Abstract

Background

células-tronco cancerosas (CSCs) são pensados ​​para ser responsável para a regeneração do tumor após a quimioterapia, embora a confirmação direta desta permanece próxima. Por isso, investigou se o tratamento medicamentoso poderia enriquecer e manter CSCs e se as altas habilidades tumorogénicos e metastáticos de CSCs foram baseados em sua capacidade marcada para produzir fatores de crescimento e angiogênicos e expressar os seus receptores cognatos para estimular a proliferação de células tumorais e formação de estroma.

Metodologia /Apreciação

o tratamento de células de tumor de pulmão com doxorrubicina, cisplatina, etoposido ou resultou na selecção de células sobreviventes de drogas (DSCs). Estas células expressaram CD133, CD117, SSEA-3, TRA1-81, Oct-4, e β-catenina nuclear e perda de expressão de marcadores de diferenciação do citoqueratinas 8/18 (CK 8/18). DSCs foram capazes de crescer como esferas de tumor, manter a capacidade de auto-renovação, e diferenciar. progenitores diferenciadas perderam expressão de CD133, ganhou CK 8/18 e adquiriu sensibilidade de drogas. Na presença de drogas, a diferenciação de DSC foi revogada permitir a propagação de células com características de CSC-like. Lung DSCs demonstrou alta tumorogénicos e potencial metastático após a inoculação em camundongos SCID, que apoiaram a sua classificação como CSCs. Luminex análise de citocinas humanas e de murídeo em lisados ​​de sonicados de tumores parental- e CSC-derivados revelou que os tumores contidos de duas a três vezes mais elevados níveis de factores angiogénicos e crescimento humano (VEGF, bFGF, IL-6, IL-CSC-derivado 8, HGF, PDGF-BB, G-CSF, e SCGF-β). CSCs também apresentaram níveis elevados de expressão de VEGFR2 humana, FGFR2, CXCR1, 2 e 4 receptores. Além disso, CSCs humanos que crescem em ratinhos SCID estimulado estroma murino para produzir níveis elevados de fatores angiogênicos e crescimento.

Conclusões /Significado

Estas descobertas sugerem que a quimioterapia pode levar à propagação de CSCs e prevenção de a sua diferenciação. Os altos potenciais tumorigênicos e metastáticos de CSCs são associados com a produção de citocinas rede eficiente que pode representar um alvo para o aumento da eficácia da terapia do cancro

Citation:. Levina V, Marrangoni AM, DeMarco R, Gorelik E, Lokshin AE ( 2008) Medicamentos selecionados Câncer de pulmão Humano Stem Cells: citocinas Rede, Oncogenia e propriedades metastático. PLoS ONE 3 (8): e3077. doi: 10.1371 /journal.pone.0003077

editor: Nils Cordes, da Universidade de Tecnologia de Dresden, Alemanha |

Recebido: 25 de maio de 2008; Aceito: 08 de agosto de 2008; Publicado: 27 Agosto 2008 |

Direitos de autor: © 2008 Levina et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Estes estudos foram apoiados por bolsas de RO1 CA098642, R01 CA108990, Avon (NIH /NCI), Susan Komen Foundation (AEL) e DOD BC051720 concessão, doações de Harry Lloyd Charitable Trust, Fundação Hillman e Pensilvânia Departamento de Saúde (EG).

CONFLITO dE iNTERESSES:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

nos últimos anos, tem sido gerado evidência experimental substancial em apoio ao papel de uma pequena população de auto-renovação de células que poderiam sustentar o crescimento maligno [1], [2]. Esta população foi denominado células iniciadoras de cancro ou células-tronco cancerosas (CSCs) por sua alta capacidade de auto-renovação, diferenciação multilinhagens e níveis superiores de malignidade. CSCs foram identificados e isolados em várias condições malignas, incluindo da mama, do cérebro, da próstata, pancreático, do pulmão, e cancro do cólon [3] – [11]

CSCs foram identificadas utilizando células baseado em citometria de fluxo e classificação NOD. /SCID xeno. CSCs expressam marcadores de superfície celular de tecidos específicos: por exemplo, CSCs mama expressam CD44 + /CD24

baixo [3], e do cérebro, próstata, pulmão e CSCs pancreáticas expressam CD133 + [2], [4], [7], [8 ], [10].

baseada em citometria de fluxo de células-triagem que permite o isolamento de um “side population” (SP) com a actividade das células de haste do cancro enriquecido foi descrito por Goodell et al [12]. células SP são caracterizados por baixa de corante Hoechst 33342 coloração distinta, atribuído à expressão de ABCG2, um transportador de cassete de ligação de ATF (ABC) [13]. células SP também demonstrar uma maior capacidade tumorigénica de células não-SP [13] – [15]. [18], permitir o isolamento de uma população de células enriquecidas em progenitoras iniciais /Células estaminais – métodos de triagem CSCs, utilizando marcadores específicos do tecido CSC, bem como a formação de aglomerados esféricos de células auto-replicantes [16] citometria de fluxo baseada- .

Devido à sua alta resistência à droga e tumorigenicidade, CSCs são pensados ​​para ser responsável para a regeneração do tumor após a quimioterapia [19], [20], embora a confirmação direta de este ainda é próxima. Por conseguinte, a hipótese de que os CSCs pode ser enriquecido e subsequentemente isolado a partir de populações de células tumorais a seguir ao tratamento de droga.

No presente estudo fármaco células (DSCs) sobreviventes foram isoladas a partir de linhas celulares de cancro humanas tratadas com cisplatina, doxorubicina, ou etoposido . Isoladas DSCs exibiram altas capacidades clonog�icas, o enriquecimento com células SP, expressão da superfície celular CSC e marcadores de células-tronco embrionárias, uma capacidade de auto-renovação, a geração de progênie diferenciada e elevado potencial tumorigénico após transplante de ratos SCID. Concluiu-se que estes eram DSC CSCs.

Também tem sido sugerido que os CSCs têm elevado potencial metastático [21]. Recentemente, foi demonstrada a relação entre os CSCs pancreáticas e metástase do tumor [8]. Nós demonstramos que drogas isolado CSCs pulmão apresentam um elevado potencial metastático.

Ele continua a não ser claro que propriedades de CSCs conferir um aumento de tumorigenicidade e potencial metastático. Colocámos a hipótese de que as capacidades tumorigénicas e metastáticos de CSCs foram com base na sua capacidade acentuada para produzir crescimento e angiogénicos factores que estimulam a proliferação de células de tumor, assim como promover a formação do sistema vascular do tumor, de modo a fornecer oxigénio e nutrientes para o crescimento local do tumor ou crescimento distante após a divulgação das células tumorais em diferentes localizações anatômicas. Assim, a produção altamente eficiente de crescimento e factores angiogénicos é uma propriedade fundamental das células de iniciação do tumor. O VEGF é um factor angiogénico potente [22], enquanto que os factores de crescimento, tais como bFGF, EGF e HGF pode estimular a proliferação de células não tumorais, mas também apenas as células endoteliais e os efeitos pró-angiogénico e anti-apoptóticos assim manifestos [23]. Alguns dados indicam que as quimiocinas, tais como IL-8 (CXCL8), MCP-1 (CCL2), e RANTES (CCL5), não apenas estimular a migração, mas também a proliferação de células tumorais e do estroma, incluindo células endoteliais [24]. Recentemente foi demonstrado que a IL-8 exibe uma forte actividade angiogénica através de transactivação de receptor de VEGF 2 (VEGFR2) [25]. Assim, diferentes tipos de factores tumorais produzir (citocinas, quimiocinas, factores angiogénicos e crescimento) ter funções sobrepostas na promoção do crescimento do tumor. Numerosos dados experimentais e clínicos indicam que a neutralização de crescimento ou factores angiogénicos, ou bloqueando a sinalização do receptor, poderia inibir o crescimento tumoral, confirmando a importância destes factores na proliferação de células de tumor [26]. Assim, a produção de crescimento e de factores angiogénicos pelas CSCs parece crucial para os seus potenciais tumorigênicos e metastáticos. No entanto, essa citocina CSC e crescimento da rede fator /angiogênico não tinha sido previamente investigado.

Portanto, no presente estudo, foi realizada uma análise abrangente de várias citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento produzidos por células tumorais H460 parentais e CSCs isolados utilizando a tecnologia xMAP multiplex (Luminex Corp, Austin, TX), que permite a análise simultânea de vários factores solúveis. Esta análise foi realizada

in vitro

em células cultivadas e

in vivo

utilizando o modelo de xenoenxerto de tumor humano em ratinhos SCID. tumores humanos em crescimento em ratinhos SCID são constituídos por células de tumores humanos e de estroma murino. extractos sonicados de tumores humanos xenoenxertados continha citoquinas produzidos por células de tumores humanos, bem como por células de estroma murino. As concentrações de cada tipo de citocinas pode ser analisada utilizando kits de multiplex desenvolvidos especificamente para a detecção de citocinas humanas ou de murino. Isso poderia fornecer informações sobre a rede de citocina produzida pelos CSCs e sua capacidade de estimular a formação de estroma.

Os nossos estudos demonstram que as células tumorais droga sobrevivente pulmão têm as características de CSCs e produzir níveis elevados de várias citocinas, quimiocinas, de crescimento e factores angiogénicos e seus receptores. Essas descobertas trazem uma nova visão para a nossa compreensão dos mecanismos responsáveis ​​pelo elevado potencial tumorigénico e metastático de CSCs pulmão e sua capacidade de sobreviver quimioterapia.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

linhas de células de cancro humanas cultivadas, OVCAR-3 (ovário), MCF-7 (mama), e H460 (pulmonar), foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, EUA). As células foram cultivadas em meio de cultura, tal como recomendado pela ATCC, suplementado com FBS a 20% (Millipore Inc., Billerica, MA).

Reagentes

cisplatina, doxorrubicina, etoposido, e Hoechst 33342 eram a partir de Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). anticorpos fluorocromo-conjugados contra CD24 humano, CD34, CD44, CD24, CD117, CD90, VLA-4, VLA-5 e eram da Beckman Coulter (Fullerton, CA). Os anticorpos contra FGFR2, VEGFR1, VEGFR2, e CXCR1, 2, 4 eram de R .; D Systems Inc. (Minneapolis, MN). O anticorpo contra VLA-6 foi obtido a partir de AbD Serotec (Raleigh, Nova Iorque). Os anticorpos contra CD 133 e citoqueratinas 8/18 eram de Abcam Inc. (Abcam, Cambridge, MA). Alexa-488 Fluor® rato anti-humano conjugado com TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-1-4, e o anticorpo contra β-catenina humana foram adquiridos a BD Biosciences Inc. (San Diego, CA). O anticorpo contra o fósforo-β-catenina foi de Cell Signaling Technology Inc. (Beverly, MA). Um kit de amostra marcador estaminais embrionárias (ES), concebidos para a detecção de SSEA-1, 3, 4, TRA-1-60, TRA-1-81, e Oct-4, foi obtido da Chemicon International (Tamecula, CA). Alexa 488-faloidina Fluor® e Abs secundário conjugado com Alexa 488, 546, e 680 eram de Molecular Probes (Invitrogen, Carlsbad, CA).

ensaios clonogénicos

As células foram plaqueadas a uma densidade de 10-50 células /cm

2 em 100 milímetros

2 ou placas de Petri a uma densidade de 0,5 células /poço em placas de 96 poços, e cultivadas durante 14 dias. Para contagem de colônias, as células foram fixadas e coradas com Coomassie azul brilhante.

A citometria de fluxo análise

Para população lado análise (SP) de células que usamos protocolo padrão [12]. Para inibir ABCG2 transportador, 10 uM fumitremorgin C (Calbiochem /EMD Biosciences, Inc., San Diego, CA) foram adicionados 10 min antes da adição da Hoechst. Em algumas experiências, o verapamil (50 umol /L), adicionou-se corante para confirmar a SP (dados não mostrados). As células foram analisadas usando um citómetro MoFlo (Cytomation, Fort Collins, CO). Excitação de corante Hoechst foi realizada utilizando um laser de UV a 364 nm para 351; a fluorescência foi medida com um filtro de 515 nm população lateral (Hoechst azul) e um filtro óptico 608 EFLP (Hoechst vermelho). ganhos do instrumento foram ajustadas para definir a coorte célula principal, o qual compreende a maior parte das células que contêm uma cópia de ADN no centro das parcelas. células CD133 + foram classificadas de câncer de pulmão parental população H460 usando MoFlo citômetro e protocolo padrão para coloração de imunofluorescência.

procedimento de coloração celular para Cellomics ArrayScan de imagem automatizado

As células foram fluorescente coradas como descrito [27]. Resumidamente, as células foram cultivadas em placas de 96 poços, lavou-se com tampão FACS, incubadas com anticorpos contra CD24, CD34, VLA-4, VLA-5, VLA-6, CD44, CD87, CD90, CD117, FGFR2, VEGFR1 e VEGFR2 conjugadas com FITC, PE, ou PC5, durante 1 h, fixadas em 2% de PFA durante 20 min, lavadas em PBS e coradas com Hoechst 33342. para testar CD133, CXCR1, CXCR2 e expressão de CXCR4, as células foram incubadas com anticorpos primários e respectivos em seguida, com anticorpos secundários conjugados com Alexa 488, 546, 680 ou fluorocromos (Molecular Probes /Invitrogen) durante 1 h. As células foram então coradas com Hoechst 33342.

Para detectar proteínas intracelulares, as células foram fixadas, permeabilazed, e incubados com anticorpos primários contra células estaminais embrionárias, marcadores β-catenina, e citoqueratinas 18/08 durante 1 h e com Os anticorpos secundários conjugados com Alexa 488, 546, 680 ou fluorocromos (Molecular Probes /Invitrogen) durante 1 h. Coloração para actina do citoesqueleto, as células foram incubadas com Alexa Fluor 488 Faloidina durante 1 h. os núcleos das células foram então coradas com Hoechst 33342 a 2 ug /ml durante 20 min para identificar células individuais e para optimizar concentrando

para corar esferas tumorais, todas as manipulações foram feitas sob o controlo microscópico:. esferas de tumor foram suavemente colocados em poços individuais de ultra baixa aderente placas de 96 poços, e incubação com anticorpos primários e secundários foi o mesmo como descrito acima para as culturas aderentes.

Todos os procedimentos de incubação e de fixação foram realizados à temperatura ambiente.

Cellomics ArrayScan automatizado de imagem

O Cellomics ArrayScan HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, PA) foi utilizado para recolher informações sobre a distribuição de componentes de marcação fluorescente nas células coradas. O sistema ArrayScan HCS verifica vários campos nos poços individuais, aquisição e análise de cada uma das imagens de células de acordo com os algoritmos definidos. O scanner está equipado com filtros de emissão e de excitação (XF93, Omega Optical, Brattleboro, VT, EUA) para geração de imagens seletivamente sinais fluorescentes. Os dados foram capturados, extraídos e analisados ​​com ArrayScan II Aquisição de Dados e Data Viewer versão 3.0 (Cellomics), Quattro Pro versão 10.0.0 (Corel, Ottawa, Ontário, Canadá) e MS Excel 2002 (Microsoft, Redmond, WA).

Cultura de esferas de câncer de pulmão

crescimento de suspensão foi avaliada em meio metil-base de celulose (com base-MC), como descrito [16], [17]. Resumidamente, H460 e células droga seleccionada foram ressuspensos em 0,8% de meio isento de soro à base de MC (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canadá) suplementado com 20 ng /ml de EGF (BD Biosciences), bFGF, e 4 ug /ml de insulina (Sigma ) e plaqueadas a 500-10000 células /mL em ultra-baixa aderentes 24-96 placas de poços (Corning, Corning, NY). EGF, bFGF (20 ng /mL), e insulina (4 ug /mL) foram adicionados a cada segundo dia, durante duas semanas. O meio foi substituído ou suplementado com factores de crescimento frescos duas vezes por semana. A fim de avaliar o potencial de auto-renovação das células, as esferas foram recolhidas por centrifugação suave, dissociados em suspensões de células individuais, filtrada e cultivados sob as condições descritas acima.

Diferenciação

a partir de células dissociadas esferas (de terceira geração) foram plaqueadas a 1 x 10

4 células /mL em placas de 96 poços pré-revestidas com colagénio IV (BD Biosciences) em meio de cultura suplementado com FBS a 10% sem factores de crescimento e transferidas para novas placas quando as culturas atingiram confluência. Para testar o potencial de auto-renovação de células diferenciadas, células foram transferidas para meio isento de soro semi-sólido suplementado com EGF, FGF, e insulina e a sua capacidade para formar esferas de tumor foi avaliada tal como descrito acima. Para realizar a caracterização fenotipica de células de esferas e as células depois da diferenciação, as células foram semeadas em placas de 96 poços (5 x 10

3 células /poço) e coradas com vários anticorpos, tal como descrito acima.

resistência à quimioterapia Estudos

células parentais

H460, células obtidas a partir de esferas de cancro do pulmão, e três semanas após as células CCC de diferenciação foram plaqueadas em placas de 96 poços pré-revestidas com colagénio IV (BD Biosciences) e cultivadas em RPMI 1640 suplementado com 10% FBS. Após 24 horas de doxorrubicina e cisplatina foram adicionados às concentrações finais (0,016-025 ug /ml e 0.165-3.30 ig /ml, respectivamente). Depois de 72 h de tratamento, as células foram coradas com Hoechst 33342, e o número de células por poço foram contadas com Cellomics matriz de digitalização VTI (Cellomics /ThermoFisher, Pittsburgh, PA), como descrito [27].

Migração e ensaio de invasão

a actividade de migração e a invasão de células tumorais em resposta a recombinante humano de IL-8 (100 ng /ml) foi medido em Matrigel BD BioCoat invasão secções (BD Biosciences, San Jose, CA) de acordo com a protocolo do fabricante.

Análise das propriedades tumorigénicas e metastáticos de DSCs e células tumorais H460

os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações fornecidas pelo Comitê da Universidade de Pittsburgh Institutional animal Care e Uso (IACUC) e o Instituto Nacional de Saúde Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório. SCID, 7-8 semanas de idade (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME), foram mantidos no biotério da Universidade de Pittsburgh Cancer Institute (UPCI).

Para comparar as propriedades tumorigénicas, H460 células e DSCs foram colhidas e injectadas (em 200 ul de PBS) por via subcutânea (sc) em ratinhos SCID em concentrações de 5 × 10

3-5 × 10

5 células por rato (5 ratos por grupo) sem Matrigel. Os tumores foram medidos duas vezes por semana. Os ratinhos foram sacrificados quando os seus tumores medido cerca de 2 cm de diâmetro.

Para analisar a capacidade das células H460 e CSCs para formar metástases, 5 × 10

4 células foram inoculadas por via intravenosa (iv) na veia da cauda de ratinhos SCID. Os murganhos SCID foram T, B e células NKT-deficientes, mas tinha células NK activas que poderiam eliminar células tumorais humanas que circulam na corrente sanguínea. Para destruir as células NK, os ratos SCID foram inoculados por via intraperitoneal (i.p.) com 0,2 ml de anti-asialo GM1 IgG (diluída 1:20) 24 h antes i.v. inoculação das células tumorais [28]. Após 60 dias, os ratinhos foram sacrificados; pulmões, fígados e rins foram removidos e fixados em solução de Bouin o; e nódulos metastáticos foram contadas sob um microscópio de dissecação.

Preparação de extractos de tumores

Os tumores cresceram s.c. em ratinhos SCID foram removidas e congeladas em nitrogênio líquido. tecidos tumorais congelados foram cortados, sonicada durante 20 segundos, e centrifugado a 15.000 g durante 10 min para remover os detritos celulares. extractos de tumores foram armazenadas a -80 ° C.

análise multiplex de citocinas

Análise de citocinas e factores de crescimento em meio de cultura celular e em lisados ​​tumorais sonicadas foi realizada utilizando multiplexagem tecnologia xMAP humana (Luminex Corp., Austin, TX). kits multiplex para a detecção de 49 citocinas humanas: IL-1, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12p40, IL -13, IL-15, IL-17, GM-CSF, IFN-α, TNFa, MCP-1, MCP-2, MCP-3, IP-10, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, VEGF, bFGF , G-CSF, eotaxina, HGF, MIG, GROa, sIL-2R, sVCAM-1, CTACK, LIF, M-CSF, NGF, PDGF-BB SCF, SCGF-β, SDF-1α, β TNF, IFN-TRAIL γ, EGF, TNFRI, TNFRII, DR5, IL-1Rα, e o sIL-6R foram adquiridos de Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA). kit de multiplex para a detecção do SFAS, sFasL, TGFa, fractalcina, por sCD40L, TRAP, CS154, MIF, sVCAM-1, sICAM-1, MPO, A adiponectina, MMP-9, e tPAI-1 foram adquiridos a LINCO /Millipore (St. Louise, MO). O kit para a detecção de MMP-2 e MMP-3 foi adquirido a R D Investigação (Minneapolis, MN). O kit multiplex para detecção do cancro antigénios CEA, CA-125, CA 19-9, CA 15-3, CA72-4, AFP, bem como mesotelina, IGFBP-1, a calicreína 10, EGFR, ErbB2, e 21-1 foram Cyfra feitos sob medida no Centro de UPCI Luminex Núcleo (www.upci.upmc.edu/facilities/luminex). citocinas de ratinho foram analisados ​​utilizando o kit de 19-Plex para IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, IL-17, IFN-γ, MIG, GM-CSF, MIP-1α, IL-12p40 /p70, KC, TNFa, MCP-1, VEGF, bFGF e (Invitrogen /Biosource). As análises dos sobrenadantes tumorais e extractos sonicados de tumor foram realizadas em 96 poços de micro formato de placas de acordo com os protocolos dos fabricantes, como descrito anteriormente [29]. Peças de extractos de tumores foram usadas para análise de proteínas. Os dados foram apresentados como média ± SD pg /mg de proteína.

A análise estatística

Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes. As comparações entre os valores foram realizadas utilizando um teste t de Student de duas caudas. Para a comparação de múltiplos grupos, foi aplicado um teste ANOVA de uma ou de duas vias. A análise estatística dos nódulos metastáticos foi utilizado o teste de Mann-Whithey. Para todas as análises estatísticas, o nível de significância foi estabelecido em uma probabilidade de . 0,05

Resultados

Isolamento de CSCs com base na sua resistência aos medicamentos quimioterapêuticos

OVCAR ovário -3, da mama MCF-7, e cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) H460 células foram tratadas com cisplatina (1-5? M), etoposido (1-5? M), ou doxorrubicina (,067-0,125 ug /ml) durante 3 dias. A grande maioria das células morreu. Ao longo dos próximos 7 dias algumas células sobreviventes se assemelhava células senescentes com alargada e achatada morfologia [30]. Estas células senescentes “” crescia em tamanho e morreu durante semanas 2-4. Durante a primeira semana após o tratamento de drogas, pequeno, redondo, ou células fusiformes com menor adesão foram detectados, e as suas colónias crescem gradualmente substituíram as células senescentes “” em populações de células de câncer tratados com o fármaco (Figura 1A). Partimos do pressuposto de que a droga sobreviver pequenas células foram CSCs. Para verificar isso, as células expandidas sobreviver a medicamentos (DSCs) foram analisadas quanto à sua capacidade de clonogênica, SP fenótipo, marcadores CSC, a capacidade de auto-renovação, capacidade de diferenciar e potencial tumorigénico e metastático.

A , Morfologia de MCF7 parental, células e fármaco OVCAR3 e células H460 (DSCs) sobreviveram

MCF-7 e células H460 foram tratados com doxorrubicina (0,125 ug /mL).; células OVCAR-3 foram tratados com cisplatina (3,3 ug /ml). Após 48 h as drogas foram removidos e as células sobreviventes-drogas (DSCs) foram cultivadas durante 3-4 semanas.

B, aumento da formação de colónias por DSC isoladas de MCF7 parental (mama), H460 (pulmão) e OVCAR-3 (ovário) linhas celulares de cancro.

As células foram semeadas a 0,5 células /por cavidade em placas de 96 poços com meio de cultura suplementado com 10% de FBS e as células foram cultivadas durante duas semanas. Calculou-se a percentagem de formação de colónia. *** – P 0,001.

C, Análise da população lateral (SP) em DSCs e MCF7 parental, OVCAR-3 e linhas de células H460

. As células tumorais foram coradas com 5 ug /ml Hoechst33342 (HO). Algumas células foram pré-tratadas com 10? M fumitremorgin C (FTC) durante 10 min antes da adição da Hoechst (HO + FTC). As células foram ressuspensas em meio RPMI com 20% de FBS e /ml de iodeto de propídio 2 ug e classificados usando citómetro MoFlo. Os dados para as células viáveis ​​foram analisadas para correlações paramétricas e anotado usando FCS expresso.

clonogenicidade de DSCs

A capacidade clonogênica de H460 parental, OVCAR3 e MCF7 células e populações DSC foi testada tal como descrito em Materiais e Métodos. Menos de 40% das células parentais foram capazes de formar clones, enquanto a capacidade de formação de clone de DSC foi mais do que duas vezes maior (Figura 1B).

Análise do fenótipo

SP

Análise de SP fracções revelou que as linhas celulares parentais testados diferiram na proporção da fracção de SP, que varia de 0,6% em OVCAR3, 0,5% em células MCF7, a 5,2% em células H460 (Figura 1C). frações celulares SP foram substancialmente maior em populações DSC variando de 10,7% em MCF7, 15,6% no OVCAR3 para 35,3% em H460. Um distinto baixo Hoechst 33342 coloração de células SP tem sido atribuído à expressão de ABCG2, uma cassete de ligação de ATF (ABC) transportadora [13]. Para avaliar a actividade transportador ABCG2, fumitremorgin C (FTC), utilizou-se um inibidor específico ABCG2. A fração de células SP DSC diminuiu significativamente na presença de FTC (Figura 1C), confirmando assim a regulação positiva do transportador ABCG2 em DSCs.

Análise de CSCs e células-tronco embrionárias (ESC) marcadores

a matriz Cellomics digitalização HCS Reader (Cellomics /ThermoFisher) foi utilizado para geração de imagens e análise de expressão de CSCs e marcadores de células-tronco embrionárias em DSCs. Esta abordagem baseia-se numa combinação de microscopia e métodos de citometria de fluxo em um formato de 96 poços. As vantagens da abordagem incluem: 10 vezes menos células são necessárias do que para análise de citometria de fluxo, multi-espectral de fluorescência micro-imagem é automatizado, e as imagens são armazenadas, visualizadas e analisadas utilizando aplicações de software poderosas

A análise. revelou que a população de DSC a partir de células MCF-7 foram CD44 positiva com baixos níveis de expressão de CD24 (dados não apresentados), o que corresponde ao fenótipo anteriormente identificados de CSCs de mama [3]. Os controladores DSC do ovário linha OVCAR-3 expressa CD44 + e ES marcador Oct-4 (dados não mostrados).

Até à data, os CSCs pulmonares humanas são mal caracterizadas [10], [15]. Nós, portanto, centrada próximo na caracterização das propriedades CSC em DSCs de linha de células de tumor de pulmão H460. Análise de marcadores de superfície celular CD34, CD24 /CD44, CD87, e CD90 revelou nenhuma expressão diferencial entre populações parentais e DSC H460 (dados não apresentados), enquanto DSC pulmonares humanas isoladas foram enriquecidas para a CD133 + população (Figuras A, B). A seguir, analisou a expressão de marcadores de células estaminais embrionárias (ESC), antigénios podocalyxin, TRA-1-60, TRA-1-81, antigénios glicolipidos, os antigénios específicos de fase SSEA-3, 4, e do factor de transcrição Oct-4, H460 em células parentais e DSC isolado. maior expressão de TRA-1-81, SSEA-3, e Oct-4 foi encontrado em DSC isolado, em comparação com as células parentais H460 (Figura 2c, d), suportando a hipótese de que DSCs marcadores manifestos associada com CT.

H460 células e DSC, que crescem em placas de 96 poços, foram fixadas e incubadas com Abs primário contra CD133, TRA-1-81, SSEA-3, Oct-4, ou cytokeratins8 /18 e, em seguida, com Abs secundário. os núcleos das células foram coradas com Hoechst 33342. imagens celulares foram adquiridos utilizando o Cellomics ArrayScan HCS Reader (20X, 40X objectivos) e analisados ​​utilizando o BioApplication Módulo de Software Activation Target.

A, imagens de imunofluorescência de células tumorais. B, a intensidade de fluorescência (pix) da CD133 plotados contra a área objeto.

Cada ponto representa uma única célula. As células para a direita da linha vermelha são CD133 + (acima coloração de controlo de IgG).

C, imagens de células tumorais imunofluorescência células tumorais manchado por TRA-1-81, SSEA-3 e marcadores-04 de outubro

ES celulares. intensidade D. Fluorescência de TRA-1-81, SSEA-3 e Oct-4, conspiraram contra a área objeto. Cada ponto representa uma única célula. As células para a direita da linha vermelha são positivos (acima coloração de controlo de IgG). E,

Imagens de células tumorais imunofluorescência manchado por cytokeratins8 /18.

F,

A intensidade da fluorescência da cytokeratins8 /18 em células H460 (pontos pretos) e DSCs (pontos cinza) conspirou contra a área objeto

.

Os baixos níveis de citoqueratinas diferenciação marcadores (CK) expressão em DSCs

células de câncer de pulmão são conhecidos para expressar tipo I e tipo II CK18 citoqueratinas CK8, marcadores de diferenciação conhecidos nestas células [31]. Nós comparamos expressão de CK8 /18 em células H460 e DSC. Em comparação com a linha celular parental H460, DSC expressa níveis muito baixos de CK8 /CK18 (Figura 3D, E), indicando um estado de baixa diferenciação das DSC isolado.

As células foram fixadas e incubadas com Alexa 488 Fluor® phalloidin ou com Abs primária contra β-catenina e com Alexa Fluor 488 Abs secundário conjugado. células próximos foram coradas com Hoechst33342. imagens celulares foram adquiridos utilizando o Cellomics ArrayScan HCS Reader (objetiva de 20X) e analisados ​​utilizando o BioApplication Módulo de Software Análise Compartimento eo BioApplication Módulo de Software Activation Target.

A, imagens de células H460 e DSCs imunofluorescência coradas para β-catenina (A).

B,

uma intensidade média de fluorescência de β-catenina nuclear em H460 (linha preta) e DSCs (linha cinza)

.C,

uma intensidade média de fluorescência de phosphor- β-catenina celular em H460 (linha preta) e DSCs (linha cinza). D, imagens citoesqueleto das células H460 e DSCs imunofluorescência corados para phalloidin e Hoechst33342.

expressão β-catenina

proteínas de sinalização Wnt foram mostrados a desempenhar um papel no controle células-tronco auto-renovação. β-catenina é um jogador-chave na via Wnt, a transmissão de sinais de Wnt para o núcleo e desempenha um papel crucial na tumorigênese [32] – [34]. Aqui foi analisada a distribuição intracelular de β-catenina em células H460 e DSC. DSC mostrou níveis substancialmente mais elevados de β-catenina total e nuclear de células H460 parentais (Figura 3A, B), ao passo que fosforilada β-catenina estava presente a nível baixo no DSC, em comparação com as células parentais H460 (Figura 3C). Sabe-se que em células diferenciadas, em que a sinalização de Wnt está ausente, o nível de β-catenina é regulada por um multiproteico “complexo de destruição” que se liga e fosforila β-catenina, orientando-o, assim, para a ubiquitinação e degradação proteolítica [32]. Em células estaminais em que ligandos de Wnt são apresentados, este “complexo de destruição” é inibida, evitando fosforilação β-catenina e da degradação, levando a estabilização e a translocação nuclear de β-catenina [32] – [34]. Assim, os elevados níveis de acumulação nuclear de β-catenina e baixos níveis de β-catenina fosforilada sugerem a sinalização Wnt activo em DSC.

Análise da migração das células e a expressão de moléculas de adesão VLA

O nosso análise morfológica de DSCs e células H460 parentais revelaram diferenças na forma das células e propriedades de adesão, sugerindo potenciais diferenças na sua organização do citoesqueleto. Para testar esta hipótese, utilizou-Alexa 488-faloidina para visualizar a F-actina. Tal como mostrado na Figura 3D, as células H460 parentais têm uma forma redonda e uma distribuição uniforme da F-actina no citoplasma, ao passo que alguns têm DSC lamellipodial de extensão e de actina picos no bordo de ataque das células. Estes resultados sugerem que a DSC têm uma maior “fenótipo migratório” do que as células parentais H460. Nós investigamos a capacidade migratória das células H460 e DSCs usando um

in vitro

migração e invasão de ensaio utilizando a IL-8 como o quimioatrativo. Considerando que, apenas 13,7% de células H460 parentais invadidas pelo Matrigel, 87,5% de DSC eram invasivas.

moléculas de adesão, incluindo integrinas, facilitar a sobrevivência de sinalização celular e estão envolvidas na motilidade, de adesão intercelular, a quimiotaxia, e metástase [35]. Comparou-se a expressão das integrinas VLA-4, VLA-5, VLA-6 e em células H460 e DSC. Descobrimos que DSC tinham níveis significativamente mais elevados de VLA-5 e níveis mais baixos de VLA-6, em comparação com as células parentais, enquanto que os níveis de VLA-4 foram semelhantes em ambas as subpopulações (Figura 4D). Privação de adesão da célula tumoral pode desencadear apoptose. Esta forma de apoptose, induzida como um resultado da perda de adesão de células a um substrato, foi denominado anoikis. A baixa adesão dos DSCs pode diminuir sua dependência de alguns sinais de sobreviventes e levar à resistência à anoikis. células anoikis resistente apresentou maior capacidade metastática [36].