Abstract
Fundo
Os microRNAs (miRNAs) representam uma classe de pequenos RNAs não-codificantes que controlam a expressão de genes por segmentação ARNm e provocando quer a repressão de tradução ou a degradação de ARN. Novas evidências sugerem o envolvimento potencial de regulação alterado de miRNA na patogénese do cancro, e estes genes são pensados para funcionar como ambos os supressores tumorais e oncogenes.
Metodologia /principais conclusões
Usando microarrays microRNA , identificamos vários miRNAs aberrante expressos em tecidos de câncer e linhas de células de ovário humano.
miR-221
se destaca como um miRNA muito elevado no cancro do ovário, enquanto que
miR-21 Comprar e vários membros da
7 deixe-
família são encontrados reprimidos. bases de dados públicas foram utilizados para revelar potenciais alvos para as miARNs altamente expressos diferencialmente. A fim de identificar transcritos experimentalmente cuja estabilidade pode ser afectada pelas miARNs expressos diferencialmente, que transfectadas miARNs precursoras em linhas celulares de cancro humano e utilizadas micromatrizes de oligonucleótidos para analisar as alterações nos níveis de mRNA. Curiosamente, havia pouca sobreposição entre o previsto e as metas ou caminhos experimentais, ou entre alvos experimentais /caminhos obtidos utilizando diferentes linhas celulares, destacando a complexidade da seleção de alvos miRNA.
Conclusão /Significado
Nossos resultados identificar vários miRNAs diferencialmente expressos em câncer de ovário e identificar potenciais transcritos alvo que podem ser reguladas por esses miRNAs. Estes miRNAs e seus alvos podem ter papéis importantes na iniciação e desenvolvimento de câncer de ovário
Citation:. Dahiya N, Sherman-Baust CA, Wang T-L, Davidson B, Shih I-M, Zhang Y, et al. (2008) Expressão MicroRNA e identificação de alvos putativos miRNA em cancro do ovário. PLoS ONE 3 (6): e2436. doi: 10.1371 /journal.pone.0002436
editor: Jörg Hoheisel, Deutsches Krebsforschungszentrum, Alemanha |
Recebido: 04 de janeiro de 2008; Aceito: 06 de maio de 2008; Publicado: June 18, 2008 |
Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita
Financiamento:.. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de pesquisa Intramural do NIH, Instituto Nacional sobre Envelhecimento
Competindo interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Os microRNAs (miRNAs) são 21-23 nucleotídeos RNAs regulatórios processados 70-100 nucleótidos hairpin pré-miRNAs [1], [2]. O miARN são incorporadas num complexo ribonucleoproteico chamado complexo de silenciamento (RISC) induzido por ARN e guiar o RISC para o alvo de ARNm [3]. A ligação da miARN alvo para o ARNm 5’UTR pode regular negativamente a expressão do gene através da inibição da tradução ou aumento da degradação de ARN. Além disso, evidências recentes sugerem que miARN também pode regular positivamente a tradução sob certas circunstâncias [4]. Centenas de miARNs foram identificados em várias espécies, incluindo o
C. elegans
, os seres humanos, ea planta
Arabidopsis thaliana
. Acredita-se que miARNs mamíferos têm o potencial para regular, pelo menos, 20-30% de todos os genes humanos [5]. Cada miARN alvo pode até 200 transcritos directamente ou indirectamente, e vários miARN pode ter como alvo um dado gene [6]. Portanto, o potencial de circuito regulamentar conferida pelo miRNA é extremamente complexo. A expressão de vários pequenos RNAs tem sido mostrado para ser regulada pelo desenvolvimento e vários estudos têm demonstrado que miARN é responsável por determinar o destino celular. Estes resultados indicam que miARNs desempenhar um papel importante em processos celulares fundamentais, incluindo o tempo de desenvolvimento celular, hematopoiese, o metabolismo da gordura, organogénese, apoptose, proliferação de células, e diferenciação. Há também fortes indícios de que miRNAs estão implicados no aparecimento e progressão de muitas doenças, incluindo o cancro [3].
Comparação entre os cancros humanos e os seus homólogos normais revelaram perfis de expressão miRNA distintas. miRNAs na verdade, uma série de estudos têm relatado regulados diferencialmente em diversos tipos de cancro, como o cancro da mama [7], o cancro do pulmão [8], leucemia linfocítica crónica [9], o cancro do cólon [10], carcinomas da tiróide [11], o cancro do pâncreas [12], câncer de cabeça e pescoço [5], o câncer de próstata [13], adenomas hipofisários [14], e do ovário [15] – [18]. Colectivamente, estes estudos demonstram que alguns miARNs humanos são consistentemente desregulado no cancro humano, o que sugere um papel para estes genes na tumorigénese. Específica sobre-expressão ou a sub-expressão de certos RNAs tem sido demonstrado estar correlacionado com certos tipos de tumores [19]. miARNs sobre-expresso pode potencialmente atingir genes supressores de tumor, enquanto que, teoricamente, miARNs downregulated regular oncogenes. Por exemplo, o
let-7
miRNAs, que são regulados para baixo no cancro do pulmão, podem regular negativamente a oncogenes RAS e HMGA2, fornecendo um mecanismo para a regulação positiva desses oncogenes [8], [20], [ ,,,0],21]. Assim, os membros da
let-7 função
família biologicamente como supressores de tumor e sua perda está prevista para promover a transformação e progressão tumoral. Por outro lado, o cluster miRNA humana
miR-17-92
atua como um oncogene em linfoma de célula B [22] e câncer de pulmão [23], e pode colaborar com
myc
[22] .
assinaturas expressão única de miARN foram encontrados para ser associado com bio-moleculares e características de prognóstico de cancro do pulmão humano e leucemia linfocítica crónica [8], [24], indicando que as assinaturas de miARN pode ser utilizado para definir biológica ou características clínicas de cânceres humanos. O desenvolvimento de novos marcadores de miRNA no futuro próximo irá representar um dos principais objetivos da medicina molecular como perfis de expressão de miRNA pode classificar melhor tumores pouco diferenciados em comparação com os classificadores baseados em transcrição [19].
Há um número limitado de estudos na literatura sobre os papéis dos miRNAs em câncer de ovário. Zhang et al. alterações genômicas de alta frequência relatados envolvendo genes de miRNA em 227 o câncer, câncer de mama e melanoma espécimes ovário humano [15]. Em outro estudo, 84 (15 tecidos normais e malignos) e 69 5 linhas de células foram analisadas quanto à alteração no perfil de miARN [16]. Finalmente, um estudo de análise de 10 tumores do ovário e 10 controlos normais diferentes foi recentemente relatada [17]. Neste relatório, nós descrevemos uma série de experiências para elucidar as mudanças na expressão miRNA em câncer de ovário e para identificar possíveis alvos de miRNAs candidatos relevantes.
Resultados
miRNA padrões de expressão em tecidos ovarianos
perfis de expressão miRNA foram determinados para 34 tecidos de ovário cancerosas (Tabela 1), bem como 10 linhas celulares de cancro do ovário. Uma linha celular de epitélio de superfície do ovário humano imortalizadas foi usado como controlo não transformado. Os perfis de expressão foram determinadas usando miRCURY ™ LNA miRNA Arrays. LNAs são uma classe de análogos de nucleótidos conformacionalmente restritas que aumentam a afinidade de um oligonucleótido para o seu alvo de ARN ou ADN complementar. A matriz Exiqon miRNA é atualmente o conjunto de sonda mais abrangente disponível em uma plataforma de matriz e permite uma análise em profundidade de expressão miRNA. Após a hibridação de ARN e análise de matriz, as amostras foram agrupados de acordo com o seu perfil de miARN usando o algoritmo de agrupamento hierárquico do software JMP 6.0.0. A Figura 1A mostra a análise de agrupamento hierárquico de tecidos de tumor e linhas de células com base na expressão global miARN. Os perfis são indicados em relação a células epiteliais da superfície do ovário (células MANGUEIRA-B). As amostras são separados em três grupos principais. O cluster meio é composta inteiramente de tumores (17 amostras), enquanto o conjunto da esquerda contém 2 linhas de células de tumores primários e 7. O cluster certo é enriquecido em linhas celulares e contém 8 linhas celulares em cada 18 membros do cluster. O agrupamento hierárquico foram então repetidos com base num número muito menor de genes e incluiu apenas 70 altamente expresso diferencialmente miARN em tecidos de cancro do ovário e linhas celulares. Esta análise de agrupamento deram origem a vários grupos, mas mais uma vez, as linhas de células agrupadas em 2 grupos diferentes, enquanto os tecidos primários foram agrupados em conjunto (Figura 1B), sugerindo diferenças específicas na expressão de miARN entre tecidos de cancro do ovário e linhas celulares.
a árvore gerada pela análise de cluster de tecidos de cancro do ovário e linhas celulares baseados em (a) todos os miRNAs testados em tecidos e linhas celulares, e (B) miRNAs diferencialmente regulamentados (Dobre mudança 2.0 ou 0,5 em mais de 60 % das amostras) em tecidos e linhas celulares em comparação com as células MANGUEIRA-B de controlo normais.
Usando análise de componentes principais (PCA) que descobriram que a expressão miRNA global poderia distinguir os tumores de câncer de ovário a partir de linhas celulares de cancro do ovário (Figura 2). O controle não-tumorigénico MANGUEIRA-B também exibiu um padrão de expressão única, distinta de ambas as linhas de células e tecidos.
Bidimensional PCA mostra que os padrões de expressão miRNA globais são diferentes em linhas celulares de cancro do ovário (indicado em azul ), tecidos de cancro do ovário (indicado em verde), e as células MANGUEIRA-B não tumorigénicas (em vermelho).
diferencialmente expressos miRNAs
em seguida, miRNAs identificados que foram diferencialmente expresso entre amostras não-neoplásicas e neoplásicas (Figura 3A, Tabela 2). Somente miARNs que foram alteradas candidatos significativas, pelo menos, duas vezes em pelo menos 60% das amostras foram consideradas. Usando esses critérios rigorosos, foram identificados 25 upregulated e 31 reprimidos miRNAs entre tecidos de controle e câncer. Da mesma forma, foram identificados 5 regulada e 23 reprimidos miRNAs em linhas celulares de cancro do ovário em comparação com células MANGUEIRA-B não neoplásicas. 14 miRNAs foram desregulados em ambos os tecidos e linhas celulares e estão listados na Figura 3A. O número de miARNs que mostraram regulação baixa em amostras de tumores (n = 31), bem como em linhas celulares de cancro (n = 23) foram mais elevadas do que o número de regulada positivamente (N = 25 em tecidos de tumor, n = 5 em linhas celulares) miARNs . Isto está de acordo com estudos publicados anteriormente miRNA perfis, a maioria dos quais têm mostrado downregulation de miRNAs a ser mais comum do que a regulação positiva no cancro [8], [13], [19], [25], [26].
(A) O diagrama de Venn mostra os miARNs Número diferencialmente expressos em linhas de células de ovário, em tecidos de cancro do ovário e em ambos. Para cada categoria, os miARNs elevada (indicados a vermelho) e regulados negativamente (indicado em verde) estão indicados a seguir o diagrama. (B) O diagrama de Venn mostra o número de miRNAs diferencialmente expressos identificados no estudo atual e o número de miRNAs identificados em 3 estudos de câncer de ovário anteriores. Os miRNAs em comum são indicados a seguir o diagrama e código de cores (vermelho: elevação; verde: diminuição)
miR-221
foi o miRNA mais altamente elevado. em ambos os tecidos e linhas de células (9 vezes e 7 vezes, respectivamente), enquanto
miR-21
foi significativamente diminuído em ambos os tipos de amostras (de 3 vezes e 9 vezes, respectivamente) (Tabela 2). Entre os diferentes
let-7
membros da família,
deixe-7e
e
deixe-7F
mostrou que mais de desregulamentação de 2 vezes em pelo menos 60% das amostras de tumor . O outro
deixe-7g
,
let-7d
,
deixe-7c
,
deixe-7a deixá-7
membros da família ( -e
,
deixá-7i,
deixe-7a
,
let-7b
não foram reprimidos de forma tão consistente, mas cada um deles foi encontrado diminuiu 2 fold ou mais, em pelo menos 20% dos tumores. no geral, 94% dos tumores tinham pelo menos uma
let-7
membro da família regulada negativamente, pelo menos, duas vezes. as linhas celulares exibiram a regulação negativa do
let-7
membros da família também.
deixe-7F
foi subregulado mais de 4 vezes em linhas de células, enquanto que
let-7d
e
deixe-7a- e
foram também diminuiu significativamente (mais de 2,3 vezes e 2 vezes, respectivamente).
em seguida, compararam os miRNAs ovarianos diferencialmente regulados identificados neste estudo com os relatados em três estudos anteriores [15] -.. [17] de um total de 136 miRNAs encontrados desregulamentado nos estudos anteriores, 16 foram também identificados em nosso estudo (Figura 3B) destes 16 miRNAs, 9 foram reprimidos (
let-7d,
miR-106b,
miR-122a
,
miR-141
,
miR-183
,
miR-195
,
miR-200a
,
miR-335, mir424
) e 7 foram upregulated (
miR-100
,
miR-199
,
miR -296
,
miR-29a
,
miR-29c
,
miR-99a, mir-494
). Curiosamente, relatamos 56 miRNAs que não foram previamente encontrado desregulados no cancro do ovário (Figura 3B).
Previsto genes alvos de genes miRNA
miRNAs pode regular um grande número de genes-alvo e vários bancos de dados com base em vários algoritmos estão disponíveis para prever os alvos dos miRNAs selecionados. Alvo da Análise 3.0 e PicTar foram utilizados para prever genes alvos dos miRNAs desregulados identificados neste estudo. A Tabela 2 apresenta o top 3 previu metas de acordo com ambos Alvo da Análise e PicTar para cada miRNAs diferencialmente expressos. Houve pouca sobreposição entre os alvos identificados com as duas bases de dados diferentes e apenas 7 alvos (FAM44B, Bach1, BCL6, HMGA2, Calu, FGF2 e TNKS2) para 7 miRNAs (
let-7
família,
miR-98
,
miR-155
,
miR-195
,
miR-346
,
miR-206
,
miR-335
) foram compartilhados entre esses dois bancos de dados quando os 3 principais alvos foram examinados.
identificação experimental de alvos de miRNA
Para estudar ainda mais os potenciais alvos de miRNAs do ovário, que overexpressed
miR-34c
,
miR-98
,
miR-424
, e
deixe-7F
em 2 linhas celulares de cancro do ovário (BG -1 e UCI-101).
miR-424 Comprar e
deixe-7F
foram reprimidos em ambos os tecidos e linhas celulares (Figura 3A), enquanto
miR-34c
e
miR-98
foram encontrados reprimidos em tecidos de cancro do ovário e em linhas de células, respectivamente. A Figura 4 mostra a sobre-expressão bem sucedida dos miARNs 72 horas após a transfecção. Em seguida, usamos microarrays Illumina para investigar mudanças no nível de mRNA após a superexpressão desses candidatos. As Tabelas 3 e 4 enumeram as transcrições que foram mais significativamente alterada após a sobre-expressão dos miRNAs no BG-1 e linhas de células UCI-101, respectivamente. Curiosamente, essas tabelas incluem genes tais como
GPx3, MCM7, MSN
que tenham sido previamente implicado no cancro do ovário. Entre os genes significativamente alterados (absoluto Z-ratio 1,5), existem 10 genes do cancro conhecidos (
MSN, PIM1, CBL, COL1A1, COX6C, EVI1, EXT1, HLXB9, PTPN11, TCEA1
), 4 tumor genes supressores (
HIF1A, CAV1, GADD45A, PTTG1IP
), 26 genes do ciclo celular (
ACAT2, CDK5, FDPS, ID1, LLGL1, MAD2L1, ANLN, ATAD2, C12orf48, CD9, ECT2, GADD45A, GSTO1, HSPD1, IPO7, KNTC2, KRT18, MRPS17, NUDT1, PFN1, PRKCA, SFRP1, Skp2, SNRPA1, VAMP8, Wee1
) e 6 genes envolvidos na remodelação da cromatina (
ASF1A, GCN5L2, ATAD2, CBX2 , CBX4, NCOA3
). Muito pouca sobreposição foi encontrada entre o previsto (PicTar e Scan Target) e alvos experimentais. Curiosamente, os alvos experimentais variou de acordo com a linha celular utilizada, sugerindo uma influência significativa do fundo molecular na seleção de alvos miRNA. A fim de validar os dados Illumina, RT-PCR foi realizada em 8 genes encontrados a ser alvos de
deixe-7F
(
KIF1A, ASS, FDPS, NTS
em células UCI-101, e
TFF1, EEF1A2, ESM1, VIM
, em células BG-1) (Figura 5). Descobrimos que, ao passo que os valores absolutos foram diferentes, as tendências foram os mesmos.
KIF1A
e
ASS
foram encontrados elevados em UCI-101, enquanto que
FDPS
e
NTS
foram reprimidos nestas células.
TFF1
e
EEF1A2
foram confirmados para ser elevado em BG-1, enquanto que
ESM1
e
VIM
foram reprimidos.
Pré
miR-34c
,
Pré-miR-98
, pré
miR-424
, pré
deixe-7F
foram sobre-expressos em BG-1 e UCI-101. Os produtos de cada uma das miARNs é mostrado em duplicado para as duas linhas de células utilizadas. a sobre-expressão significativa dos miARNs é confirmada. RT-PCR de ARN 18S é mostrado para cada condição para demonstrar o carregamento igual.
Transcrições identificados por matrizes Illumina ser alterados após a superexpressão deixou-7f são validadas por RT-PCR. Dobram mudanças para genes
KIF1A, ASS, FDPS, NTS
(em UCI-101 células), e
TFF1
,
EEF1A2, ESM1, VIM
(em BG-1 células) são mostrados e confirmar as alterações identificadas por matrizes Illumina.
Usando esses alvos experimentais como ponto de partida (Tabela 3 e Tabela 4), foi utilizado Ingenuity Pathway Analysis (IPA) para revelar potenciais doenças , funções moleculares, sistemas fisiológicos, e vias canónicos associados com a expressão desses miARNs em BG-1 (Tabela 5) e UCI-101 (Tabela 6). Não surpreendentemente, a análise identificou “câncer” como a principal doença associada a estes padrões de expressão em ambas as linhas celulares. doença GI foi também comumente identificada. Curiosamente, movimento celular, o ciclo celular e funções cardiovasculares foram encontrados sistemas frequentemente estar relacionado com estes padrões de expressão. Houve pouca consistência nas vias canônicas identificados através do IPA e, exceto para a sinalização de integrina (encontrado seguinte miR34c ou expressão miR98 em BG-1), nenhum dos caminhos canônicos foi encontrada mais de uma vez nas Tabelas 5 e 6. Esta análise sugere, portanto, que enquanto as vias gerais afectados por
miR-34c
,
miR-98
,
miR-424
, e
deixe-7F expressão
nestes dois as linhas celulares estão relacionados com o cancro, as vias moleculares exactos segmentados são variáveis e dependem da linha de células e sobre as miARNs. Este novo aponta para o elevado nível de complexidade da seleção de alvos miRNA e regulação.
Discussão
Os trabalhos anteriores mostraram que os miRNA específico assinaturas de expressão em vários cancros humanos pode ser associado com o diagnóstico, prognóstico e resposta terapêutica [27]. Além disso, tem sido sugerido que miARNs específicos podem ter papéis cruciais na iniciação e /ou progressão de cancros humanos através dos seus efeitos em diversas vias moleculares. Uma melhor compreensão da expressão miRNA no câncer pode descobrir vias moleculares novela, ou novos mecanismos de ativação de vias conhecidas. Usando a matriz Exiqon miARN, a matriz mais abrangente miARN disponível, obtivemos assinaturas de expressão de miARN no cancro do ovário e identificados vários miARNs expressos diferencialmente em tecidos de cancro do ovário e linhas celulares, bem como possíveis alvos para vários destes miARNs.
identificaram um total de 70 miARNs desregulado nos tecidos ovarianos e 14 destes também foram expressas de forma aberrante em linhas celulares do cancro do ovário (Figura 3A). Em geral, houve um número relativamente pequeno miARNs encontrados em comum entre este estudo e estudos anteriores (Figura 3B). Há várias explicações possíveis para esta discrepância. Em primeiro lugar, a plataforma de matriz utilizado para a identificação de miARN é diferente e pode produzir diferentes padrões. Em segundo lugar, o material que utilizado como controlo normal é diferente do que o que foi usado em estudos anteriores e a escolha do normal é conhecido para influenciar o resultado da análise de perfis de genes [28]. Usamos imortalizado células epiteliais da superfície do ovário, enquanto dois dos outros três estudos ovarianos miRNA usado ovários inteiros. Acreditamos que o tecido do ovário grandes quantidades todo não é o mais apropriado o controlo normal do ovário e é composto de vários tipos celulares e que o epitélio representa apenas uma pequena fracção do tecido do ovário. O uso de uma estirpe de células imortalizada também tem desvantagens, mas acreditamos que seja uma melhor aproximação dos tecidos epiteliais ovarianos normais do que a mistura presente na ovários inteiros. Em qualquer caso, a validação independente de padrões de expressão é crucial, independentemente da fonte de tecido normal ou tumores utilizados no estudo.
identificar
let-7f
como altamente regulada negativamente tanto em células linhas e tumores. Expressão de vários
let-7
miRNAs foram relatados para ser regulada negativamente em cancros da mama [7], cancros do pulmão [29], cancro da tiróide [11], o câncer de próstata [13], e do ovário [15 ] – [17]. Uma associação entre a
let-7
downregulation e mau prognóstico tem sido relatada em pulmão humano [29] e cancro da mama [7]. A constatação de que o
let-7
família de miRNAs regula a expressão da família oncogene RAS fornece uma base molecular potencial para o papel de
let-7
miRNAs em câncer humano [20].
let-7
é, portanto, considerado como um supressor tumoral miRNA e, curiosamente,
let-7
genes mapeados para loci eliminada em vários tipos de cancro, incluindo o cancro do ovário [20]. Além disso,
let-7f
foi relatado para promover a angiogénese, visando os genes anti-angiogénicas [30]. O presente trabalho, bem como uma relatórios anteriores [15] – [17] mostrando que os membros da
let-7
família são alteradas no câncer de ovário sugerem que
let-7
pode representar uma importante jogador nesta doença. Será importante identificar
let-7
alvos a jusante relevantes para tumorigênese de ovário.
O miRNA mais consistente e altamente regulada em ambos os tecidos e linhas celulares de cancro do ovário era
miR-221
(Tabela 2).
miR-221
tem sido mostrado para ser altamente regulada positivamente em cancros pancreáticos [12], no glioblastoma [31] e foi implicado no cancro da tiróide [32].
miR-221
foi mostrado para segmentar o KIT oncogene [33], bem como o p27kip1 supressor de tumores [34].
Enquanto
miR-21
sobreexpressão tem sido observado em vários cancros, incluindo glioblastoma [31], o cancro da mama [7], [35], o cancro do pulmão [8], câncer pancreático [36], as linhas humanos malignos de células cholangiocyte [37] e cancro do cólon [38], encontramos este gene altamente regulados negativamente em nossas amostras. Por uma questão de facto,
miR-21
foi o mais significativo miARN regulados negativamente em cancro do ovário, quando os nossos dados foi na média de todas as amostras e linhas de células. A nossa descoberta é contra-intuitiva, uma vez que se verificou que a
miR-21
downregulation foi associado com um aumento da apoptose e diminuição da proliferação de células [35].
miR-21
foi sugerida para funcionar como um oncogene modular a tumorigénese através da regulação de genes, tais como BCL2 [35], PTEN [37] e PDCD4 [39]. Estamos investigando os possíveis alvos de
miR-21
em nossas células, bem como as possíveis razões por trás de sua infra-regulação em nosso sistema. É possível que as metas de certos miRNAs poderia ser específico do tecido, o que explicaria as diferenças nos papéis de vários miRNA em tecidos diferentes.
Outros miRNAs encontrados diferencialmente expressos em ambos os tecidos e linhas celulares são
miR-146b,
miR-508
,
miR-106b
,
miR-134
,
miR-155
,
miR-346
,
miR-422a
,
miR-424
,
miR-519a
,
miR-648
,
miR-662
. Vários destes miARNs têm sido implicados em outros tumores malignos ou no controlo do crescimento e apoptose. Por exemplo,
miR-134
regulada negativamente o crescimento celular, e
miR-155
aumento do crescimento celular em células de carcinoma do pulmão, A549 [40]. A contribuição de cada um destes jogadores a tumorigénese ovário permanece a ser determinada.
miR-34c
foi recentemente mostrado ser um alvo transcricional de p53 [41], [42] e pode suprimir a proliferação e formação de colónias em ágar mole em células de ovário epiteliais neoplásicas [42]. Curiosamente, encontramos
miR-34c
desregulamentado em tecidos de cancro do ovário e este achado sugere que
miR-34c
pode desempenhar um papel na tumorigénese ovário através do seu papel na via p53.
Devido à especificidade do tecido dos miARNs, diferentes conjuntos de miARNs são susceptíveis de ser regulados positivamente ou regulados negativamente em cancros de diferentes origens celulares, embora tenha sido relatado que as assinaturas de miARN de diferentes tipos de cancro, especialmente epiteliais que partilham algumas miARNs individuais [ ,,,0],38]. Dos miRNAs que foram relatados aqui para ser diferencialmente expressos em câncer de ovário, vários têm sido igualmente desregulamentado em outros tipos de câncer. No total, 31 miARNs identificados no presente estudo também foram relatados desregularizaram em outro tipo de cancro (dados não mostrados). Além disso, 16 miARNs identificadas aqui foram anteriormente relatadas para ser alterada no cancro do ovário (Figura 3b). Mais interessante, nós identificamos 56 miRNAs que não tenham sido previamente encontrados diferencialmente expressos em câncer de ovário. Estes miRNA pode desempenhar um papel na tumorigênese de ovário e estão actualmente a ser investigada.
A fim de identificar potenciais alvos dos miRNAs diferencialmente expressos em câncer de ovário que pesquisaram dois bancos de dados grandes, PicTar e digitalização Target. Descobrimos que havia muito pouca sobreposição entre as metas previstas de cada algoritmo. Na verdade, apenas 7 (FAM44B, Bach1, BCL6, HMGA2, CALU, FGF2 e TNKS2) metas previstas foram compartilhados entre esses dois bancos de dados. Este resultado ilustra as dificuldades bem documentados de alvos preditores de miRNA [43]. Além disso, é possível que as metas pode depender do ambiente celular, (rácios relativos de diferentes alvos potenciais podem afetar os mais susceptíveis de serem reprimidos) adicionar outra camada de complexidade na seleção de alvos miRNA. A fim de investigar experimentalmente as alterações nos níveis de mRNA, que sobre-expressos 4 diferentes candidatos miRNA (
miR-98
,
miR-424
,
miR-34c Comprar e
deixe-7F
) em 2 linhas celulares e níveis de transcrição avaliada utilizando uma matriz oligonucleotídeo Illumina. Claramente, esta abordagem só pode identificar alvos de miARN que alteraram os níveis de ARNm (em oposição aos alvos de inibição de tradução), mas que tenha sido previamente demonstrado que miARN pode regular negativamente os níveis de um grande número de transcritos [44]. Enquanto algumas das transcrições alteradas podem não representar alvos directos do miRNA correspondente, uma análise mais aprofundada de mRNAs candidatos individuais podem fornecer evidências para saber se eles representam alvos diretos ou secundários. Ingenuity Pathway Análise das metas revelou uma série de vias e sistema potencialmente regulados pelos miRNAs sobre-expressos (Tabela 5 e Tabela 6). Curiosamente, os percursos previstos não foram consistentes entre as linhas de células 2 e novamente sugeriu que a seleção de alvos miRNA e, portanto, a função de miRNA é altamente dependente do tecido.
Quando os alvos previstos (obtidos com PicTar e Alvo da Análise) foram comparados com as metas experimentais obtidos por Illumina microarray, observamos nenhuma sobreposição. Isto poderia ser devido a um certo número de razões. Em primeiro lugar, os algoritmos para a identificação de alvos de miARN pode preferencialmente identificar alvos que resultam na repressão de translação, que, obviamente, não seriam identificadas pela nossa experiência microarray. Além disso, como discutido anteriormente, é provável que os alvos de miARN são específicos do tecido. De acordo com esta possibilidade é o facto de que os alvos identificados experimentalmente foram completamente diferentes nas duas linhas celulares foi utilizado. Curiosamente, a maioria dos altamente acima regulados e regulados negativamente (top 10) genes já foram relatados para ter papéis no cancro ou outras actividades celulares relacionadas com o cancro (Tabela 3 e 4), tais como GSTP1 [45], [46], HIF-1 [47], [48], e SGK [49].
neste estudo nós identificamos miRNAs diferencialmente expressos em câncer de ovário. Como um primeiro passo para determinar seus papéis na tumorigênese ovário, nós começamos a identificar alvos destes miRNAs. Mostra-se que os objectivos previstos são diferentes do experimental e que os alvos experimentais variam de acordo com o fundo celular em que são expressos miARNs. Assim, será importante estudar metodicamente cada miRNAs em vários modelos, a fim de esclarecer o seu papel no câncer de ovário. Além disso, uma combinação de sobreexpressão /segmentação eventos por miARN junto com a tecnologia de array de proteínas irá ser crucial na identificação da miARN: jogadores de ARNm de cancro do ovário. A imagem que é provável que surja é um conjunto altamente complexo de interações entre miRNAs e mRNAs alvo. Uma melhor compreensão destas vias vai nos trazer ainda mais perto de uma compreensão do mecanismo molecular subjacente a esta doença e esperamos que a abordagens inovadoras para detecção e terapia.
Materiais e Métodos
Linhas de células e tecidos amostras
linhas de cancro do ovário BG-1, OIC-101, HEY, células OVCA420, OVCA432, OVCA433, OVCAR2, OVCAR3 e OVCAR5 foram cultivadas em meio de crescimento de McCoy 5A (Invitrogen) suplementado com soro fetal bovino a 10% ( FBS) e antibióticos (100 unidades /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina). A linha celular de cancro do ovário OV90 foi cultivada em meio MCBD 105 (Sigma), Meio 199 + (Invitrogen) suplementado com 15% FBS e antibióticos. MANGUEIRA DE-B, uma linha celular epitelial da superfície do ovário imortalizada com E6 e E7 [50], foi cultivada em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10%, antibióticos e 5 ng /ml de EGF. Dezoito cancros do ovário primárias congelados foram obtidos através do tecido Collaborative Humano Rede Gynecologic Oncology Group (Hospital Pediátrico, Columbus, OH). Além disso, nove amostras congeladas primária do cancro do ovário e sete amostras de RNA (de tecidos de cancro do ovário primárias) foram obtidos do Departamento de Patologia do Johns Hopkins Medical Institutions (Baltimore, MD). A classificação histológica de todos os tecidos é apresentada na Tabela 1 e todas as amostras foram encontrados para conter maior que as células cancerosas 80%
ARN extracção quantificação
O ARN total foi obtido usando Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. RNA foi quantificada e avaliada usando o RNA 6000 Nano Kit e 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies UK Ltd, West Lothian, UK).
miRNA hibridação microarray
miRCURY ™ LNA miRNA Arrays (Exiqon), que consiste em sondas de controlo, sondas de desadaptação e 1458 sondas de captura, sondas perfeitamente combinados para todos os miARN em todos os organismos, como anotado no miRBase versão 8.1, Julho de 2006 (miRBase humano 8.2 também é coberto) foram utilizados neste estudo. As sondas de captura cobrir 92,3% dos miRNAs anotados em miRBase 9.0. As sondas de controlo inclui 10 sondas de controlo de pico-para assegurar rotulagem óptima e hibridação, oito sondas de captura negativos e doze sondas de captura que hibridam com RNAs nucleares pequenos. rotulagem ARN e hibridação foi completado de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, o ARN de cada amostra foi marcada com Cy3 usando miRCURY ™ LNA miARN kit de marcação de matriz. Após marcação, as amostras foram carregadas sobre a lâmina de microarray e incubadas 16-18 horas a 60 ° C.