Abstract
Fundo
γ-radiação é um tratamento eficaz para o câncer. Há evidências de que a radioterapia suporta a imunidade específica do tumor. Foi descrito que a irradiação induz a síntese proteica de novo e aumenta a apresentação de antigénio, que, por conseguinte, investigado se os resultados γ-radiação na expressão aumentada de cancro do testículo-antigénios (TC) e MHC-I, permitindo assim o controlo imunológico eficiente. Isto é relevante porque a expressão de CT-antigénios e MHC-I em células tumorais é muitas vezes heterogénea. Descobrimos que as alterações induzidas por radiação γ-promover o reconhecimento imunológico do tumor, o que é ilustrado pelo aumento da infiltração de linfócitos após a radioterapia.
Métodos /Apreciação
Foi comparada a expressão de CT-antígenos e MHC-I em várias linhas celulares de cancro e biópsias frescas antes e depois
in vitro
irradiação (20 Gy). Além disso, compararam as biópsias que foram tomadas antes e após a radioterapia de pacientes com sarcoma emparelhado. Para investigar se a expressão alterada da CT-antigénios e MHC-I é específica para γ-radiação ou é parte de uma resposta de stress generalizado, analisamos o efeito de hipoxia, hipertermia e stress genotóxico na expressão de CT-antigénios e MHC EU.
In vitro
irradiação de linhas celulares de cancro e de biópsias de tumores induzidos frescas um ou expressão de novo de diferentes CT-antigénios e uma maior expressão do MHC-I num tempo e forma dependente da dose mais elevada. Mais importante, mostra-se que a irradiação de células de cancro aumenta o seu reconhecimento por células T CD8 + específicas do tumor. A análise das biópsias emparelhados tomadas a partir de uma coorte de pacientes com sarcoma antes e após a radioterapia confirmou os nossos resultados e, além disso mostrou que a irradiação resultou na maior infiltração por linfócitos. Outras formas de stress não têm um impacto sobre a expressão de antigénios ou CT-MHC-I.
Conclusões
Os nossos resultados sugerem que a radiação γ-promove o reconhecimento imunológico do tumor. Propomos, portanto, que a combinação de radioterapia com tratamentos que suportam a imunidade tumor específico pode resultar em aumento da eficácia terapêutica
Citation:. Sharma A, B Bode, Wenger RH, Lehmann K, Sartori AA, Moch H, et al. (2011) γ-Radiação Promove imunológica Reconhecimento das células cancerosas através de um aumento da expressão de Câncer-Testículo Antígenos
In Vitro
e
In Vivo
. PLoS ONE 6 (11): e28217. doi: 10.1371 /journal.pone.0028217
editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América
Recebido: 02 de maio de 2011; Aceito: 03 de novembro de 2011; Publicação: 29 de novembro de 2011
Direitos de autor: © 2011 Sharma et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto Ludwig de Pesquisa /Instituto Cancer Research Cancer (Câncer Antigen Descoberta Collaborative), Philanthropies Atlântico, o Instituto de Pesquisa do Câncer, o Liebermann Fundação Hanne, o Muller Fundação Hartmann, a Fundação Terry Fox ea Fundação Ellinger, Med Alumini University de Zurique (www.alumuni.uzh.ch). Alessandro A. Sartori é suportado pelo Vontobel-Fundação e por uma comunhão Ambizione do Swiss National Science Foundation (SNSF). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
γ radiação ou radioterapia é um dos tratamentos mais utilizados para o câncer [1]. A irradiação induz a morte das células tumorais [2], [3], mas não há evidências de que a imunidade adaptativa contribui de forma significativa para a eficácia da radioterapia [4]. Por exemplo, tumores irradiados em doentes e em ratinhos são mais frequentemente infiltrada por leucócitos do que os tumores não irradiados [5], [6], [7] e estudos muito recentes em modelos pré-clínicos demonstraram que a eficácia da radioterapia depende da presença de células T CD8 células
+ T [8]. O facto de os tumores são segmentados e controlada por CD8
+ células T é sugerida pelo aumento da incidência de tumores em pacientes imunodeprimidos [9], [10], [11] e pelo fato de que a imunidade específica do tumor pode ser detectado em pacientes com câncer [12], [13], [14], [15]. À medida que o reconhecimento de células de tumor por
células CD8 + T depende da apresentação de antigénios associados a tumores (TAA) no contexto de moléculas MHC-I, a expressão frequentemente heterogénea de TAA e /ou MHC-I num tumor tem um impacto negativo sobre a eficácia da imunidade específica do tumor. No presente estudo foi solicitado que a pergunta específica se a irradiação induz ou up-regula a expressão de um grupo proeminente de TAAs, os chamados CT-antígenos. O CT-antigénios de formar uma extensa família de antigénios que são expressos numa grande variedade de malignidades, mas estão ausentes de tecidos saudáveis excepto para os testículos e placenta [16], [17]. Os pacientes com câncer desenvolvem frequentemente respostas imunitárias espontâneas em relação CT-antígenos, o que ilustra a sua imunogenicidade [18]. Devido à sua imunogenicidade e padrão de expressão restrita, CT-antigénios são consideradas alvos promissores para a imunoterapia do cancro em pacientes [19], [20]. Observou-se que a irradiação induziu um maior ou um
de expressão Novo
de diferentes CT-antigénios, bem como um aumento da regulação da expressão de MHC-I em várias linhas de células de cancro e em fresco,
ex vivo
irradiadas biópsias de tumores. É importante ressaltar que a comparação de secções de tumor emparelhados obtidos a partir de pacientes com sarcoma antes e após a irradiação mostrou-regulada ou
de novo
expressão de MHC-I e CT-antígenos eo aumento concomitante de infiltração
+ células T CD8 , sugerindo que a irradiação mobiliza respostas imunitárias locais, específicos do tumor. Além disso, nossos resultados indicam que uma combinação de radioterapia e imunização activa com CT-antígenos relevantes pode ser uma modalidade de tratamento com maior eficácia em comparação com somente a terapia.
Materiais e Métodos
Declaração de Ética
o comitê de ética “comité de ética do cantão de Zurique”, especificamente aprovou este estudo (estudo no: EK-1017)..
Células
as linhas celulares
MDA-MB-469, MDA-MB-231 e MCF 7 (linhas celulares de cancro da mama), MCF 10A (linha de células da mama normais imortalizadas, não transformadas), Saos, LM5, 143B, HOS, HU09, e M132 (linhas de células de osteossarcoma), A549, H460, Calu1 e Calu3 (linhas celulares de cancro do pulmão), SK-MEL-37 (linha celular de melanoma) e PC3 e DU145 (linha de células de cancro da próstata) foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As linhas de células de osteossarcoma foram um presente do Dr. de Bruno Fuchs (Departamento de Ortopedia da Universidade Clínica Balgrist, Zurique). Todas as linhas celulares e biopsias foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA) contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS, Sigma-Aldrich Corp. St. Louis, MO), L-glutamina e antibióticos. PC3 e DU145 foram cultivadas em meio DMEM (Invitrogen), contendo 10% de FBS, L-glutamina e antibióticos.
células humanas primárias.
Human queratinócitos do prepúcio foram obtidos como um presente do Dr. Onur Boyman (Departamento de Dermatologia do Hospital Universitário de Zurique) e foram cultivadas em queratinócitos meio sem soro (K-SFM; Invitrogen), suplementos (EGF recombinante humana e bovina Extrato de Hipófise; Invitrogen), L-glutamina e antibióticos, como descrito [21] . fibroblastos dérmicos humanos normais (NHDF) foram obtidos a partir de PromoCell GmbH (Heidelberg, Alemanha). células endoteliais microvasculares humanas (HMEC-1) foram obtidos como um presente do Dr. Teresa Resink (Departamento de Biomedicina, Hospital Universitário de Basel) e foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Invitrogen) suplementado com 5% de FBS (Sigma-Aldrich ) e antibióticos. fibroblastos pulmonares humanas (MRC-5) foram obtidos como um presente do Dr. Giancarlo Marra (IMCR, Zurique) e foram originalmente obtidas a partir de Repositórios Coriell celulares (Camden, NJ) e cultivadas em meio MEM (Invitrogen), contendo 15% de FBS, L-glutamina e antibióticos. células ZT-821 (células renais primárias) foram estabelecidos em nosso laboratório a partir de uma suspensão de células individuais de tecido renal saudável. As células NHDF e ZT-821 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) contendo 10% de FBS (Sigma-Aldrich), L-glutamina e antibióticos.
O tratamento de células
radiação ionizante.
células e biópsias de tumores frescos foram expostos a radiação y a partir de um
60Co. As doses de irradiação utilizados são descritos em cada experiência.
hipertermia.
As células foram incubadas a 42 ° C durante 1 h ou 5 h e subsequentemente cultivadas durante 72 h a 37 ° C. As células tratadas e não-tratadas foram então processados para análise por RT-qPCR.
hipóxia.
As células foram incubadas em condições de hipoxia (1% de O
2 vol /vol) em uma estação de trabalho hipóxico (InVivoO
2-400, Ruskinn Tecnologia, Leeds, Reino Unido) para diferentes pontos de tempo (8 h, 48 h ou 72 h). As células tratadas e não-tratadas foram então processados para análise por RT-qPCR.
o stress genotóxico.
As células foram tratadas a 37 ° C com 1 ug /mL de cisplatina (Sigma-Aldrich Corp. . St. Louis, MO) durante 24 h ou com 15 fiM etopósido (Sigma-Aldrich) durante 1 hora ou com 150? M de bleomicina (Sigma-Aldrich) durante 1 h. Este ponto de tempo foi considerado como T
0. No final do tratamento, o meio foi substituído com meio de cultura fresco sem a droga. As células foram então cultivadas durante mais 72 h a 37 ° C. As culturas de controlo foram tratados sob condições experimentais semelhantes, na ausência da droga.
inibidores de pequenas moléculas de proteína-quinase.
Uma concentração de estoque de 10 mM em 100% de dimetilsulfóxido (DMSO) dos específica inibidores para a ataxia telangiectasia mutada (ATM), KU 55933 (Tocris Bioscience, Ellisville, MO) e proteína quinase subunidade catalítica dependente de ADN (DNA-PKcs), NU7441 (Tocris Bioscience) foram diluídos para uma concentração de trabalho de 10 uM em 1% DMSO. Os inibidores foram adicionados 1 h antes da irradiação, e foram deixadas em cultura durante todo o experimento. As culturas de controlo foram tratados sob condições experimentais semelhantes, na ausência de fármaco, com DMSO 1%.
biópsias de tumores
As biópsias foram obtidas a partir do Hospital Universitário de Zurique. Todos os pacientes foram submetidos a cirurgia como parte de seu tratamento padrão e assinaram o consentimento informado. O comitê de ética “comité de ética do cantão de Zurique”, especificamente aprovou este estudo (Estudo No: EK-1017). Imediatamente após a ressecção, as biópsias foram cortados em vários pedaços de 2-4 mm
3. As peças foram randomizados em dois lotes e colocados em meio de cultura. Um lote foi irradiada com uma dose única de 20 Gy, enquanto que o outro lote serviu como controlo. As peças tumorais foram cultivadas durante 72 h após
ex vivo
radiação e a expressão do gene foi determinada por análise de RT-qPCR. biópsias emparelhadas de sarcoma antes e depois da irradiação foram recolhidos para outros fins e, portanto, os pontos de tempo de coleta após a radioterapia variou entre 2-6 semanas. Os tumores foram irradiados
in vivo
com um acelerador linear e recebeu uma dose de 50-64 Gy.
extração de RNA e preparação de cDNA
O RNA total foi extraído utilizando o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) e subsequentemente foi digerido com ADNase I (Invitrogen). A concentração e a pureza foi avaliada utilizando o espectrofotômetro NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). 150 ng de ARN foi transcrito reverso usando a alta capacidade de ADNc A transcrição inversa Kit (Applied Biosciences, Foster City, CA). O ADNc foi imediatamente utilizada para reacções de RT-qPCR ou armazenado a -20 ° C até à sua utilização. Todos os kits foram usadas de acordo com as instruções do fabricante.
RT-qPCR
A expressão de CT-antigénios e MHC-I foi analisada utilizando iniciadores TaqMan e análise do gene de TaqMan Universal Master Mix 1x (Applied Biosystems) em um cycler RotoGene (Corbett Research, Sydney, NSW). A mistura de reacção (10 ul) consistiu de 1 uL de ADNc, 3,5 mL de água, 0,5 mL de iniciadores e 5 uL de TaqMan Universal Master Mix 1x. Foram utilizadas as seguintes condições de ciclos: 2 min 50 ° C, 10 min 95 ° C, 45 ciclos de 15 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C. A alteração nos níveis de CT-antigénios e expressão de MHC-I é dada como as vezes de aumento na expressão por comparação dos valores de delta-TC da tratadas com a das amostras não tratadas após a normalização para o rRNA 18S. Ct valores 38 ciclos foram interpretados de tal modo que o gene não é expresso e uma expressão de dobragem 2 foi considerado como nenhuma mudança. Cada uma das linhas celulares de cancro da mama e de osteossarcoma foram testadas em duas experiências independentes e o carcinoma do pulmão e as linhas celulares de carcinoma da próstata em um. Cada amostra foi carregada em duplicado /triplicado para cada uma das experiências de RT-qPCR.
A citometria de fluxo
As células foram coradas com marcado com PE-anti-HLA A, B, C (clone G46 -2,6, 1:100), marcado com FITC anti-β2-microglobulina (TU99 clone, 1:100) (BD Pharmingen, San Diego, CA) e iodeto de propídio (PI; Sigma). As amostras foram medidas com um FACS Calibur (BD) e analisados com software FlowJo (Treestar), após gating em células vivas (PI-negativas). foram utilizados controlos isotípicos apropriados.
Imunohistoquímica
fixado em formalina, cortes de tecidos emparelhados embebidos em parafina obtidas a partir de pacientes com sarcoma antes e depois da irradiação foram coradas com anticorpos monoclonais de rato anti-humanos contra CD4 (clone 1F6, 01:30, Zymed Laboratories Inc.), CD8 (clone C8 /114B, 1:100, DAKO S /A, Carpinteria, CA), a granzima B (clone B-Gr 7, 1:25, DAKO S /A ), MHC-I (clone C21, 1:1000, IDI Research Diagnostics, Inc.), CT7 (clone CT7-33, 1:80, DAKO S /A), CT10 (policlonal de coelho, 1:500, Proteintech Grupo, Inc.), NY-ESO-1 (clone E978, 01:50, ZYMED) e perforina (clone 5B10, 01:20, Novocastra Laboratories Ltd.). As secções foram contrastadas com hematoxilina, desidratadas e montadas. Todas as secções foram coradas quer com o sistema Ventana Referência automatizado coloração (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) usando reagentes Ventana por todo o procedimento para o NY-ESO-1, CT7, granzima B, CD4, CD8 e perforina e BondMax (Vison BioSystems , Newcastle upon Tyne, Reino Unido) para CT10 e MHC-I. UView (Ventana) ou Refinar DAB (Visão BioSystems) foram usadas como cromogénios contra os anticorpos primários. Imagens dos cortes corados foram adquiridos em Zeiss-Axiovert 200 M (Carl Zeiss Microscopia de Luz Göttingen, Gearmany) microscópio inverso utilizando sistema de imagem Carl Zeiss Axiovision CD28. As colorações foram pontuadas numa escala de 0 a 5, para a expressão do NY-ESO-1, MAGE-C1 /CT7, e MAGE-C2 /CT10 em percentagem, com base no número de células positivas que expressam o antigénio ao total número de células em um campo de alta potência (HPF) usando uma lente objectiva de 40x. A pontuação para a expressão de MHC-I foi feito com base na intensidade de coloração. Os infiltrados tumorais foram calculados como o número de células que expressam CD4, CD8 e granzima por HPF usando uma objectiva de 40x. Cada seção manchado foi avaliada em cinco regiões diferentes (por lista detalhada das pontuações ver Tabela S4). Três indivíduos realizaram o placar forma cega e independente para as colorações MHC-I e dois indivíduos realizaram o placar cegamente para as outras colorações.
Imunofluorescência
As células (10’000-20’000 células em 1 mL de meio) foram colocadas em lâminas de cultura compartimentados (BD Biosciences) para aderir durante a noite. As células foram então fixadas com 4% de paraformaldeído durante 15 min à temperatura ambiente, permeabilizadas com 0,1% de Triton X-100 (Sigma-Aldrich) durante 5 min à temperatura ambiente, seguida de bloqueamento com BSA a 10% /PBS durante 30 min à temperatura ambiente. As células foram em seguida incubadas com anticorpos monoclonais de ratinho contra o NY-ESO-1 (clone E978, 1:500, Invitrogen) ou MAGE-C1 /CT7 (clone CT7-33, 1: 500, Dako) em 10% BSA /PBS durante 1 h à temperatura ambiente, no escuro, seguido por incubação com FITC de cabra secundário marcado anticorpo de rato anti-IgG1 (Poly4053, 1:2000, BioLegend) durante 15 min à temperatura ambiente no escuro. As lâminas foram contrastadas com 4 ‘, 6’-cloridrato de diamidino-2-fenilindole (DAPI, 1:500) durante 2 minutos no escuro e inspeccionadas utilizando um Zeiss Axiovert 200-M inversa microscópio e um sistema de imagens Carl Zeiss Axiovision CD28.
Western blot análise
irradiados e células não irradiadas foram verificadas para a expressão da proteína utilizando anticorpos monoclonais de ratinho contra o NY-ESO-1 (clone E978, 1:500, Invitrogen) ou MAGE- C1 /CT7 (clone CT7-33, 1: 500, Dako) e β-actina (clone 4i374, 1:8000,
Santa Cruz Biotech
, CA). O efeito de agentes genotóxicos e a DNA-PKcs e inibição ATM, sobre a expressão do gene γ-irradiação induzida nas células foi avaliada utilizando anticorpos contra pS2056-DNA-PKcs (policlonal de coelho para fosfo-S2056 de ADN-PKcs, 1:300, Abcam Inc, MA), CPNF-D2 (clone FL17, 1:200,
Santa Cruz
Biotech, CA), pS1981-ATM (EP1890Y clone, 1:5000, Eitomics, CA) e PS15-p53 (clone 16G8, 1:1000, Cell Signaling Technology, MA). Seguido por incubação com o anticorpo secundário, de cabra policlonal anti-IgG1 de ratinho HRP (Poly4053, 1:10000, BioLegend) ou policlonal de cabra HRP anti-coelho (1:10000, Abcam). ECL reagente (Amersham, Reino Unido) foi utilizada como substrato de luminescência.
CD107a Degranulação Ensaio
O reconhecimento de células que expressam NY-ESO-1 a seguir à irradiação por específica do antigénio CD8
+ células T foi testada utilizando o ensaio de desgranulação CD107a. Três x 10
5 NY-ESO-1
157-165 /HLA-A2-specific CD8 clonado
+ (células T geradas como descrito [22]) foram incubados com 10
6 CFSE- marcado (1 uM) de HLA-A2
+ MDA-MB-469 células – que eram ou não foram irradiadas com 20 Gy de 72 h anterior – numa placa de microtitulação de fundo redondo com 96 poços num volume final de 200 ul de RPMI + 10 % de FCS e antibióticos na presença de PE-anticorpos marcados anti-CD107a (01:20, BioLegend, SD, Califórnia). Como controlo positivo, as células MDA-MB-469 foram carregadas com 10
-6 M NY-ESO-1
157-165 péptido. Dois clones independentes de células T (2A7 e 2B5) foram usados e todas as culturas foram realizadas em duplicado. A incubação foi realizada a 37 ° C durante 4 h. As células foram recolhidas e lavadas em 2 ml de tampão FACS (FB), seguido por coloração com azul-pacífico anticorpo anti-CD8 (BioLegend) em 50 mL FB durante 30 min a 4 ° C. As células foram lavadas uma vez com 2 mL FB e ressuspenso em 200 ul FB. As amostras foram medidas em ciano ADP9 (Beckman Coulter, Fl, EUA) e analisados com software FlowJo (Treestar).
Resultados
In vitro
γ radiação para cima regula a transcrição de CT-antigénios e moléculas MHC-I
da mama, osteossarcoma, pulmão e cancro da próstata e células primárias normais foram expostos a uma radiação de uma dose única de 20 Gy, após 72 horas, as células foram colhidas e analisadas para a expressão de CT-antigénios e MHC-I por RT-qPCR. A maioria destas linhas celulares de cancro expressaram níveis não detectáveis ou muito baixos de CT-antigénios sob condições de cultura padrão. Em contraste, as células irradiadas-y mostrou
de novo
ou expressão sobre-regulada de várias CT-antigénios de uma forma aleatória (Figura 1A-D). Em um painel de tipos de linhas de células cancerosas quatro, γ-radiação foi encontrada para ter o efeito mais profundo sobre as linhas celulares de cancro da mama e do osteossarcoma e o mínimo sobre as linhas de células de cancro da próstata. A sobre-regulação de MHC-I e TC-antigénios sobre γ-radiação parece ser uma característica específica de células malignas, como não foi observada em qualquer uma das células primárias normais que aqui testados (ZT-812, de prepúcio humano queratinócitos , HMEC-1, MRC-5, e NHDF MCF 10A, Figura S1A, S1B). A linha celular de melanoma SK-MEL-37 é conhecida para expressar todos os antigénios testados TC-sob condições de cultura normais e, portanto, foi incluído como controlo positivo. A irradiação de esta linha celular resultou num claro aumento da regulação de todas as CT-antigénios e MHC-I (dados não mostrados). Detectamos um aumento na expressão de CT-antigénios e MHC-I tão cedo quanto 24 h após a irradiação e, em alguns casos um aumento constante na expressão de genes foi observado até às 96 h após a irradiação. Como observamos morte celular substancial às 96 h após a irradiação, realizamos todas as futuras análises às 72 h após a irradiação. Como radioterapia pode ser administrada como uma única dose elevada (20 Gy) ou como doses fraccionadas, que irradiado linhas celulares seleccionadas (linhas celulares de cancro da mama MDA-MB-469 e MCF-7, bem como as linhas de células de osteossarcoma Saos, HOS, LM5 e 143B, com 2 Gy por dia em 10 dias consecutivos. Este protocolo resultou em mudança semelhante da CT-antigénio e de MHC-I expressão como observado com uma dose única de 20 Gy (Figura S2A, S2B). uma única dose de 20 Gy foi usado em todas as experiências adicionais.
linhas celulares de cancro estabelecidos foram expostas a irradiação com uma dose única de 20 Gy e a expressão de ARNm de CT-antigénios e MHC-I foi determinada 72 horas mais tarde por RT-qPCR. (a ) linhas celulares de cancro da mama, (B) as linhas celulares de osteosarcoma, (c) linhas de células de cancro do pulmão, (D) as linhas celulares de cancro da próstata. Todos os valores de Ct são normalizados para rRNA 18S e os dados são apresentados como as vezes de aumento da expressão em irradiado em comparação com as amostras não tratadas correspondentes. Porque expressão vezes não pode ser calculado para genes que são
de novo
expressas após irradiação, colocamos os símbolos em tais casos acima da linha horizontal fina em (a).
In vitro
γ radiação up-regula CT-antígenos e moléculas MHC-I ao nível da proteína
Para confirmar a expressão induzida por irradiação de CT-antígenos no nível da proteína, que manchou irradiados e não irradiados de MDA MB-469 células com anticorpos contra NY-ESO-1 e CT7 e analisada a expressão de CT7 e NY-ESO-1 em diferentes pontos de tempo após a irradiação por microscopia de imunofluorescência e por transferência de Western. A linha celular de melanoma SK-MEL-37 expressa constitutivamente o NY-ESO-1 e CT7 e foi utilizado como controlo positivo. Observou-se o
de novo
expressão de ambas as CT-antigénios após irradiação que aumentou com o tempo (Figura 2A, 2B), confirmando assim os dados obtidos por RT-qPCR. A irradiação da linha celular MCF10A mama normal não resultará em níveis de NY-ESO-1 ou CT7 proteína aumentou (Figura 2B). Para estudar o efeito de γ-radiação na expressão de superfície de MHC-I ao nível da proteína, que irradiado várias linhas de células de cancro (carcinoma da mama e osteossarcoma) e células primárias normais de diferentes origens, seguido por detecção flowcytometric de superfície de MHC-I , e observou-se que a irradiação resultou num aumento dependente do tempo do MHC-I à superfície expressão em diferentes linhas celulares de cancro (Figura 2C, 2D), mas não nas células primárias normais (Figura S1B).
(a) imunofluorescência de MDA-MB-469 e SK-MEL-37 células expostas a uma única dose de irradiação de 20 Gy e coradas com anticorpos contra NY-ESO-1 e CT7 em diferentes pontos de tempo após a irradiação. (B) MDA-MB-469, SK-MEL-37 e células MCF 10A linhas celulares foram expostas a uma única dose de 20 Gy e a expressão do NY-ESO-1 e CT7 foi analisada por Western blotting 72 h mais tarde. (C) o cancro da mama e (D) As linhas celulares de osteossarcoma foram expostos a irradiação única dose de 20 Gy e a expressão do HLA-ABC e β
2microglobulin foi quantificada em diferentes pontos de tempo após a irradiação por citometria de fluxo. RAD: indica γ radiação
A irradiação de células de câncer aumenta reconhecimento de células T
in vitro
A fim de determinar se a irradiação induzida pelo aumento da regulação do. CT-antigénios e os resultados do MHC-I no aumento do reconhecimento por específica do antigénio CD8
+ células T, medimos a desgranulação [23] – [24] de NY-ESO-1
157-165 /HLA-A2- + células T CD8 específicas clonado
após incubação com irradiado e não irradiado de HLA-A2
+ MDA-MB-469 células de cancro da mama. As células MDA-MB-469 são negativas para o NY-ESO-1, mas torna-se positiva, após irradiação (Figura 1A, 2A, 2B). Descobrimos que apenas irradiado MDA-MB-469 células degranulação de dois independentes NY-ESO-1
específicas de 157-165 CD8
clones de células T + (2A7, 2B5) (Figura 3) induzidos. A irradiação não aumentar ainda mais a desgranulação quando as células MDA-MB-469 carregadas com péptido, foram utilizados (dados não mostrados), indicando que nem a quantidade de MHC-I, mas a quantidade de NY-ESO-1
157-165 apresentado por MHC-I foi o factor limitante em células não irradiadas MDA-MB-469, que se encaixa no facto de a irradiação induziu
de novo
expressão do NY-ESO-1 em células MDA-MB-469 (Figura 1A, 2).
10
6 CFSE marcado com HLA-A2 + MDA-MB-469 de cancro da mama células foram irradiadas ou não com uma única dose de 20 Gy e foram incubadas 72 h, depois com 3 × 10
5 NY-ESO-1
clones de células T CD8 + A2-específico para HLA 157-165 /(clone 2A7 e o clone 2B5) na presença de PE-marcado anti-CD107a-PE durante 4 h a 37 ° C. As células foram então coradas com azul-pacífico anticorpo anti-CD8 durante 30 min a 4 ° C. As células MDA-MB-469 carregadas com péptido foram utilizados como controlo positivo. Todas as culturas foram realizadas em duplicado. A desgranulação foi medido como percentual CD107a
+ células de CD8
+ células após gating em células CFSE-negativos por citometria de fluxo.
Ex vivo
irradiação de fresco biópsias de tumores induz aumento da regulação do CT-antígenos e MHC-I
para expandir nossas descobertas ao material clinicamente relevante, foram coletadas biópsias de tumores frescos provenientes de 23 pacientes com câncer diferentes, cortar aqueles em pelo menos 50 pequenos pedaços, e randomizados em dois grupos experimentais. Nós irradiada um grupo de biópsias com 20 Gy, enquanto que os outros serviu como controlo, e analisada a expressão de CT-antigénios MHC-I e 72 h mais tarde por RT-qPCR e imuno-histoquímica. Estes resultados confirmaram os resultados obtidos com que as linhas de células de cancro, que γ-radiação frequentemente induzido um aumento da expressão de CT-antigénios e /ou MHC-I (Figura 4A, 4B, Tabela S1). Importante, nossos resultados sugerem que a expressão heterogênea de CT-antígenos e /ou MHC-I podem se tornar mais homogênea sobre a radioterapia, que, obviamente, suporta o controle imunológico do tumor.
explantes tumorais frescas de doentes de cancro diferentes (n = 23) foram irradiadas ou não com a de uma dose única de 20 Gy. O diagnóstico dos pacientes individuais é mostrado na Tabela S1 complementar. (A) Após 72 h, os explantes irradiados e de controlo foram analisados quanto à expressão do NY-ESO-1 e MHC-I por RT-qPCR. (B) As secções representativas (paciente número 9 e 20) que descrevem a expressão de NY-ESO-1 e MHC-I por imuno-histoquímica (20x). NR indica a não irradiada e RAD indica seções irradiados correspondente.
In vivo irradiação
dos resultados sarcoma humanos no aumento da expressão de TC-antígenos e MHC-I e na infiltração de linfócitos
por fim, comparou-se a expressão de CT-antigénios, MHC-I e a infiltração de linfócitos nas 15 secções de parafina-emparelhados obtidos a partir de pacientes com sarcoma antes e após a radioterapia por imuno-histoquímica. Descobrimos que a radioterapia resultou em aumento da regulação substancial ou
de novo
expressão de TC-antígenos e /ou moléculas MHC-I, que foi acompanhada por um aumento da infiltração de linfócitos e expressão granzima em 7/15 e 12 /15 amostras, respectivamente (Figura 5A-D, Tabela S2, S3).
incluídos em parafina secções de tecidos emparelhados obtidos a partir de pacientes com sarcoma (n = 15) antes e depois da irradiação foram analisados por imuno-histoquímica para (a) presença de CD8
+, CD4
+ e granzima
+ células, (B) a expressão de CT7, NY-ESO-1 e CT10 e (C) de MHC-I expressão. O CT-antigénios foram marcados como a percentagem média de células vivas que expressam o antigénio para o número total de células em cinco campos de alta potência (objectiva de 40x). A infiltração por linfócitos foi tomada como a média através da contagem do número de células que expressam CD4, CD8 e granzima em cinco campos de alta potência, e MHC-I foi pontuada com base na intensidade da coloração. (D) As secções representativas que mostram a expressão de CT-antigénios e MHC-I e a infiltração de linfócitos antes e após a radioterapia por imuno-histoquímica. É descrita são: F paciente para a expressão de CT7, Um paciente por CT10, K paciente para NY-ESO-1, D paciente para CD4 e MHC-I e E paciente para a expressão de CD8. NR indica a não irradiada e RAD indica seções irradiados correspondente. Pt: indica o número paciente. informações do paciente são listadas na Tabela S2 suplementar.
Outras formas de stress não têm impacto sobre a expressão de TC-antígenos ou MHC-I
in vitro
estresse e alterações ambientais induzir mudanças no perfil transcricional, a fim de lidar com esses ataques [25], [26], [27]. Como irradiação induz ADN-danos, nós investigamos se a expressão sobre-regulada de MHC-I e TC-antigénios também ocorrer após a exposição das linhas celulares a outros tratamentos que induzem danos no ADN tais como a cisplatina, o etoposido e a bleomicina radiomimético droga. MDA-MB-469 e células SK-MEL-37 foram tratadas separadamente com cada um dos agentes que danificam o ADN e os níveis de RNA foram monitorizados em diferentes pontos de tempo após o tratamento. Os nossos resultados mostram que nenhum destes agentes sobre-regulada a expressão de CT-antigénios e MHC-I (Figura S3B-D). No entanto, os genes da indicação PS15-p53 e CPNF-D2 foram sobre-reguladas após o tratamento, indicando que estes agentes de estresse induzido na concentração usada (Figura S3A). Além disso, testamos se outros tipos de estresse relacionada ao câncer, incluindo temperaturas elevadas ou baixos níveis de oxigênio, aumento da expressão induzida de CT-antígenos e /ou MHC-I. Descobrimos que nenhum destes tratamentos impactadas na expressão de TC-antígenos e MHC-I enquanto que o CA9 gene assinatura foi regulado para cima (Figura S4A, S4B). Juntos, estes resultados sugerem que o aumento da expressão de CT-antigénios e MHC-I por linhas celulares de cancro é uma resposta específica à radiação y e não ocorre após a exposição a outros indutores de várias vias de resposta ao estresse.
as vias de sinalização ATM e ADN-PK é dispensável para a expressão induzida por radiação γ-de CT-antigénios e MHC-I
a activação de vias de reparação do ADN-checkpoint de dano como uma resposta ao insulto genotóxico ajuda a manter o integridade genómica em células de mamíferos [28]. danos no ADN desencadeia a activação das várias cinases serina /proteína treonina, que constituem os transdutores primário na cascata de sinalização e dos quais, ataxia telangiectasia mutada (ATM) e cinases de proteínas dependentes de ADN (DNA-PKcs) são de extrema importância [29] . A proteína cinase ATM é um intermediário crítico em várias respostas celulares a radiação y e outras formas de stress [30]. Nós investigamos se, assim, a sobre-regulação de CT-antigénio e a expressão de MHC-I em resposta a radiação y depende da activação de ATM e /ou DNA-PKcs.