Abstract
Vários estudos recentes têm examinado a função e evolução de um homólogo de Drosophila o gene de suscetibilidade ao câncer de mama humano
BRCA2
, chamado
dmbrca2
. Nós já identificou o que parecia ser uma recente expansão na matriz BRC-repeat de ligação RAD51 no ancestral de
Drosophila Yakuba
. Neste estudo, nós examinamos os padrões de variação e evolução da
dmbrca2
matriz BRC-repeat dentro
D. Yakuba
e seus parentes próximos. Desenvolvemos um modelo de como cruzamento desigual ao longo pode ter produzido a forma expandida, mas também observamos formas reincidentes curtos, típicos de outras espécies no
D. melanogaster
grupo, segregando dentro
D. Yakuba
e
D. santomea
. Estas formas curtas não parecem ser idênticos por descendência, sugerindo que a história da
dmbrca2
no
D. melanogaster
subgrupo envolveu contracções unidade de repetição resulta em formas homoplasious. Conclui-se que a história evolutiva dos
dmbrca2
em
D. Yakuba
e talvez em outras espécies de Drosophila pode ser mais complicado do que pode ser inferida a partir de análise das sequências do genoma único publicado por espécie
Citation:. Bennett SM, Mercer JM, Noor MAF (2010) escorregamento Sliding Away: Alterações de série e homoplasia no número de repetições no
Drosophila Yakuba
homólogo de Câncer Susceptibilidade Human Gene
BRCA2
. PLoS ONE 5 (6): e11006. doi: 10.1371 /journal.pone.0011006
editor: William J. Murphy, Texas A M University, Estados Unidos da América
Recebido: 20 Abril de 2010; Aceito: 17 de maio de 2010; Publicação: 08 de junho de 2010
Direitos de autor: © 2010 Bennett et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. O financiamento foi fornecido pela National Science Foundation prêmios 0509780 e 0715484, e os Institutos Nacionais de Saúde dos prêmios GM076051 e GM086445. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a susceptibilidade genética do cancro da mama humano
BRCA2
codifica uma proteína amplamente estudada devido à sua importância no reparo do DNA [1] – [3]. Mutações da linha germinativa humana em
BRCA2
levar a um tempo de vida maior susceptibilidade para cancro da mama e cancro do ovário [4], [5], talvez resultante da reparação de ADN ineficiente de quebras de cadeia dupla (DSB) durante a recombinação homóloga [6] – [8]. Em estudos funcionais,
BRCA2
foi mostrado para regular a recombinase RAD51, um importante filamento nucleoproteína que se liga a ADN danificado, de cadeia simples no local de LAP e é crucial para o início do processo de reparação [9]. BRCA2 se liga a RAD51 pela associação com motivos de sequências, chamados de “BRC repete” [10], [11], que consistem cada um em cerca de 30 aminoácidos e são encontrados em uma região altamente conservada do
gene BRCA2
. Essas repetições conservadas têm sido úteis na identificação de
BRCA2
homólogos em muitas espécies eucarióticas, incluindo,
Arabidopsis thaliana
,
Caenorhabditis elegans
,
Drosophila melanogaster
e
Trypanosoma brucei
[12], [13]. Os pesquisadores ainda lutam para determinar como
BRCA2
coordena a sua RAD51 e atividades ssDNA vinculativas para facilitar a transferência da proteína RAD51 em DNA (mas veja [14]), mas Pellegrini e Venkitaraman [9] sugeriu que “primitivo organismos que abrigam uma versão mais simples do
BRCA2
proteína irá fornecer sistemas modelo útil “.
a putativamente mais simples
BRCA2
homólogo foi identificado no organismo modelo
Drosophila melanogaster
usando impressões digitais de seqüência representando resíduos chave para
BRCA2-RAD51
interações no locus
CG30169
, mais tarde, com o nome “
dmbrca2
” [15]. Estudos funcionais deste gene de Drosophila têm mostrado que ele interage com
D. melanogaster Rad51
(
spnA
), e sua interrupção afeta as taxas de mitose e meiose reparo do DNA e recombinação homóloga [15] – [17], levando Klovstad
et. ai.
[16] para concluir que a Drosophila
BRCA2
representa um homólogo funcional do gene que pode ser utilizado para caracterizar o seu homólogo humano. Ao contrário dos mamíferos
BRCA, 2
que tem oito repetições BRC, o
D. melanogaster
homólogo foi encontrado para conter três repetições [13]. Uma investigação posterior deste gene entre os genomas de Drosophila publicados mostraram grande variabilidade no número de repetições BRC, com
D. melanogaster
e do seu subgrupo com três repetições (Figura 1), enquanto que outras, espécies de parentesco mais distante, como
D. pseudoobscura
e
D. persimilis
tendo até onze repetições [18]. Esta variabilidade no número de repetições BRC também foi demonstrado dentro das espécies individuais bem; dez estirpes seleccionadas de
D. pseudoobscura
foram encontrados para ter sete, nove ou onze repetições BRC, talvez indicando a evolução recente dentro deste gene [18].
Esta árvore apresenta o número de “BRC”, repete a partir da sequência do genoma publicada para cada espécie do gênero Drosophila. A caixa azul destaca o grupo melanogaster, que tem um padrão de estabilidade aparente no número de repetição.
Embora haja grande variação no número de repetições em toda a filogenia de Drosophila, essa variação parece estar ausente no grupo melanogaster, em que as espécies que publicaram sequências do genoma tudo contém 3 repetições BRC. A exceção a esse padrão no grupo melanogaster é
D. Yakuba
, cujo publicada genoma seqüência de
dmbrca2
carrega cinco repetições BRC. Observação desta forma repeat alternativo levanta várias questões: é este maior número de repetição real ou um artefato genoma mis-montagem [19]? Se é real, é esta forma superior número de repetições onipresente em todos os
D. Yakuba
estirpes, ou é uma forma mais curta presentes em populações naturais? pode-se inferir a mudança histórica no número de repetições, analisando sequência de nucleotídeos? E, finalmente, se existem formas alternativas, podemos detectar evidência de seleção natural associado na propagação da grande forma repeat número? Neste estudo, nós investigamos a sequência e evolução do número de BRC repete na homólogo Drosophila de
BRCA2
em
D. Yakuba
e suas espécies irmãs
D. santomea
e colocá-lo em um contexto evolutivo. Compreender os padrões observados nestas espécies pode nos permitir conhecer melhor os processos genéticos que afectam este gene que é importante para o processo fundamental de recombinação e na saúde humana de forma mais ampla.
Materiais e Métodos
Drosophila
Acções
Drosophila Yakuba
e
D. santomea stocks
utilizados no presente estudo foram obtidas do Dr. Jerry Coyne [20]. As moscas foram conservadas em etanol absoluto até que o DNA foi extraído no nosso laboratório.
isolamento de ADN, amplificação por PCR e Sequenciação
O ADN genómico foi isolado a partir de adultos
D. Yakuba
e
D. santomea
com um único protocolo de mosca squish [21]. Primers para amplificação por PCR foram projetados desde o publicado
D. Yakuba
montagem sequência do genoma [22]. Os iniciadores concebidos a partir do
dmbrca2 e região foram utilizados para amplificar por PCR os segmentos do gene em 25 volumes de reacção uL. Os tamanhos dos produtos de PCR foram confirmados por electroforese num gel de agarose a 1%. Os produtos de PCR foram purificados utilizando ExoSAP-It (USB Corp.) e sequenciado utilizando ABI Big Dye no serviço de sequenciação Duke University IGSP. As sequências foram depositados nos bancos de dados GenBank /EMBL sob os números de adesão HM146151-HM146174.
Análise de Dados
sequências de DNA foram alinhados computacionalmente usando BioEdit 7.0.9 [23], e depois modificados por alinhamento manual . DNAsp [24] foi utilizado para estimar a diversidade de nucleotídeos (pi) e D de Tajima [25], para a
dmbrca2 e região. Foram obtidos os valores de D de Tajima para loci semelhante em
D. Yakuba
e
D. santomea
de Llopart
et. al.
[26] para comparação.
Foram examinadas as regiões sequenciadas para cada estirpe e comparou-os com a sequência montada completa desta região do publicado
D. Yakuba
genoma [22]. Na região do genoma publicada, dividimos o BRC distinta cinco repetições utilizando aminoácidos de diagnóstico e diferenças de tamanho, numeração deles numericamente 1 a 5 a partir da extremidade 5 ‘[18]. Traduzimos a sequência de DNA dos exons de sequências de nossos esforços e manualmente em relação a cada repetição indivíduo para as repetições do genoma numeradas usando o diagnóstico de aminoácidos e diferenças de tamanho.
A análise filogenética foi realizada com PAUP * 4.0b10 [27 ]. motivos de repetição BRCA2 para
D. melanogaster
(DME),
D.
sechellia (DSE),
D. simulans
(DSI),
D. erecta
(Der), e
D. Yakuba
(Dya) foram obtidos a partir dos genomas de referência Flybase, e combinado com
D. santomea
(DSA) e adicional
D. Yakuba
sequências coletados para este trabalho.
D. Yakuba
foi utilizado como um padrão para a numeração de motivos repetidos: 05/01 a partir da extremidade amino para carboxilo do péptido final.
D. persimilis
repetição 2 (Dpe2) foi utilizado como um grupo externo. Os alinhamentos de sequências foram feitas em [28] Seaview versão 4.0 com ajustes adicionais por olho. Os motivos da sequência foram delineados pela longa Pfam modelo 35 aminoácidos oculto de Markov (HMM) para repetições BRCA2 [29]. Devido ao comprimento de sequência curta e níveis modestos de variação de sequência, vizinho a se associar com p distâncias não corrigidas foi escolhido para a estimativa árvore.
Resultados e Discussão
análise filogenética Antes da publicação
D. melanogaster
sequências subgrupo de genoma para as repetições revelou dois clados principais: todas as repetições de numeração par e todas as repetições ímpares [18].
D. Yakuba
repetir 3 (Dya3) pertenciam ao clado ímpar, mas era incomum em não agrupamento com qualquer primeiro ou terceiro repete, mas em vez restante basal para ambos (ver Figura 2). O exame visual da sequências de aminoácidos e de nucleótidos revelou que a extremidade 3 ‘da Dya3 furo forte semelhança de sequência com Dme1 e Der1, enquanto que a extremidade 5’ possuía alguns aminoácidos de diagnóstico que se assemelhavam Dme3 e Der3 (Figura 3). Esta observação sugere que uma desigualdade de passagem ao longo do evento (Figura 4) pode ter ocorrido entre repeat 1 e repetir 3 dando origem a uma expansão da repetição de um ancestral de 3 BRC repete a um estado derivado de 5 repete historicamente, no
D . Yakuba
linhagem. Embora o Dya2 e Dya4 repete aglomerado filogeneticamente, o amino ácido divergência de sequência de 17% e lacuna de 18 aminoácidos na sequência do genoma publicada de Dya4 relação ao Dya2, indicam que um tal evento, se ocorreu em todos, se não ocorrer no próprio passado recente.
As sequências incluídas são derivados de
Drosophila melanogaster
(DME),
D. Yakuba
(Dya),
D.
sechellia (DSE),
D. erecta
(Der), e
D. simulans
(DSI). Dya3c e Dya3n indicam 5 ‘e 3’ regiões de repetição 3, respectivamente.
Estas traduções de aminoácidos das sequências do genoma publicados de
Drosophila melanogaster
(DMEL),
D. Yakuba
(Dya),
D.
sechellia (DSE),
D. erecta
, e
D. simulans
(DSI) estão alinhados e codificados por cores para destacar as semelhanças entre eles. D. Yakuba repeat 3 (Dya3) é dividido em duas metades que parecem grupo da seguinte forma, a 3 ‘acabar com a 1ª repete e extremidade 5’ com o 3 º repete.
o
D. Yakuba
homólogo de
dmbrca2
na sequência do genoma publicada contém 5 repetições BRC [18]; no entanto, quando visualizados os produtos da PCR amplificados desta região repetitiva em 43
D. Yakuba
e 18
D. santomea
cepas, encontramos duas bandas distintamente diferente porte. O produto maior, observada em 57 das 61 cepas, correspondeu-se com o tamanho esperado para 5 repetições BRC. Assim, a forma 5-repeat observada na sequência do genoma publicada não é fixo dentro de populações naturais. Esta variação número de repetições foi confirmada por sequenciação 11 das longas linhagens e todos os 4 das formas curtas, demonstrando que as longas formas possuía os esperados 5 repetições BRC distintas, enquanto as cepas curtas possuíam apenas 3.
Nós alinhados a previu sequências de aminoácidos, comparando-os com repetições individuais publicados genoma (e ácidos aminados especificamente que apareceram “diagnóstico” em relação ao Dya2 e Dya4), e descobriu o que parecem ser múltiplas formas curtas.
D. Yakuba
estirpe Cascade 21 e
D. santomea
estirpe LAGO 1482, ambos de 3 repetições totais, que incluem 1
st e 3
repete rd que se assemelham a plena 1
st e 5
th repetições do publicado
D . Yakuba
sequência do genoma. Sua 2
ND repetição, no entanto, começa por se assemelha a 2
ND genoma repetição baseado-na um aminoácido de diagnóstico e a presença de uma região de 18 aminoácidos específica para Dya2-mas muda a meio para se assemelhar Dya4 com base em 4 aminoácidos de diagnóstico (ver Figura 5).
D. Yakuba
estirpe Cascade 24 e
D. santomea
estirpe STO 7 também tem apenas 3 repetições, mas muito mais de seu segundo repeat se assemelha Dya4, incluindo o truncamento de 18 aminoácidos (Figura 5). Esta diferença sugere que, pelo menos, um evento de truncamento levou ao aparecimento de uma nova forma com 3 BRC repeats- e estas formas curtas podem ser independentes deleções a partir de uma longa, 5 forma de repetição.
Estas traduções de aminoácidos são de Dya2, Dya4,
D. Yakuba
estirpes Cascade24 e Cascade 21,
D. santomea
estirpes STO7 e LAGO1482, Der E DME. Os asteriscos acima do alinhamento indicam os locais que têm diferenças entre as sequências do genoma publicados Dya2 e Dya4, mas não estão fixos entre as cepas 5-repeat sequenciados de
D. Yakuba
(sugerindo que eles não são “diagnóstico”).
Esta observação de 3 formas de repetição de alelos homoplasious levanta a questão de saber se a aparente estabilidade desta forma no
D. melanogaster
grupo desmente expansões e contrações escondidos em número de repetição. Para testar esta hipótese, examinamos de perto o
dmbrca2
sequência publicada do
D. erecta
(que, infelizmente, não tem outras estirpes disponíveis para sequenciação directa). O
D. erecta Página 2
nd BRC seqüência de ácido amino repeat se assemelhava partes do
D. Yakuba
2
º e 4
th BRC repete de uma forma consistente com ele sendo derivada de uma deleção de um formulário de cinco repeat (ver Figura 5). Especificamente, carrega os 18 aminoácidos que estão presentes em Dya2 mas não Dya4, mas tem três aminoácidos de diagnóstico de Dya4 na sua extremidade 3 ‘. Assim, em contraste com a hipótese filogenética na Figura 4, o
D. erecta
forma 3-repeat pode ter surgido, secundariamente, de uma forma 5-repeat ancestral. O
dmbrca2
sequência de
D. melanogaster
também mostra um padrão potencialmente semelhante (Figura 5), mas as conclusões são mais difíceis por causa da muito maior divergência de seqüência e possíveis várias alterações evolutivas em seqüência por aminoácidos.
Para testar para a assinatura dos recursos naturais selecção no formulário 5-repeat abundante, calculamos D de Tajima no
D. Yakuba
(D = -0,68518) e
D. santomea
(D = -0,27805). Nós não fomos capazes de calcular Tajima é para a forma curta devido a sua baixa frequência entre as nossas amostras (e que alguns dos curtas alelos também não são idênticos por descendência). No entanto, foram comparados os valores D de Tajima do formulário 5-repeat para valores D publicados de Tajima de
D. Yakuba
e
D. santomea Compra de outros loci localizado semelhante em regiões de passagem reduzida ao longo [26], devido à posição de
dmbrca2
perto do telômero do cromossomo 2 e os efeitos conhecidos das taxas de recombinação baixas no espectro de frequência local [ ,,,0],30]. Os valores observados para
dmbrca2
foram bem dentro da faixa destes outros valores publicados (
D Yakuba
:.. Média = -0,34, gama -1.03-1.05;
D santomea
: média = -0,29, gama -1.27-1.03), daí que nos permite descartar pressões de seleção atípicas neste lócus
Nós concluímos que a história evolutiva dos
dmbrca2
em
D. Yakuba
, e talvez em outros melanogaster
espécies do subgrupo
Drosophila, é mais complicado do que pode ser assumida a partir do exame das únicas seqüências do genoma publicados por espécie, e nós alertam contra caracterizar espécies inteiras ou processos evolutivos de tal dados limitados (por exemplo, [13]). Nós apresentamos um modelo para uma expansão antigo em
dmbrca2
BRC número de repetições em
D. Yakuba
(ver Figura 4) e sugerem que observaram alelos mais curtos dentro
D. Yakuba
,
D. santomea
, e talvez
D. erecta Comprar e outras espécies surgiu a partir de contrações de uma forma longa ancestral, produzindo alelos homoplasious. Essas expansões e contrações seria consistente com os modelos da evolução da sequências de repetição em tandem, tais como microssatélites (por exemplo, [31]). Nossa conclusão é provisória, no entanto, uma vez que somos incapazes de avaliar o papel da possível conversão gene intragenic entre repetições (ou seja, a evolução convergente) complicar nossas inferências – esses processos são difíceis de totalmente disentangle (por exemplo, [32])
.
Embora o teste para o mecanismo preciso dos aumentos históricos propostos e diminui em BRC número de repetições está além do escopo deste artigo, argumentamos que as conclusões de população análises genéticas e filogenéticos de espécies de Drosophila [18], abordar um fenômeno interessante circundante uma característica importante de um gene pertinente para a saúde humana. Pelo menos uma repetição BRC está presente em todos os organismos em que o homólogo foi descoberto, e que parecem ser absolutamente necessário para a mediação da interacção com RAD51. Pode-se supor que a seleção natural pode favorecer o aumento do número de repetições, uma vez mais repetições permitiria mais apertado interação entre essas duas proteínas essenciais para a DNA dupla vertente de reparação break; No entanto, a selecção de alelos longos só podem estender-se até um certo ponto, uma vez que Gudmundsdottir e Ashworth [2] descobriram que sobre-expressam uma única repetição BRC em células de mamífero, na verdade, interrompe a formação de filamentos RAD51 e dissolve filamentos pré-montadas de modo a criar um fenótipo BRCA2-deficiente. A persistência de múltiplas formas mais curtas de
dmbrca2
em populações de
D. Yakuba
e
D. santomea
argumentar contra a seleção direcional forte e consistente para os alelos mais longos. Uma possibilidade intrigante para explorar é se variação no
dmbrca2
BRC número de repetições é acompanhada por mudanças no
sequência Rad51
correspondente. A prossecução da investigação dos padrões de BRC aumento da repetição e redução permitirá a uma maior iluminação de um mecanismo mal compreendida regulação susceptibilidade ao câncer, uma questão importante na medicina hoje.
Reconhecimentos
Os autores agradecem L . Bukovnik (centro IGSP seqüenciamento) para a assistência técnica, J. Coyne para as estirpes de Drosophila, VL Roth e L. Stevison para obter ajuda com figuras e C. Smukowski, S. McDermott, R. Varney, e dois revisores anônimos por comentários úteis sobre o manuscrito.