Western blotting. Um conjunto representativo de dados é mostrada a partir de 3 experiências. (B) Resultados semelhantes foram observados por microscopia de imunofluorescência, que mostra a ativação JNK1 significativa ou acumulação nuclear sob soro C1q- e condições C6-livres (versus SF;

p Art 0,001; Student

t

teste, n = 3). ΔC9 soro não teve nenhum efeito. Cerca de 200 células foram contadas a partir de cada experiência. (C, D) Não houve ativação do STAT3 em células DU145 sob todas as condições de soro indicados. Sob condições de C1q-livres, o HA (50 ug /ml) induziu a fosforilação da STAT3 eficazmente em células durante o tratamento, durante 1 h. Cerca de 200 células foram contadas a partir de cada experiência (n = 3).

Na ausência de C1q, HA induz fosforilação da STAT3 em células DU145

activação da STAT3 desempenha um papel crítico na próstata invasão de células de cancro [23] – [25]. HA também participa na invasão do câncer, o que sugere que HA ativa STAT3 para promover a metástase do câncer. Da mesma forma, as células foram cultivadas durante a noite DU145 sob várias condições isentas de soro ou -presente. Estas células foram então expostas a HA durante 1 h. Nenhuma activação da STAT3 foi observada usando soros normais ou complementar-empobrecido (Fig. 10C e 10D). Nomeadamente, na ausência de C1q, HA induz a activação da STAT3 em células DU145 (Fig. 10C e 10D), o que implica que o HA pode aumentar a metástase de células de cancro da próstata C1q deficientes por upregulating STAT3 fosforilação e suprimindo a activação de p53 e WOX1. Todas as experiências acima foram realizados utilizando HA de grau médico de Lifecore. Resultados semelhantes foram observados utilizando grau médico Healon (dados não mostrados). Estas preparações HA são livres de contaminação de proteínas.

Discussão

A cascata do complemento de soro humano é tradicionalmente considerado como um sistema imune humoral poderoso que protege contra microorganismos invasores. No entanto, as propriedades funcionais de cada componente do complemento individual são em grande parte desconhecida. No presente estudo, nós demonstramos pela primeira vez que a C1q é expressa na próstata. Notavelmente, C1q expressão é significativamente reduzida em hiperplasia prostática benigna e cancro da próstata.