Abstract

Nos propusemos a estudar as efetoras chave de resistência e sensibilidade a inibidores da tirosina quinase ErbB2, tais como lapatinib em cancros da mama e do pulmão ErbB2-positivo. A baseados em células em>

mutagénese dirigida modelo resistência lapatinib identificadas várias mutações, incluindo a mutação ErbB2 gatekeeper ErbB2-T798I, como mediando a resistência. ErbB2-T798I engenharia modelos de células de fato mostrar resistência ao lapatinib mas permanecem sensíveis ao inibidor EGFR /ErbB2 irreversível, PD168393, sugestivo de potenciais estratégias de tratamento alternativa para superar a resistência. Expressão Gênica perfis de estudos identificaram um grupo seleto de alvos a jusante regulados por sinalização de ErbB2 e definir PHLDA1 como um gene imediatamente reprimidos mediante a inibição de sinalização ErbB2 oncogênico. Nós encontramos significativa diminuição da regulação da PHLDA1 no câncer de mama primário e PHLDA1 é estatística e significativamente menos expresso em ErbB2 negativo em comparação com tumores positivos ErbB2 consistentes com a sua regulação por ErbB2. Por último, PHLDA1 blocos superexpressão de sinalização AKT, inibe o crescimento celular e aumenta a sensibilidade lapatinib apoiando ainda mais uma importante função do regulador de crescimento negativo. Nossos resultados sugerem que PHLDA1 pode ter funções inibidores essenciais em ErbB2 pulmão conduzido e células de cancro da mama e uma melhor compreensão de suas funções pode apontar para novas opções terapêuticas. Em resumo, os nossos estudos definir novas formas de modulação de sensibilidade e resistência à inibição ErbB2 em cancros dependentes de ErbB2

Citation:. Li G, Wang X, Hibshoosh H, Jin C, Halmos B (2014) Modulação de ErbB2 O bloqueio em cancros ErbB2-positivo: O Papel do ErbB2 Mutações e PHLDA1. PLoS ONE 9 (9): e106349. doi: 10.1371 /journal.pone.0106349

editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, China

Recebido: 17 Setembro, 2013; Aceito: 06 de agosto de 2014; Publicação: 19 de setembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela American Cancer Society (conceder Sem RSG-08-303-01-TBE para BH) e NIH /National Cancer Institute especializada Programa de Investigação de Excelência em Câncer de pulmão Humano P50 concessão CA90578-04 (BH). assistência histopatologia foi fornecido pelo recurso compartilhado Patologia Molecular, Herbert Irving Comprehensive Cancer Center. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ErbB2 é um receptor tirosina cinase ligado à superfície da membrana celular e está envolvida nas vias de transdução de sinal que conduzem ao crescimento celular e proliferação. Este gene é amplificado em 10-20% dos cancros da mama, e os resultados de amplificação em sobre-expressão da proteína, o que indica um fenótipo agressivo [1] – [4]. A sobre-expressão, amplificação e ocasionalmente mutações activadoras de ErbB2 também ocorrer em outros cancros, incluindo o cancro do pulmão de células não pequenas [5], [6]. O anticorpo humanizado trastuzumab (Herceptin) contra a sobre-expressa ErbB2 é provado ser eficaz no tratamento de cancros da mama e gástricas com amplificação ErbB2 [7]. Além disso, as mutações somáticas no domínio de cinase de ErbB2 foram descobertas em vários cancros sólidos incluindo carcinomas do pulmão e da mama [8] – [12]. Mais recentemente, os inibidores de tirosina-cinase de EGFR /ErbB2 dupla também se mostraram promissores em estudos clínicos. Uma dupla, reversível inibidor de EGFR /ErbB2, lapatinib (Tykerb), em particular, demonstrou actividade significativa em cancros da mama ErbB2-positivo e agora está aprovado para ser usado nesta indicação [13]. https://en.wikipedia.org/wiki/HER2/neu – cite_note-3Inhibition de ErbB2 tirosina autofosforilação pelo lapatinib anula a jusante Ras-Raf-ERK1 /2 e crescimento /sobrevivência PI3K-AKT sinalização em ErbB2 superexpressão linhas celulares de cancro da mama e em pacientes com cancros da mama ErbB2-superexpressão [14].

O desenvolvimento uniforme de resistência adquirida ao lapatinib, infelizmente, limita a sua eficácia clínica. Em configurações análogas, mutações secundárias, tais como o exão KIT 17 mutações em GIST resistente ao imatinib e EGFR T790M em cancros do pulmão com mutação do EGFR são mecanismos comuns de resistência [8], [15]. Não há dados in vivo actualmente disponíveis sobre os potenciais mecanismos de resistência a lapatinib. Num sistema modelo in vitro, a mutação secundária, ErbB2 T798I confere o efeito mais forte resistência lapatinib em células Ba /F3 e é análoga à do receptor do factor de crescimento epidérmico T790M [16] – [18]. Um estudo recente sugere que, em sistemas in vitro modelo o desenvolvimento de co-dependência de vias de sinalização ER pode ser outro mecanismo potencial de resistência lapatinib [19]. Existem também dados que sugerem o envolvimento de activação AXL em lapatinib-resistência em cancro da mama positivo ErbB2 [20]. Claramente, existem outros mecanismos bem. Dadas as dificuldades de obtenção de amostras de doentes com primário, que é importante para a construção de sistemas celulares experimentais para rastrear mecanismo de resistência relevante que, em seguida, permitir o teste de inibidores alternativos para ultrapassar a resistência. É bem definida que o AKT /PI3K e ERK vias /MAPK são importantes efectores a jusante imediatas de sinalização oncogénica ErbB2. No entanto, a sua segmentação tem sérias deficiências em termos de toxicidade e um índice terapêutico estreito dadas as suas funções fisiológicas importantes. Portanto, uma melhor compreensão de toda a gama de alterações a jusante devem permitir a identificação de novos alvos acionáveis ​​e o desenvolvimento de estratégias mais eficazes e duráveis ​​para o tratamento de cancros ErbB2-positivo.

Em nosso estudo, definimos para o duplo objectivo de avançar nossa compreensão em ambas as áreas cruciais de ErbB2 oncogênico SINALIZAÇÃO adquiriram resistência ea jusante efetoras e moduladores de vias. Em primeiro lugar, nós estabelecemos sensibilidade ao tratamento lapatinib de linhas de células do pulmão e cancro da mama ErbB2-positivo, identificaram uma série de putativa adquiriu mutações de resistência e demonstrou que as mutações de chumbo ErbB2-T798 à resistência que podem ser superados pelo inibidor ErbB2 irreversível, PD168393. Em seguida, nós completamos um estudo perfil de expressão gênica identificar um grupo-chave de genes-alvo início ErbB2 e identificar PHLDA1 como um novo alvo a jusante do ErbB2 sinalizando com um papel funcional na mecanismos de feedback negativo para ajustar a saída de sinalização de ErbB2 e, assim, melhorando significativamente a sensibilidade das células de cancro da mama ErbB2-positivo ao lapatinib. Nossos estudos fornecem vários novos caminhos para estender os benefícios da inibição ErbB2 na gestão de cancros dependentes de ErbB2.

Materiais e Métodos

Paciente material

O tecido da mama e o tecido mamário normal circundante do tumor foram obtidas a partir de mesmo doente. Os tecidos fixados com formalina foram usadas para estudos imuno-histoquímica. O projeto foi aprovado pela Comissão de New York Presbyterian Hospital da Universidade de Columbia de Ética, e os pacientes assinaram consentimento de acordo com a Declaração de Helsinki.

Reagentes

EGF foi adquirido de Sigma- Aldrich (St. Louis, MO), PD168393 e CL387,785 foram adquiridos a partir de Calbiochem (Billerica, MA), lapatinib foi comprado de selleck Chemicals (Houston, TX). Os fármacos foram dissolvidos em DMSO para se obter uma /L de solução de estoque de 10 mmol e a concentração final de DMSO em todas as experiências era . 0,1%

Cultura celular

Calu3, HCC827, H1975, HCC202, células HCC1569, HCC1937 e T47D foram mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS, as células SKBR3 foram mantidas em meio de McCoy suplementado com 10% de FBS. MDA-MB-468 e células MDA-MB-436 foram mantidas em meio L-15 de Leibovitz suplementado com FBS a 10%, as células MCF-7 foram mantidas em meio DMEM suplementado com FBS a 10%. Todas as células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2 e estavam na fase de crescimento logarítmica, no início de todos os experimentos. As células MCF-7, MDA-MB-468 e MDA-MB-436 são fornecidas aqui cortesia do Dr. Matthew Maurer (Universidade de Columbia). Todas as linhas celulares foram adquiridos a partir de ATCC (Manassas, VA):

mutagênese ErbB2, geração de biblioteca, e resistência aos medicamentos tela

O pcDNA3.1 construção de plasmídeo. (-) – ErbB2-HA foi geradas como previamente descrito [8]. Nós introduzimos uma nova enzima local-Agel na posição 1457 no cDNA ErbB2. Então nós embaralhadas todo o domínio transmembranar e tirosina quinase ligação de ErbB2 pela Agel-AfeI digestão (AfeI site- posição 3191). Usando o pcDNA3.1 mutado (-) – plasmídeo ErbB2-HA, foi realizada mutagénese ao acaso, utilizando iniciadores que abrangem a região 1457-3191, na presença de 50 pmol /L de MnCl

2. A subclonagem no vector p-GEM-T Easy e sequenciação de colónias individuais mostraram que, essencialmente, todos os produtos de PCR continha mutações, com 50% dos produtos contendo uma variação de 1 pb. O conjunto de fragmentos de ADN amplificado foi digerido com AgeI e AfeI e religados na espinha dorsal de pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA vector. As células SKBR3 parentais foram transfectadas com as bibliotecas mutagenizadas. Os clones celulares foram seleccionados por meio fresco contendo 500 ug /ml de G418 e de 1 umol /L lapatinib após 24 horas de transfecção. Um mês mais tarde, colónias de células foram isolados e ainda amplificado na presença de G418 e lapatinib ambos e, em seguida, o domínio de cinase de tirosina de ErbB2 foi resequenced. alinhamento e análise da sequência foi feito com DNASTAR e software Mutation Surveyor (SoftGenetics, State College, PA).

Geração do plasmídeo ErbB2 T798I construir

O vector de expressão de ErbB2 T798I foi gerado pelo site- a mutagénese dirigida (kit de mutagénese QuickChange, Stratagene, Santa Clara, CA) do pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA construção de plasmídeo. Os iniciadores utilizados para a mutagénese dirigida ao local foram T798I, 5′-CACGGTGCAGCTGGTGATACAGCTTATGCCCTATG-3 ‘(sentido) e 5′-CATAGGGCATAAGCTGTATCACCAGCTGCACCGTG-3’ (anti-sentido). A sequência correcta do construto gerado foi confirmada por resequenciamento. Também construiu um tipo selvagem expressão ErbB2 construir como o controlo para ensaios de transfecção. estudos de transfecção transitória foram realizadas utilizando células COS-7 com estes plasmídeos reconstituídas. A análise por Western blot foi usado para confirmar o sucesso da transfecção com o uso de um anticorpo anti-etiqueta de hemaglutinina. G418 (500 ug /ml) foi usado para seleccionar as células transfectadas de modo estável e as colónias isoladas foram colhidos usando anéis de clonagem e continuaram a ser cultivadas na presença de G418. A expressão da proteína mutante T798I ErbB2 foi confirmada pela detecção da expressão do marcador de hemaglutinina como acima.

Inibição do Crescimento Celular Análise

As células foram semeadas em cada poço de placas de 96 poços em meio de células que contém 10% de FBS. 24 horas após o plaqueamento, as células foram tratadas com concentrações especificadas de inibidores. A concentração de DMSO no meio foi ajustada a 0,1%. Após 72 horas de incubação, o número de células viáveis ​​foram medidos usando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboximetoxifenil) -2- (4-sulf of enil) -2

H

-tetrazolium, sal interno (MTS; absorção de formazano a 490 nm; CellTiter96, Promega, Madison, WI) de acordo com o protocolo do fabricante. Cada ensaio consistiu de três poços em duplicado de uma mesma concentração de droga. A IC50 foi determinada a partir das curvas de dose-resposta.

imunotransferência

Para avaliar a activação de sinalização de ErbB2, as células foram deixados em jejum durante 12 horas e, em seguida, incubadas com lapatinib ou PD168393 durante 3 horas, seguido por EGF ( 100 ng /ml) ou heregulina (/ml) a estimulação de 20 ng por 15 minutos. Os lisados ​​celulares totais foram separadas em 8% de gel de SDS-poliacrilamida, transferidas para nitrocelulose, e a expressão da proteína foi detectada através da utilização de Ocidental relâmpago Reagente de Quimioluminescência (Perkin-Elmer Life Science, Wellesley, MA). A fosfo-Akt (Ser473), fosfo-ERK 1/2 (T202 /Y204), Total-Akt, ERK-anticorpos totais e GAPDH foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Os anticorpos para ErbB2 (C-18), PHLDA1 [21] – [23] e a etiqueta de hemaglutinina (F-7) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anticorpo dirigido contra fosfo-ErbB2 (Y1248) foi adquirido a R D systems (Minneapolis, MN). anticorpos anti-ratinho secundário anti-coelho e foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology. As experiências foram repetidas três vezes.

Ensaios

anexina iodeto /propídio e BrdU

Para ambos os ensaios, as amostras foram analisadas num células activadas por fluorescência digitalizar citómetro EPICS XL MCL (Beckman Coulter, Miami, FL ). ensaio de anexina /iodeto de propídio (PI) a apoptose foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (kit de coloração de anexina V-FLUOS, Roche Applied Science, Indianapolis, IN). As células foram semeadas a 1 x 10

6 células /poço em placas de 10 cm; 24 horas após o plaqueamento foi refrescado meios de concentrações especificadas de inibidores, em seguida, incubadas durante mais 72 horas. As células foram então tripsinizadas, lavadas com PBS, ressuspensas em tampão de anexina propídio /coloração com iodeto (Roche Applied Science), e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo. Os dados foram analisados ​​com o software FlowJo (árvore da estrela, Ashland, OR). Ensaio de proliferação de células bromo-desoxiuridina (BrdU) foi realizada de acordo com as instruções do fabricante (Kit de fluxo com FITC BrdU, BD Pharmingen, San Diego, CA). Resumidamente, as células Calu3 foram tratados com lapatinib em diferentes concentrações (concentração final: 0, 0,1, 1, 3, e 10 umol /L) durante 3 dias, em seguida, pulsação marcadas durante 60 minutos com 10 uM de BrdU, recolhidos por tripsinização e permeabilizadas com tampão BD Cytoperm, coradas com anticorpo anti-BrdU fluorescente, contrastadas com 7-amino-actinomicina D para o teor total de ADN e analisadas por citometria de fluxo. As experiências foram repetidas pelo menos três vezes.

Oligonucleotídeos células Análise

Calu3 e SKBR3 foram cultivadas até 60% de confluência em meio de cultura e, em seguida, foram tratados com lapatinib (1 uM), ou DMSO ( 0,01%) como um controlo, durante 6 horas. O ARN celular total foi isolado usando o RNAeasy Mini Kit (Qiagen, Germantown, MD). ARN qualidade foi avaliada através de electroforese Estação Automatizada Experion (Bio-Rad) e quantificado por espectrofotometria de fibra óptica utilizando o Nanodrop ND-1000 (Nanodrop Inc., Wilmington, DE, EUA). O ADNc foi sintetizado, marcado e hibridado com Affymetrix microarrays HG-U133A e digitalizada. O valor expressão de cada gene foi calculada utilizando software Affymetrix GeneChip eo método robusto Multichip Média (RMA) para a extração de sinal.

Pré-processamento, filtragem e análise estatística

Foram analisados ​​os dados de microarranjos e a taxa de descoberta de falsas foi calculada utilizando SAM (Universidade de Stanford, CA). normalização matriz e computação de valores de chip de expressão foram realizadas usando ADN-Chip Analyzer (dchip). Para anotação dos genes resultantes, utilizou-se o navegador ontologia gene NetAffymetrix (https://ww.affymetrix.com). Os genes diferencialmente expressos com ≥2 ou ≤0.5 mudança vezes, q-valor ≤1% foram analisadas pelo teste t e agrupados com o cluster pacote de software 3.0 [24].

Quantitative PCR Ensaio

O ARN total a partir de amostras em triplicado foi isolado usando RNAeasy Mini kit (Qiagen). O ADNc foi sintetizado com M-MLV de transcriptase inversa (III Superscipt transcriptase reversa, Invitrogen, Grand Island, NY) com o uso de oligo (dT) a partir de iniciadores de Invitrogen. Todas as amostras foram analisadas por Roche LightCycler utilizando as sondas Syber verdes. As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela S1. Níveis de expressão de GAPDH foram utilizados como referências internas para normalizar ADNc de entrada. Rácios de nível de cada gene de GAPDH foram então calculado.

Imunohistoquímica

formalina-fixo secções de tecido do tumor primário de mama foram desparafinados e reidratados e incubados com 0,6% de peróxido de hidrogénio em metanol. solução de recuperação de alvo, utilizou-se o pH 9.0 (Dako, Carpinteria, CA) para a recuperação de antigénio. As lâminas foram incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C, seguido por coloração com o Kit de R.T.U Vectastain Universal rápida (Vector Laboratories, Burlingame, CA) com contracoloração nuclear hematoxilina. Finalmente, as lâminas foram sequencialmente desidratados em etanol, limpou com xilenos. O anticorpo anti-PHLDA1 foi utilizado em diluição 1:50 (Santa Cruz Biotechnology). A intensidade da coloração das PHLDA1 foi marcado por uma placa certificada patologista câncer de mama como 0 (sem expressão), 1+ (expressão fraca), 2+ (expressão moderada) e 3+ (forte expressão) eo percentual (0-1,0 ) de células tumorais marcadas positivamente também foi avaliada para gerar um H-escore composto (intensidade pontuação X por cento positivos, gama de possíveis valores 0-3.0). Prata de hibridação in situ (SISH) foi utilizado para determinar o estado de ErbB2 em amostras de cancro da mama humano [25]. A proporção de ErbB2 /cromossoma 17 foi calculado dividindo-se a pontuação total para ErbB2 por a pontuação total para o cromossoma 17. Um rácio de 1,8 indicado que o gene ErbB2 não foi amplificado, enquanto que uma relação de 2,2 amplificação indicada do gene . Para os casos com um rácio entre 1,8 e 2,2, os sinais de mais 20 núcleos de tumor foram contados em cada slide e foi calculada uma nova relação.

plasmídeo constrói e transfecção celular

O comprimento cheio sequência de cDNA de PHLDA1 humana foi amplificado a partir de ADN genómico de células HCC827. PHLDA1 foi então modificado com um HA-tag no terminal C por PCR de sobreposição para distinguir plasmídeo derivado de proteína nativa e foi subclonado em pcDNA3.1 (-) vector de espinha dorsal. A precisão da construção foi confirmada por sequenciação directa de ADN. As células SKBR3 foram transientemente transfectadas com pcDNA3.1 vazio (-) (pcDNA3.1 (-) – EV) ou PHLDA1 (pcDNA3.1 (- PHLDA1 -)) vectores de expressão utilizando Fugene 6 (Roche Applied Science). Subclones estavelmente transfectadas foram seleccionadas com G418 na concentração de 500 ug /ml começando 48 h após transfecção

Anchorage independente ensaio de ensaio de crescimento e migração

Para o ensaio de crescimento independente de ancoragem, pcDNA3.1 (. – ) EV e pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 células transfectadas estáveis ​​foram tripsinizadas, contadas duas vezes usando um hemocitómetro, e colocadas em placas a 5000 células /mL em tampões de topo consistindo de 0,4% de agarose SeaPlaque (FMC Bioproducts, Rockland, ME) em meio de McCoy meio 5A. Após 25 dias, as colónias foram fotografadas e contadas. A experiência foi repetida três vezes com cada triplicado. número médio de colónias de cada experimento foram plotados. Para os ensaios de migração, monocamadas confluentes de pcDNA3.1 (-) – EV e pcDNA3.1 (-) – PHLDA1 células transfectadas estáveis ​​foram riscados com uma ponta de pipeta de 10 mL estéril. As placas foram então lavadas e incubadas a 37 ° C em meio 5A de 10% de FBS /McCoy durante 48 horas

sobrevivência clonogénica ensaio

Dois mil pcDNA3.1. (-) – EV e pcDNA3 0,1 (-) – células PHLDA1 SKBR3 foram plaqueadas em placas de 6 cm e foram deixados a recuperar durante 24 horas. As células foram então tratadas com 0,1 uM ou 0,5 uM lapatinib e foram deixadas a crescer durante 10 dias. Em seguida, as placas foram coradas com azul de metileno durante 4 horas e o número de colónias com mais de 50 células em cada placa foram determinadas. Um conjunto de placas não tratadas foram incluídas como controlos para determinar a eficiência de plaqueamento para as linhas celulares individuais. O número efectivo de células /placa foi determinado com base na eficiência de plaqueamento de cada linha celular e o número de células plaqueadas por placa. Estes números foram então usados ​​para calcular a percentagem de sobrevivência. Além disso, cada tratamento foi realizado em triplicado, a fim de determinar o SD para cada ponto de dados.

A análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando qui-quadrado ou teste de duas amostras

t

-Testes conforme o caso, com o

P

-valor de 0,05 considerado estatisticamente significativo. Os dados são expressos como média ± DP. Os dados são representativos de três experiências separadas.

Resultados

Lapatinib e PD168393 induzir a inibição do crescimento e apoptose em Calu3 ErbB2-positivo e células SKBR3

Em primeiro lugar temos conduzido o crescimento celular MTS Os ensaios para examinar se a inibição de ErbB2 por lapatinib, uma dupla EGFR reversível /ErbB2 inibidor de tirosina quinase, ou PD168393, que inibe irreversivelmente a ErbB2, pode levar a inibição do crescimento de células cancerosas ErbB2-positivo, tais como o cancro Calu3 pulmão ErbB2-positivo e SKBR linhas celulares de cancro da mama -3. Descobrimos que tanto lapatinib e PD168393 inibiu significativamente o crescimento das células SKBR3 e Calu3 (Fig. 1A). Outras investigações usando anexina V coloração mostrou que tanto lapatinib e PD168393 induzida apoptose proeminente em ambos os Calu3 e SKBR3 células (Fig. 1B e 1C). análise de incorporação de BrdU foi realizada para mostrar a proliferação reduzida de estas duas linhas de células por tratamento lapatinib. O lapatinib células tratadas Calu3 mostrou um G significativamente mais elevado

uma população consistente com L

1 prisão em comparação com células de controlo (Fig. 1D) e este foi ainda confirmada em células SKBR3 (Figura S1). Estes resultados sugerem que lapatinib induz a paragem do ciclo celular em G

1 e fase subsequente apoptose em células SKBR3 e Calu3. A fim de determinar o efeito sobre as vias de sinalização a jusante, os níveis de fosforilação da cinase MAP e AKT vias foram avaliados nestes dois modelos celulares ErbB2-positivo, e bloqueio robusta de ambas as vias de sinalização foi encontrada (Fig. 1E, Figura S2). Este achado foi correlacionada com os resultados dos ensaios de inibição de crescimento feito, o que sugere que a inibição do crescimento causada por lapatinib e PD168393 pode ser regulada por meio do bloqueio eficaz da quinase MAP e vias AKT.

. A proliferação celular de células Calu3 e SKBR3 tratadas com diferentes concentrações de lapatinib e PD168393, tal como determinado pelo ensaio de MTS. B. Lapatinib e PD168393 induzir a apoptose celular em células Calu3 e SKBR3. Anexina V representativas iodeto /propídio por citometria de fluxo; os números representam percentagem de células no quadrante adequado. C. Quantificação de apoptose. D. lapatinib induz a paragem do ciclo celular em células Calu3 conforme detectado por ensaio de BrdU e 7-ADD. fase R1-G1; fase R2-G2; R3-S fase; R4-fase G0. resposta E. Dose de lapatinib e PD168393 na fosforilação de ErbB2, AKT e ERK em células Calu3 e SKBR3 em resposta ao tratamento EGF. p-ErbB2: ErbB2 fosforilada; t-ErbB2: Total de ErbB2; p-AKT: AKT fosforilado; t-AKT: AKT total; p-ERK: ERK fosforilada; t-ERK:. ERK total de

Caracterização de resistência mutante ErbB2-T798I

Em seguida, seguiu uma estratégia de mutagénese aleatória, a fim de avaliar as mutações secundárias de ErbB2 que pode levar a funcional resistência ao lapatinib. Em primeiro lugar, todo o domínio transmembranar e de tirosina-quinase de ErbB2 (posições 1457-3191) foi mutagenizada aleatoriamente. Em seguida, a ErbB2 mutagenizada foi reformulado para um pcDNA3.1 (-) – ErbB2-HA espinha dorsal e transfectado para células SKBR-3. Geramos clones de células resistentes aos medicamentos SKBR-3, na presença de ambas as /ml de G418 e de 1? Mol L lapatinib /e identificados 9 substituições de aminoácidos que afectam distintas 500 ug 5 resíduos de derivados clonais isoladas. Foram identificados cinco substituições nas posições: P944L (3 casos), T798I (2 casos), T798M (1 caso), C576S (1 caso), R487P (1 caso), e E542G (1 caso). O resíduo crítico gatekeeper treonina no caso de ErbB2 é T798- que corresponde a T790 de EGFR, bem como T315 da Abl. Com base na sequência de nucleótidos de ErbB2, que é significativamente mais provável que uma mutação que altera a sequência de T798I (requer uma base de mudança par), versus T798M (são necessárias duas alterações de par de bases). Portanto, T798I foi escolhido para estudos posteriores.

T798I foi regenerada por mutagénese dirigida ao local e usado para estudos de transfecção transiente em células COS-7. Em pcDNA3.1 (-) – células Cos7 ErbB2-WT, 1 nmol /L inibiu significativamente a fosforilação de lapatinib de ErbB2. Em contraste, em pcDNA3.1 (-) – transfectantes ErbB2-T798I, fosforilação ErbB2 persistente foi observado na presença de lapatinib em concentrações que variam de 0,1 a 10 umol /L, confirmando a mudança na sensibilidade ao fármaco correspondente aos resultados da MTS Os ensaios (Fig. 2A). Para confirmar esta observação, também gerado um clone de células Calu3 estavelmente transfectadas com pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I-HA construção de plasmídeo e encontrou resultado bastante consistente (Fig. 2B). Foram avaliados o nível de resistência que pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I conferido ao lapatinib através da geração de curvas de dose-resposta por ensaios MTS no pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I transfectantes estáveis. As células foram cultivadas na presença de concentrações crescentes de lapatinib variando de 0 a 10 umol /L. pcDNA3.1 (-) – ErbB2-WT Calu3 células foram potentemente inibida por lapatinib (IC

50, 2,3 mmol /L). As células que expressam Calu3 pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I eram menos sensíveis ao lapatinib com um IC

50, 6,5 mmol /L (Fig 2C.)

A.. Dose resposta do lapatinib e PD168393 na fosforilação de ErbB2 em células Cos7 após 24 horas de transfecção com vetores de ErbB2-wt e ErbB2-T798I. ErbB2 Total, HA e nível de expressão GAPDH como controle. resposta B. Dose de lapatinib e PD168393 na fosforilação de ErbB2, AKT e ERK em clones de células Calu3 estável ErbB2-wt e ErbB2-T798I. ErbB2 Total, AKT total, a ERK total, o nível de HA e expressão GAPDH como controle. inibição do crescimento dependente da dose C. induzida pelo tratamento de lapatinib e PD168393 durante 72 horas em clones de células estáveis ​​Calu3-ErbB2 e ErbB2-peso T798I como detectado pelo ensaio de MTS. D. Lapatinib e PD168393 induzir a apoptose celular em clones de células Calu3 estável ErbB2-wt e ErbB2-T798I após o tratamento de 72 horas. E. Quantificação de apoptose.

Foram analisadas ainda as consequências funcionais da T798I avaliando apoptose celular induzida pelo lapatinib como definido por ensaios de iodeto de apoptose Anexina /propídio. Tratamento de pcDNA3.1 (-) – ErbB2-WT Calu3 células com 1 umol /L de lapatinib resultou em um aumento importante da percentagem de células apoptóticas, ao passo que nas mesmas concentrações tinham significativamente menos induzida apoptose em pcDNA3.1 (-) – transfectantes estáveis ​​ErbB2-T798I (fig. 2D e 2E). Estes resultados foram consistentes com estudos de transfecção transiente prosseguidos em células SKBR3 (Figura S3, S4 e S5).

Um PD168393 alternativa inibidor ErbB2 pode superar a resistência

Em seguida, testamos os clones T798I Calu3 contra o PD168393 inibidor ErbB2 /EGFR irreversível. Realizou-se ensaios padrão seguintes MTS 72 horas de tratamento de drogas usando uma gama de concentrações de 0 a 10 umol /L. Nossos dados mostraram que PD168393 conseguiu superar T798I resistência induzida contra lapatinib (Fig. 2C). Este inibidor foi tão eficaz contra pcDNA3.1 (-) – ErbB2-T798I como contra pcDNA3.1 (-) – ErbB2-WT transfectantes. Em estudos de sinalização, verificou-se que inibe completamente PD168393 AKT e fosforilação de ERK em concentrações tão baixas como 0,03 umol /L, de modo que, a fim de melhor mostrar a mudança de sinalização a jusante, foi utilizada uma gama de concentrações de 0-0,1 mmol /L. estudos de sinalização mostraram que o tratamento com PD168393 pode potencialmente inibir a sinalização a jusante correlaciona tal como fosfo-AKT e ERK (Fig. 2B). nível de fosforilação de ErbB2 em células com ErbB2 mutante estava alterada, mas em menor grau pela inibição PD168393 sugestivo de inibição parcial (Fig. 2B). estudos anexina /iodeto de propídio mostrou ainda a indução de apoptose por este composto em ambos pcDNA3.1 (-) – ErbB2-wt e pcDNA3.1 (-) – clones de células-ErbB2 T798I Calu3 (Fig. 2D e 2E). Estes resultados sugerem que T798I pode ser um mecanismo de resistência importante em tumores tratados com lapatinib, mas também sugerem potencial eficácia dos inibidores ErbB2 irreversíveis.

Gene perfil de expressão de células tratadas com lapatinib

A seguir, definidas para estudar uma ampla gama de alterações a jusante como resultado de uma inibição eficaz ErbB2. Anteriormente, em estudos similares que têm mostrado que tão cedo quanto 6 horas de sinalização de inibição, o inibidor de EGFR irreversível, CL-387785 pode induzir uma alteração significativa da transcrição em um grupo pequeno e representativos das principais efectores a jusante de sinalização de EGFR oncogénica, incluindo componentes da via importantes, tais como ciclina D1, etc DUSPs EGFR em cancros do pulmão mutantes [1], [26], [27]. De forma análoga, nos propusemos a identificar os primeiros efetores de mudanças de expressão de genes induzidos ErbB2 em células ErbB2-positivo. Para identificar os principais genes expressos diferencialmente em células SKBR3 tratadas com lapatinib (1 pmol /L) durante 6 horas, um estudo de perfil de expressão do gene foi realizado em triplicado em ARN celular total, utilizando chips de Affymetrix HG-U133A. Os dados de expressão brutos foram pré-processado, redimensionado, filtrada, e analisados ​​como descrito em Materiais e Métodos. Os genes alterados por tratamento lapatinib são mostrados na Tabela S2. Esta análise mostrou que 110 genes marcadores foram sub-regulada e 73 genes foram supra-regulados com os critérios rigorosos estabelecidos de uma mudança de dobragem, pelo menos, 2 e valor Delta 5 quando as amostras tratadas com lapatinib foram comparadas com as células tratadas com o veículo (o valor delta é um parâmetro de ajuste que podem alterar dinamicamente limites para significância).

uma comparação entre esta lista de genes com os nossos dados anteriores a identificação de mudanças genéticas sobre a inibição EGFR em células de câncer de pulmão dependente de EGFR [27], [28 ] mostrou uma notável sobreposição entre os genes significativamente moduladas em duas experiências independentes (Tabela 1). Mais de metade dos genes identificados em nosso estudo anterior de regulação do gene EGFR pelo bloqueio foram significativamente modulada sobre inibição ErbB2 em células cancerosas ErbB2-positivo também sugerindo vias oncogênicas altamente compartilhados. Seis dos melhores ErbB2 genes /reguladas-EGFR, DUSP6, DUSP4, PHLDA1, PHLDA2, CCNG2 e DRE1 foram seleccionados e confirmado para ser fortemente regulada pela análise quantitativa de transcrição reversa-PCR em ARN obtido a partir de células tratadas com lapatinib (Fig. 3) . análise

Quantitative PCR de regulação gênica por tratamento lapatinib durante 6 horas em células SKBR3 e Calu3. Dobre a indução em relação a 0 controle de horas foi traçada após a normalização de GAPDH. Δ: p 0,05; ×: p 0,01; †: p 0,005; *: P 0,001

PHLDA1 é regulada pela inibição EGFR /ErbB2

Em seguida, decidiu concentrar-se no romance gene alvo a jusante, PHLDA1 como uma proteína. que anteriormente não foi identificada a participar em ErbB2 conduzido /EGFR vias. Este gene pertence ao grupo de proteínas de domínio de homologia plecstrina-e especula-se a funcionar por meio de interferir com a função de PI3-quinase inibindo assim a activação AKT com base no trabalho de um outro membro da família, PHLDA3 [29].