Abstract
Fundo
fatores solúveis, incluindo moléculas de HLA solúveis, podem contribuir para o câncer de escape imunológico derivadas de tumores e, portanto, impacto na evolução clínica de doenças malignas. Nós relatado anteriormente que células de melanoma produzem,
in vitro
, formas solúveis da não-clássica molécula MHC classe I HLA-E (sHLA-E). A fim de investigar sHLA-E produção de diversos tipos de tumores e para tratar o seu valor potencial como um marcador associado a um tumor, foi desenvolvido um ELISA específico para a quantificação de sHLA-E em fluidos biológicos.
Metodologia /Apreciação Principais
foi desenvolvido um ELISA específico e sensível sHLA-e e que mostraram que os níveis séricos sHLA-e foram significativamente elevados (P 0,01) em pacientes com melanoma (n = 127), em comparação com dadores saudáveis (n = 94 ). sHLA-E também foi detectada nos sobrenadantes de cultura de uma ampla variedade de linhas celulares de tumores (n = 98), incluindo melanomas, nos rins, colo-rectal e os cancros da mama. As citocinas regulação da produção sHLA-E por células de tumor também foi efectuada. IFN-γ, IFN-α e TNF-α foram encontrados para regular positivamente a produção sHLA-E por células tumorais.
Conclusões /Significado
Tendo em vista a ampla libertação tecido tumoral de HLA-E e cabe-regulação por citocinas inflamatórias, sHLA-e deve ser estudado por seu envolvimento na resposta imune contra tumores. Curiosamente, os nossos resultados demonstraram uma associação positiva entre a presença de soro sHLA-E e melanoma. Portanto, a determinação dos níveis sHLA-E, utilizando abordagem ELISA, pode ser investigado como um marcador clínico em doentes com cancro
Citation:. Allard M, Oger R, Vignard V, Percier JM, Fregni G, Périer A , et ai. (2011) Serum Solúvel HLA-E em Melanoma: um novo potencial relacionadas ao sistema imunológico marcador em Câncer. PLoS ONE 6 (6): e21118. doi: 10.1371 /journal.pone.0021118
editor: Jacques Zimmer, Centre de Recherche Public de la Santé (CRP-Santé), Luxemburgo
Recebido: 10 de maio de 2011; Aceito: 19 de maio de 2011; Publicação: 21 de junho de 2011
Direitos de autor: © 2011 Allard et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios concedidos pelo “Ligue Nationale contre le Cancer” (labellisation 2007). O financiador não tem nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
evidências acumuladas demonstram a capacidade do sistema imunológico para identificar e destruir as células malignas, a fim de evitar o desenvolvimento do tumor. Este processo chamado de imunovigilância cancro, baseia-se na acção juntou dos efectores de inatas (células NK, células NKT, γδ T, e células dendríticas) e adaptativa (células específicas para o antigénio T e B) a imunidade para detectar e erradicar nascente transformadas células. No entanto, apesar da existência de antigénios de tumor imunogénicas bem definidas, e ainda na presença de células T citotóxicas específicas para o antigénio tumoral-, o sistema imunológico parece não ser totalmente eficaz na erradicação de tumores [1].
Vários mecanismos têm sido implicados no tumor de escape imune, incluindo as alterações estruturais e funcionais dos Leucócitos antigénios humanos (HLA), que representam eventos frequentes em cancros. Este incluem HLA de classe I clássica antigénio (HLA-A, -B, -C) ou perda de regulação baixa e a expressão aberrante de antigénios HLA de classe I não clássico (HLA-E, -G), proporcionando mecanismos que levam a uma diminuição no reconhecimento e destruição das células tumorais por efectores citotóxicos imunes (principalmente células CTL e NK) [2]. O interesse em moléculas de HLA não clássicas tem sido estimulado pela demonstração de que eles podem contribuir para a NK e T de fuga de células tumorais de células através da sua interacção com os receptores inibitórios NK [3] – [6]. Além disso, a produção de células não-ligadas moléculas solúveis de HLA (sHLA) foi também descrito e pode representar uma estratégia alternativa para o cancro de escape imunológico [7], [8]. Em apoio a esta hipótese, as moléculas sHLA foram mostrados para induzir
In vitro
inibição e /ou apoptose de CTL e NK [9], [10]. Além disso, o aumento dos níveis séricos de sHLA clássica e não-clássica foram descritos em várias doenças malignas, e sua relevância prognóstico é sugerido pela associação estatisticamente significativa com a doença de alto estágio ou com particular curso clínico em várias doenças malignas [11].
Nós observado anteriormente, em colaboração com os patologistas, uma expressão frequente de HLA-e por melanomas e carcinomas do cólon [12]. Estudos do nosso grupo e outros apoiaram um potencial imunossupressor desta expressão, através de acoplamento do NKR inibitório CD94 /NKG2A em células citotóxicas (CD8 e NK TIL) pela membrana de células tumorais HLA-E [13] – [16]. Também relataram que as linhas celulares de melanoma podem produzir formas solúveis de HLA-E (sHLA-E)
In vitro
, por derramamento de protease dependente de moléculas de superfície, e que esta produção foi aumentada por IFN-γ [12] .
o objectivo do presente projecto foi o desenvolvimento de um ensaio ELISA para a detecção e a quantificação de sHLA-e em fluidos biológicos, para validar a sua especificidade e, se adequado, para tratar o significado clínico da sHLA- níveis e no sangue de pacientes com melanoma.
resultados
Desenvolvimento de um HLA-e ELISA específica
Para detectar e quantificar sHLA-e em amostras biológicas, desenvolvemos um ELISA sanduíche utilizando não concorrentes sólido captura e detecção biotinilada anticorpos monoclonais anti-HLA-e MEM-e /08 e MEM-e /07, respectivamente. Primeiro, um intervalo de concentração de um purificada recombinante solúvel HLA-E (rsHLA-E) foi testado. A mostrada na Figura 1A, rsHLA-E foi detectado a uma concentração mínima de 5 pg /ml. Dada a reatividade cruzada relatado de ambos os anti HLA-E-Abs com classe quatro HLA Ia formas alélicas: HLA-A23, -B7, -B8 e -B27, nós então verificado a sua detecção com o nosso ensaio ELISA desenhado. Entre recombinante solúvel para HLA-A23, -B7, -B8 e -B27, bem como rsHLA-A2 utilizado como controlo negativo, apenas um sinal fraco foi obtido com rsHLA-B7 com a dose máxima de 20 ng /ml (Fig. 1B).
A /Detecção de sHLA-E utilizando diluições em série de recombinante HLA-E monômero. A área cinza indica o intervalo de níveis sHLA-E mensuráveis. B /Determinação da especificidade de ligação de HLA-E. As diluições em série de HLA-A2, -A23, -B7, -B8 -B27 e monómeros solúveis recombinantes foram testados em comparação com HLA-E recombinante monómero.
Estes resultados levaram à conclusão de que o ELISA sanduíche aqui descrito é altamente específico e sensível para HLA-e e pode ser utilizado como um método de rastreio para a detecção de sHLA-e em amostras biológicas.
Aumento solúvel HLA-e nos soros de pacientes com melanoma
Foram triados soros de 94 dadores saudáveis e 127 pacientes com melanoma sem terapia actual para a presença de sHLA-e (Tabela 1). Detectamos sHLA-E em amostras de soro de dadores saudáveis e de doentes tanto em uma maneira dependente da diluição (Fig. 2A), demonstrando que este ELISA, que poderiam ser utilizados para quantificar sHLA-E em amostras de soro. Considerando-se a possível ocorrência da idade e do género, não há diferenças significativas nos níveis de sHLA-E foi observada (dados não mostrados). Os valores individuais de soro sHLA-E são apresentadas em dot-plot usando uma escala logarítmica (Fig. 2B) e médias, medianas e intervalos são indicados na Tabela 2.
A detecção /ilustrativa de sHLA-E utilizando diluições em série de duas amostras de soro por ELISA. B /distribuição de concentrações de HLA-E solúveis em soros de controlos saudáveis e doentes com melanoma. P-valor indica a diferença entre os dois grupos. C /percentagens de sHLA-E soros positivos (sHLA-E≥5 pg /ml) a dadores saudáveis e pacientes com melanoma. D /Distribuição das concentrações de HLA-E solúveis em soros de pacientes com melanoma em relação de estágios tumorais.
Em pacientes com melanoma, os níveis séricos de sHLA-E (mediana [variação] ) foram significativamente aumentados em comparação com os de controlos saudáveis (9 pg /ml [0-2544] vs 0 pg /ml [0-1224], respectivamente, p 0,001). Para quantificar a frequência de soros sHLA-E-positivo, tomamos um valor de corte de 5 pg /ml. Esta análise revelou que, no grupo de 94 dadores saudáveis, sHLA-E pode ser detectado no soro de 30 (31,9% do total). Em contraste, em doentes de melanoma, 68 de soros 127 (53,5% do total) continham sHLA-E (Fig. 2C). Assim, as percentagens de soros positivos foram significativamente mais elevados em pacientes com melanoma em comparação com dadores saudáveis (p 0,001). Foi então realizada análise de subgrupo considerando estágios AJCC (Comité Misto Americana do Cancro, https://www.cancerstaging.org/). Não houve relação dos níveis séricos sHLA-E foi encontrada no que diz respeito à gradação do tumor (Fig. 2D). No entanto, como mostrado na Tabela 1, os níveis de sHLA-E foram significativamente aumentados em fase III pacientes com melanoma em comparação com dadores saudáveis (p 0,0001).
Juntos, estes resultados validado um ensaio ELISA para a determinação de sHLA-E no soro humano e demonstraram que sHLA-e é significativamente aumentado nos soros de pacientes com melanoma.
produção de HLA-e solúvel por um painel diverso de linhas celulares de tumor humano
analisou-se a produção de solúvel HLA-E por 98 linhas celulares de tumores humanos estabelecidos diferentes, representam os tumores sólidos como melanomas (n = 30), carcinomas (cancros do pulmão (n = 5), colo-recto (n = 12), rim (n = 10 ), ovário (n = 3), mama (n = 11) e da próstata (3)), o cancro da tiróide (n = 1), cancro do colo do útero (n = 1), sarcomas (osteossarcomas, n = 3), gliomas (N = 2) e tumores líquidos (mesoteliomas (n = 7), mielomas (n = 7) e leucemias (n = 3)). Como mostrado nas Figuras 3A e 3B (em branco), sHLA-E foi detectado nos sobrenadantes das linhas celulares tumorais derivadas de todas as origens testadas, exceto no sobrenadante de tumor de ovário, mieloma, leucemia e linhas de células de glioma (Fig. 3 e dados não mostrados). Nas nossas condições de cultura (500 000 células, em 3 ml, durante 48 h), os níveis de sHLA-E produzidas naturalmente por linhas celulares tumorais foram variando desde 5 a 400 pg /ml. Maiores produções foram detectadas entre melanoma, colorretal e de tumor renal linhas celulares. A análise das linhas de células tumorais capazes de produzir sHLA-E (tendo um valor de corte de 5 pg /ml) de frequência revelou que aproximadamente um terço das linhas celulares tumorais produzidos sHLA-E (24,5%, 24 dos 98) com percentagens mais elevadas obtidas no melanoma (40%, 12 dos 30) e carcinoma de células renais (40%, 4 out of 10) (Fig. 3C).
análise das concentrações de HLA-e solúveis em sobrenadantes de linhas celulares de tumores tratados ou não por IFN-γ em relação de origem do tumor:. a distribuição das concentrações individuais (a), os níveis médios (B) e as percentagens de sobrenadantes positivos (sHLA-E≥5 pg /mL) (C)
regulação selectiva da produção sHLA-e por citocinas
Temos demonstrado anteriormente que a IFN-γ aumentou a expressão de superfície de HLA-e eo desprendimento de solúvel HLA-e por células de melanoma. Para confirmar este resultado e alargar o painel de citoquinas testadas, o efeito de IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15 , IL-23, IFN-a2A, IFN-γ, TNF-α e GM-CSF após a produção de linhas de células tumorais sHLA-e foi testada. Como esperado, sHLA-E libertação foi induzido ou aumentado significativamente em sobrenadantes de células de tumor após a activação de IFN-γ (p 0,0001). A análise das linhas de células tumorais capazes de produzir sHLA-E após o tratamento com IFN-γ frequência duplicada (de 24,5% para 49%, 48 de 98) (Fig. 3C). Em menor grau, a exposição ao IFN-α e TNF-α aumentou significativamente a produção de sHLA-E através de linhas de células de tumor (p 0,001 e p 0,05, respectivamente). Estes resultados são ilustrados na Figura 4A, utilizando duas linhas de melanoma de células (M88 e M102) e uma linha celular de adenocarcinoma de cólon (HT29). Outras citocinas testadas não têm efeito sobre esta produção. A análise cinética e de dose-resposta foram realizadas experiências com IFN-γ, IFN-α e TNF-α. Como mostrado na Figura 4B, a produção sHLA-E aumentou significativamente de uma forma dependente da dose, com o efeito máximo observado com 10 ng /ml para as três citoquinas. Esta produção foi detectada tão cedo quanto 1 dia seguinte citocinas tratamento de células tumorais e foi máxima após 48 horas (Fig 4C.)
A detecção /sHLA-E em sobrenadantes de linhas celulares tumorais três:. Célula dois melanoma linhas (M88 e M102) e uma linha celular colocarcinoma (HT29), tratados ou não com IFN-α, IFN-γ ou TNF-α (10 ng /mL, 48 h). Diferenças significativas entre os valores de controlo e de tratamento estão indicadas (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001). B /sHLA-E detecção em sobrenadantes de cultura de M102 tratadas com concentrações seriadas de IFN-α, IFN-γ e TNF-α durante 48 h. Claro C /Hora da produção sHLA-E no sobrenadante da cultura de M102 tratados por até 6 dias, com 10 ng /ml de IFN-γ.
Discussão
Este estudo fornece evidências de que soro sHLA-e é aumentado significativamente em pacientes que sofrem de melanoma em comparação com indivíduos normais, independentemente da idade e sexo. Foi realizado através desta análise, utilizando-se um ELISA específico e sensível, que foi desenvolvido e validado para a determinação de níveis sHLA-E em fluidos biológicos. Neste grande estudo incluindo 221 indivíduos, observou-se concentrações elevadas de soro sHLA-E, bem como maior frequência de soros sHLA-E positivo em pacientes com melanomas em comparação com os doadores saudáveis. Considerando a classificação do tumor, enquanto os níveis de sHLA-E parecia ascender com condições avançadas até o estágio III, nós não encontrou associação significativa entre os níveis sHLA-E do soro e estágio melanoma, que podem ser causadas pela repartição desigual dos pacientes por subgrupo. No entanto, se comparado com os doadores saudáveis, os pacientes com estágio III melanoma apresentaram nível muito elevado de soro sHLA-E tanto em termos de concentração e frequência de soros positivos. Por outro lado, os pacientes com doença de estádio IV exibiram níveis inferiores de sHLA-E, que está em conformidade com a expressão espontânea fraco de HLA-E por secções de tumores metastáticos que anteriormente relatado por imuno-histoquímica [12].
Estes dados enfatizou o interesse por moléculas solúveis não-clássica HLA-I em doenças malignas. Outra HLA-I não clássica molécula, HLA-G, foi identificada em diversas doenças malignas incluindo cânceres e tem recebido muita atenção em publicações recentes. Os estudos clínicos demonstraram que os níveis sHLA-G foram significativamente elevados no soro de pacientes com melanomas malignos, gliomas, cancros da mama e do ovário, cancros de não-pequenas células-pulmão (NSCLC), leucemias linfocíticas crónicas, células B e células T não-Hodgkin linfomas [17] – [21]. Além disso, Zhu et ai. demonstraram que os níveis séricos de G-sHLA poderia ser um indicador útil em cancros colo-rectais distintivas de doenças colorrectais benignos [22]. Finalmente, os níveis sHLA-G também foram significativamente mais elevados em ascites malignas de carcinomas do ovário e da mama do que nos controles benignos [23]. Da mesma forma, níveis elevados de MHC de classe I, as glicoproteínas de superfície relacionadas com a cadeia de stress-induzível, MICA e MICB, foram correlacionadas com as fases do cancro e metástases, em vários carcinomas [24] – [26]. No seu conjunto, estes estudos revelaram congruentemente quantidades crescentes de moléculas de HLA clássicas não-I em fluidos biológicos (sangue e ascite) de pacientes que sofrem de diversos cancros.
Dado o facto de que nós e outros já anteriormente detectado sHLA-E em os sobrenadantes de melanoma e linhas celulares colorrectais por análise de transferência de Western, foram investigados, utilizando a ELISA concebido, a produção de sHLA-e através de linhas de células de tumor derivadas de grandes categorias de tumores, incluindo tumores sólidos como melanoma, cancros da mama, cólon e rins e tumores líquidos como mesotelioma e mielomas [12], [27]. Mostrámos que sHLA-E é produzido espontaneamente por 25% das linhas de células testadas (24 de 98), derivados de vários tipos de tumores humanos, em especial a partir de melanoma, cancros colo-rectais e do rim. Então, será interessante para abordar o potencial valor preditivo e prognóstico dos níveis de sHLA-E no sangue de pacientes que sofrem de estes cancros.
Temos também analisou a influência de várias citocinas sobre a produção de HLA-E por linhas celulares de tumor. De acordo com os nossos resultados anteriores sobre linhas celulares de melanoma [12], que mostraram que IFN-γ induzido ou aumentado de produção sHLA-E, que conduz à produção de sHLA-E em 50% das linhas celulares de tumores testados (48 de 98) . Além disso, a libertação de sHLA-E foi também conduzido por IFN-α e TNF-α em menor grau. Considerando-se que o IFN-γ e IFN-α são indutores elevados de HLA-I moléculas expressão, o seu impacto sobre a produção de E-sHLA provavelmente reflectem o aumento da expressão de HLA-E por células tumorais. Desde sHLA-E libertação pelas células de melanoma é principalmente dependente da matriz de metaloproteinase, efeito do TNF-α na produção de HLA-E pode ser devido à capacidade do TNF-α para promover a expressão de metaloproteinases da matriz [12], [28]. Estes resultados são consistentes com os de coupel
et ai.
Mostrando produção sHLA-E por células endoteliais após o tratamento com IFN-γ e TNF-α [29]. No entanto, em oposição ao seu estudo, não observamos qualquer efeito do tratamento com IL-1β na produção sHLA-E pelas células tumorais, provavelmente devido a uma baixa expressão do receptor da IL-1 (IL-1R1) pelas linhas celulares de tumores testados em nosso estudo. No entanto, uma vez que foi relatado que as linhas celulares tumorais, incluindo linhas celulares de melanoma, pode expressar IL-1R1, podemos postular que a IL-1β, que é conhecido por promover a expressão de metaloproteinases da matriz, poderia aumentar a produção de sHLA-E por IL células de tumor que expressam -1R1 [30], [31].
Devido ao seu efeito sobre a proliferação de células de tumor, angiogénese e as suas capacidades de imunomoduladores, IFN-α é utilizada como imunoterapia no tratamento de vários tumores sólidos , como melanoma e carcinoma renal [32]. Portanto, à medida que mostram a sua capacidade para regular positivamente sHLA-E produção de linhas de células de tumor, a terapia sistémica com IFN-α pode aumentar a produção de E-sHLA em pacientes com melanoma. Neste apoio, a terapia de IFN-α está associado com níveis séricos de G-sHLA elevados em pacientes com melanoma [33]. Além disso, tem sido relatado que a irradiação γ-regula negativamente a expressão de superfície de HLA-G1 em células de melanoma, através do aumento da clivagem proteolítica desta molécula [34]. Então, será interessante para determinar se este mecanismo é também observado com HLA-E, que passaria então a ser libertados para o microambiente do tumor e por meio deste afetam o estado imunológico local.
Independentemente do possível mecanismo de sHLA- E produção, é importante realçar como a geração de sHLA-E pelas células tumorais poderia contribuir para a fuga imunovigilância. Uma vez que a interacção de ligada à membrana de HLA-E com os receptores inibitórios CD94 /NKG2-se uma inibição induzida de respostas de células NK e T, a actividade imunossupressora de sHLA-E deve ser investigada. Em apoio de um potencial fonction imunorregulatório, coupel
et al.
Informou que sHLA-E proteger as células endoteliais da lise das células NK mediada [29]. Além disso, sHLA-G e sMICA foram mostrados para diminuir o reconhecimento imunitário e a destruição de células tumorais. sHLA-L, através da sua interacção com o inibidor de receptores ILT-2 e DIO-4, tem sido demonstrado que inibem a actividade lítica de células NK, para induzir apoptose de células T CD8
+ CTL, para afectar CD4
+ alloproliferation e prejudicar NK /DC diafonia [35] – [38]. Além disso, o MICA solúvel derivado de tumor induzida por endocitose e degradação do receptor cognato activatory NKG2-D sobre os linfócitos infiltrantes tumorais, prejudicando a sua activação [29], [39]. Em conjunto, esses dados enfatizou a importância de ligantes NKR solúveis derivadas de tumores na prestação de um microambiente do tumor favorecendo a fuga imunológico. Além disso, tem sido relatado que sHLA-G são produzidos
In vitro
como formas monoméricas e multiméricas e que sHLA-G aumenta a dimerização inibição ILT-2-mediada de aloantígenos célula T [40]. Assim, a existência de sHLA-E multímeros também deve ser investigada.
Em conclusão, o presente estudo prevê a primeira evidência de tempo de uma elevada sHLA-E nos soros de pacientes com melanoma, indicando que a HLA-E pode servir como um marcador clínico para o prognóstico ou previsão dos resultados clínicos destes cancros, especialmente no contexto de imunoterapia. Porque uma sensível sHLA-E-ELISA tem vantagens práticas para triagem em larga escala, que poderia ser adotado para uso rotineiro na imunológica acompanhamento dos melanomas e outros cancros humanos. Embora a função de derivado de tumor solúvel HLA-E continua a ser definida, podemos postular que estas moléculas poderiam reforçar a supressão imune do hospedeiro através de inibir as funções das células NK e T, e favorecer assim a sobrevivência das células tumorais. A função clinicamente relevante destas moléculas sHLA-E tem de ser cuidadosamente analisados, a fim de desenvolver estratégias de imunoterapia apropriadas
Materiais e Métodos
Os anticorpos
MEM-E /07. e MEM-e /08 mAb (Exbio, República Checa), que se liga a proteínas nativas HLA-e foram usadas para o ELISA.
Peptídeos e solúvel recombinante HLA
Os péptidos foram adquiridos a Eurogentec (Angers , França). Pureza ( 85%) foi controlada por cromatografia líquida de alta eficiência de fase inversa. proteínas recombinantes HLA diversificada e β2-microglobulina foram redobradas com peptídeos sintéticos do seguidas indicado. HLA-E * 0101 /VMAPRTLVL (HLA-A * 0201 péptido de sinal) e HLA-A * 0201 /AAGIGILTV (Melan-A
27-35) foram monómeros gerado pela instalação de proteína recombinante (IFR 26, Nantes). HLA-A * 2301 /PYLFWLAAI, HLA-B * 0702 /GILGFVFTL, HLA-B * 0801 /QAKWRLQTL e HLA-B * 2705 monômeros /HRCQAIRKK foram fornecidos pela unidade de produção tetrâmero (Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer, Lausanne, Suíça) .
pacientes e espécimes
amostras
Sera foram coletadas de pacientes com melanoma (n = 127), todos com o consentimento formal. Soros de dadores saudáveis (n = 94) foram fornecidos pelo Etablissement Français du Sang (EFS) (Nantes, França) e utilizados como controle.
Declaração de Ética
consentimentos por escrito foram obtidas de todos pacientes e doadores saudáveis. Todos estes estudos foram aprovados pelo Comitê de Ética commmitees locais “Comité de Protecção des Personnes Ouest IV-Nantes” eo “Agence Française de Sécurité Sanitaire des Produits de Sante”.
As linhas celulares de cultura
linhas de células de melanoma foram estabelecidas na Unidade de GMP de Terapia Celular e em nosso laboratório (UMR 892 Inserm /Université de Nantes, França) e pertencem à Biocollection PC-U892-NL (CHU Nantes). linhas de células de carcinoma colorretal foram adquiridas de ATCC ou estabelecido no nosso laboratório UMR 892 Inserm /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-FJ, CHU Nantes). linhas celulares de carcinoma renal foram estabelecidos em INSERM U1016 /CNRS UMR 8104, Paris, França) [41]. linhas celulares de cancro da mama foram adquiridas de ATCC ou estabelecido no nosso laboratório UMR 892 Inserm /Université de Nantes (Biocollection PC-U892-NG, CHU Nantes). linhas celulares de cancro do pulmão e mesotelioma linhas celulares foram adquiridos da ATCC ou presentes de M. Grégoire (UMR 892 Inserm /Université de Nantes, França, Biocollection PC-U892-MG, CHU Nantes). As células de mieloma linhas foram presentes de C. Pellat (UMR 892 Inserm /Université de Nantes, França, Biocollection PC-U892-MA, CHU Nantes). Ovário carcinoma, glioma, leucemia, tireóide, colo do útero e de células de câncer de próstata linhas foram foram adquiridos da ATCC e gentilmente cedido por C. Sai, F. Vallette e F. Paris (UMR 892 Inserm /Université de Nantes, França). células de osteossarcoma linhas foram adquiridas da ATCC e presentes de M. Padrines (EA3822, INSERM U957, Nantes, França). Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI ou DMEM com 10% de soro fetal de vitelo (FCS, PAA, Áustria).
sobrenadantes tumorais produção
Para sHLA-E rastreio, produção de 500 000 células tumorais foram cultivadas em placas de 6 poços em 3 ml de 10% FCS-RPMI, suplementado ou não com IFN-γ (20 ng /ml). Após 48 horas, os sobrenadantes de tumor foram recolhidas, centrifugadas 5 min a 2500 g e mantidas congeladas antes de serem testadas em ELISA
.
O impacto de outras citocinas em produção sHLA-E, inicialmente foi testado em 20 ng /ml durante 48 horas, com duas linhas de células de melanomas (M88 e M102) e uma linha celular de adenocarcinoma colo-rectal (HT29). avaliações de dose-resposta e de cinética de IFN-γ, IFN-a2A e de TNF-α foram secundariamente realizada como descrito (concentração que varia de 40 a 0,02 ng /ml, durante 1 a 6 dias), com estas três linhas celulares de tumores.
a detecção de sHLA-E por ELISA
placas Nunc-Immuno MaxiSorp de microtitulação foram revestidos (50 uL /poço) com MEM-E /08 mAb a 1 ug /ml em tampão de carbonato /bicarbonato (CO
3HNa 35 mM, CO
3Na
2 15 mM, pH 9,5) durante a noite a 4 ° C. Depois de quatro lavagens com PBS-0,05% de Tween 20 (200 /po), as placas foram saturadas com PBS contendo 10% de FCS, durante 2 h à temperatura ambiente (200 ul /poço). Após quatro lavagens, as amostras biológicas (50 ul /poço, opcionalmente diluído em tampão de saturação) foram adicionados (em triplicado) e incubaram-se durante 2 h à temperatura ambiente. Os sobrenadantes de cultura foram ensaiadas sem diluição, enquanto foram utilizados seis duplas diluições de soros. A detecção biotinilada MEM-E /07 mAb diluído em 1 ug /ml em tampão de saturação foi adicionado depois de quatro lavagens (50 ul /poço) e incubou-se novamente durante 2 h à temperatura ambiente. As placas foram lavadas quatro vezes e incubadas com reagente strepta-HRP (BD Pharmingen) diluída a 1/1000 em tampão de saturação durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, as placas foram lavadas quatro vezes e incubadas com substrato (3,3 ‘, 5,5’-tetrametilbenzidina líquido, Sigma, ST Qentin Fallavier, França) durante 30 min à temperatura ambiente no escuro (100 ul /poço). A reacção foi parada por adição de 100 uL /poço de 1 H H
3PO
4. A absorvância foi medida a 450 nm com um Multiskan EX Thermo Scientific. Análise da curva padrão e a interpolação das concentrações de amostras foram realizadas utilizando software Prism 5 (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA).
A análise estatística
Os soros de pacientes com cancro foram comparados com soros de dadores saudáveis. De acordo com a distribuição não-paramétrica dos níveis séricos sHLA-E, os dados foram apresentados como médias, medianas, fogões e percentagens de soros sHLA-E positivo. Para a comparação dos dois grupos gerais, a análise estatística foi realizada pelo teste U de Mann- Whitney. Distribuição das concentrações pelo palco foi avaliada por meio do teste de Kruskal-Wallis. Para comparar a frequência de soros sHLA-E positivo, foi utilizado o teste de Fisher. Análise estatística do efeito modulatório de citocinas na produção sHLA-E através de linhas celulares de tumor foi realizada por ANOVA de uma via e seguido por teste post hoc de Bonferroni. Um valor de P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando Prism 5 Software (GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, EUA).
Reconhecimentos
Agradecemos Pr Marie-Françoise Avril (APHP, Hôpital Cochin, serviço de Dermatologia, Paris, França) para fornecer amostras de sangue de melanoma. Os autores também agradecem Philippe Guillaume das instalações de produção tetrâmero do Instituto Ludwig de Pesquisa sobre o Câncer (Lausanne, Suíça) para a produção de monômeros HLA.