Abstract

Estudos recentes têm destacado a superexpressão de mucina 1 (MUC1) em vários carcinomas epiteliais e do seu papel na tumorigénese. Estas mucinas apresentar uma nova oportunidade de segmentação para tratamentos de câncer fototérmica mediada por nanopartículas, devido à sua extensão extracelular antena-como único. Neste estudo, os anticorpos e albumina de MUC1 foram imobilizados sobre a superfície de ouro nanorods utilizando um “primer” de polydopamine (PD), uma mímica molecular de catecol e proteínas adesivas mexilhão rica em amina. PD forma uma plataforma de adesivo para a deposição de albumina e anticorpos MUC1, alcançar uma superfície que é estável, e bio-inerte biofuncional. Dois fótons luminescência confocal e de imagem dispersão darkfield revelou alvo de MUC1-BSA-PD-NRs para MUC1

+ MCF-7 do cancro da mama e SCC-15 carcinoma de células escamosas linhas celulares. As células tratadas foram expostas a um laser que engloba o AuNR plasmon de superfície longitudinal do infravermelho próximo e avaliadas para a ablação fototérmico. MUC1-BSA-PD-NRs diminuiu substancialmente a viabilidade celular em linhas celulares MCF-7 photoirradiated comparada MUC1- MDA-MB-231 de cancro da mama (p 0,005). Agentes não exibiram qualquer citotoxicidade na ausência de tratamento fototérmico. A natureza facile do método de revestimento, combinada com a segmentação e eficácia fotoablação, são características atraentes destas Nanotherapeutics câncer candidato

Citation:. Zelasko-Leon DC, Fuentes CM, Messersmith PB (2015) Cancer Cell Targeted-MUC1 fototérmica Ablation Usando Bioinspirada ouro nanobastões. PLoS ONE 10 (7): e0128756. doi: 10.1371 /journal.pone.0128756

editor: Bing Xu, da Universidade Brandeis, ESTADOS UNIDOS

Recebido: 25 Março, 2015; Aceito: 01 de maio de 2015; Publicação: 06 de julho de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zelasko-Leon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. trabalhos de imagem foi realizado no Centro de Northwestern University for Advanced Imagem Molecular (CAMI), apoiado generosamente pela NCI CA060553 CCSG P30 concedido à Robert H. Lurie Comprehensive Centro de câncer. Porções desta pesquisa foram realizadas nos núcleos de Keck-II e épica da Universidade Northwestern Atomic e Nanoscale Caracterização Experimental (NUANCE) Center. A NUANCE Center são suportadas pelo programa MRSEC (NSF DMR-1121262) para o material Research Center, do Instituto Internacional de Nanotecnologia (IIN), a Fundação Keck, e do Estado de Illinois. experimentos de caracterização de materiais adicionais foram carrieed com o apoio da Universidade Northwestern High Throughput Analysis Laboratory (HTAL) e Keck Biofísica Facility. Este trabalho foi ainda apoiado pela Facilidade Universidade Northwestern citometria de fluxo e um Centro de Apoio Grant Câncer (NCI CA060553). DCZL foi apoiada por uma Science Foundation Graduate Research Fellowship Nacional (DGE-0.824.162; https://www.fastlane.nsf.gov/grfp) e um Scholar Award Malkin do Robert H. Lurie Comprehensive Cancer Center (RHLCC), da Universidade Northwestern (https://cancer.northwestern.edu/research/research_programs/funding/). CMF foi apoiado por uma concessão da pesquisa de Verão McCormick (https://www.mccormick.northwestern.edu/students/undergraduate/research-opportunities/). Apoio adicional foi fornecido pelo NIH bolsas R01 EB005772 e R37 DE014193 (PBM; https://report.nih.gov/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Au nanobastões (AuNRs) são construções muito atraentes para a terapia de tumores devido à sua facilidade de síntese, sintonizável no infravermelho próximo (NIR) de ressonância de plasma de superfície localizada (LECC), e grandes áreas de superfície functionalizable [1, 2 ]. O LECC melhora as propriedades ópticas, dando origem a alta absorvência, dispersão, e aos fenómenos de luminescência de dois fotões que pode ser explorado para terapia do cancro fototérmico e imagiologia de diagnóstico [1, 2, 3]. Os pacientes com margens do tumor pobres ou doença microscópica podem ser candidatos pobres para procedimentos cirúrgicos invasivos e têm a beneficiar da melhoria das abordagens multimodais [1]. A penetração não-invasivo de energia NIR aos tecidos tratados com AuNR permite hipertermia localizada resultando numa ablação do tumor. Como um benefício adicional, este aquecimento pode melhorar a perfusão do tecido, aumentando a carga subsequente de nanopartículas e a eficácia da quimioterapia adjuvante ou radiação [4, 5].

Um desafio principal na base de terapias AuNR refere-se a modificação ou substituição do bicamada CTAB inicial com um revestimento de superfície que é bio-inerte e biofuncional [6]. Uma variedade de estratégias de passivação têm sido desenvolvidas para ultrapassar este problema. Estas estratégias incluem a modificação com polímeros sintéticos amphiphillic tais como poli (etileno-glicol) -thiols (PEG-SH) [7], lípidos [8], electrostáticas camadas de polímeros polianiónicos e policatiónicos [9], e mais recentemente, proteínas [10, 11]. O desenvolvimento observado de uma corona de proteína após o contato de nanopartículas em meios biológicos contendo soro apoiou interesse em albumina como um potencial agente de nanopartículas passivação [11].

mucinas transmembrana ricos em prolina glicosilada, treonina e domínios de serina abranger a membrana das células epiteliais e proporcionar uma função de barreira através ectodom�ios que se projectam ao longo de 100 nm a partir da superfície da célula [12]. Autoproteolysis gera C-terminal (MUC1-C) e N-terminal (N) de MUC1-subunidades, o último dos quais está ancorado à superfície celular através de um complexo estável, mas não covalente com MUC1-C. Enquanto que as mucinas são normalmente expressas na superfície apical de células a proteger contra toxinas ambientais, stress crónico induz uma perda de polaridade celular levando a interacções de mucinas com moléculas de sinalização de superfície basolateral, tais como tirosina-cinases de receptor, provocando a activação a jusante dos genes de proliferação e sobrevivência . MUC1 é regulada em resposta ao afluxo de citocinas inflamatórias durante a inflamação e infecção, levando à perda da polaridade e fortalecer a função de proteção da barreira mucosa.

Apesar de funções de atividade MUC1 transitória para reduzir a inflamação, a superexpressão de longo prazo promove fenótipos agressivos em cancros humanos. MUC1-N contém fortemente glycoslyated repetições em série de 20 aminoácidos e é aberrante underglycosylated em carcinomas epiteliais, expondo os resíduos implicados na imunovigilância de cancro [13]. MUC1-N é capaz de bloquear as interacções de superfície e também podem ser submetidos a secreção a partir da membrana celular, que permitem a activação do receptor do tipo de MUC1-C em uma variedade de vias de sinalização de tumores [12]. O significado da proteína MUC1 como um alvo terapêutico relevante é realçada pela sua expressão atípica em 64% dos carcinomas diagnosticados anualmente, e em mais de 90% dos carcinomas de mama, independentemente da hormona ou status do receptor do factor de crescimento [14].

A função e exploração de MUC1 como um antígeno tumoral continua a ser elucidado [15] . Apesar de sua manifestação física da antena, como que, em princípio, presta bem a segmentação terapêutico de tumores que expressam mucina [12, 16], MUC1 foi devidamente explorado na terapia do câncer alvo [17, 18, 19, 20]. Estudos demonstraram que a sobre-expressão MUC-1 promove directamente

In vivo

transformação da glândula mamaria e a sua expressão aberrante em células transformadas podem induzir bloqueio estérico ou activação de receptores de superfície celular, que serve como uma força motriz para a invasão [21] e resistência à quimioterapia [22, 23]. Clinicamente, a detecção de níveis circulantes de mucina soro é um fator prognóstico aprovado pela FDA para o tratamento de câncer de mama [12] e fase III de ensaios clínicos avaliando imunoterapias baseadas MUC1 estão em curso [24].

Aqui, nós demonstrar a mediada por polydopamine (PD) de conjugação de nanorods ouro (AuNRs) com albumina de soro bovino (BSA) e 1 de mucina anticorpos monoclonais (anti-MUC1) e passivação para a segmentação, respectivamente (Fig 1). Os principais objetivos deste trabalho foram identificar as condições ideais para a funcionalização de nanopartículas e para demonstrar a viabilidade de ablação fototérmica de células cancerosas positiva MUC1 via AuNRs bioativa. Os resultados estabelecem as condições ideais para modificação da superfície de AuNRs com BSA e anticorpos MUC1 e estabilidade fisiológica. segmentação de sucesso e fotoablação das células cancerosas positivas MUC1 sugere essas construções podem ser terapias anticâncer úteis no futuro.

anticorpos MUC1 servir como novas construções de segmentação na aplicação da terapia fototérmica plasmonic (A). Sondagem MUC1 visando a N- underglycosylated e domínios C-terminais em vários carcinomas epiteliais irá expandir nosso repertório de metas de câncer com o potencial para efeitos terapêuticos sinérgicos (B, adaptado de [12]).

Materiais e Métodos

Materiais

cloridrato de dopamina, brometo de cetiltrimetilamónio (CTAB, 99%), tetracloroaurato de sódio (III) hidratado (NaAuCl

4 · 2H

2O, 99%), boro-hidreto de sódio (NaBH

4, 98%), ácido ascórbico, glicina, e nitrato de prata (AgNO

3, 99%) foram utilizados para a síntese AuNR. O valor da solução de glicina (0,2 M) pH foi ajustado a 8,0 com hidróxido de sódio 2 M antes da utilização. Todos os reagentes foram obtidos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) a menos que indicado de outra maneira. AlexaFluor 633 cabra anti-imunoglobulina de ratinho (IgG) foi adquirido de Invitrogen (Carlsbad, CA). Anti-MUC1-N (VU4H5), anti-MUC1-N-PE (VU4H5 PE), de ratinho anti-MUC1-C (H-6), rato HRP anti-IgG de cabra, de cabra anti-coelho-HRP de IgG, e de coelho anti-BSA (B-140) anticorpos primários foram comprados a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). De cabra anti-IgG de ratinho e anticorpos de IgG anti-coelho de cabra conjugado com PE e /ou de HRP foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Ultrapura, água desionizada (18.2MΩ · cm) foi usada para preparar todas as soluções aquosas. SCC15, MCF-7 e MDA-MB-231 linhas celulares de cancro foram generosos presentes dos laboratórios do Dr. David Crowe na Universidade de Illinois-Chicago e Dr. Dean Ho na Universidade Northwestern.

Métodos

síntese de NRs ouro.

a síntese de CTAB AuNRs-revestidas (CTAB-NRs) está bem estabelecida na literatura e foi realizada de acordo com um método ligeiramente modificado utilizada por Huang e colaboradores [2] . Todos os reagentes foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich (St. Louis, MO) a menos que indicado de outra maneira. Uma solução aquosa 0,2 M de CTAB (5,0 mL) foi aquecida a 30 ° C e misturada com 0,5 mM NaAuCl

4 (5,0 mL). Gelada 0,01 M NaBH

4 (0,6 mL) foi adicionado a esta mistura e sonicada durante 5 minutos, até que uma solução amarelo-castanho semente desenvolvido. Em seguida, 50,0 ml de 0,2 M de CTAB foi suavemente misturada com 50,0 mL NaAuCl 1,0 mM

4 e 0,1 ml de m AgNO 0,1

3 para formar uma solução de crescimento. O ácido ascórbico (78,8 mM, 0,7 mL) foi adicionado à solução de crescimento como um redutor suave, seguido pela adição de 120 ul da solução de sementes. Após 45 minutos, 100 ml desta solução AuNR foi misturado com 100 mL de glicina 0,2 M (pH 8,0). Esta solução foi deixada a reagir durante a noite sem agitação à temperatura ambiente.

Biofunctionalization de NRs ouro.

Para a síntese de BSA-PD-NRs, alíquotas de 1 ml de CTAB-NRs foram centrifugadas a 10.360

xg Compra de 10 min para formar uma pelota. O sobrenadante foi rejeitado e o sedimento foi redisperso em 1,0 ml de tampão bicina 10 mM (pH 8,5) suplementado com 0,1 mg /ml de cloridrato de dopamina. Um revestimento polydopamine foi desenvolvido com ultra-sons a 37 ° C durante 30 minutos. Uma solução de 1,0 mL de 20 mg /mL de BSA preparada em PBS (Ca

2+ e Mg

2+ livre) foi adicionado a esta mistura PD-NR e deixou-se reagir durante mais 30 minutos com ultra sons. Após reacção durante a noite com agitação suave, as amostras foram centrifugadas, redispersas em água ou PBS, e armazenadas à temperatura ambiente até uso posterior. Para conjugações de anticorpos, 0,25-5,0 ug anticorpo era ou feito reagir directamente com CTAB- ou PD-NRs antes da adição BSA ou pré-misturado com BSA ou tampão soluções, antes da adição.

ligação do anticorpo e quantificação.

immunosorbent assay (ELISA) ligado a enzima

: IgG anti-ratinho de cabra de 96 cavidades revestidas microplacas de ELISA (Pierce Biotechnology, Rockford, IL) foram lavadas com PBS + 0,05% Tween-20 (PBST). padrões de anticorpo de ratinho anti-MUC1-N /C e amostras de sobrenadante AuNR contendo quantidades desconhecidas de MUC1-N ou -C (100 ul /poço) foram carregadas e deixou-se capturar durante 1 h à temperatura ambiente com agitação suave. As placas foram lavadas 3X em 200 uL de PBST. secundário de cabra anti-IgG de ratinho-HRP (Santa Cruz Biotechnology, 100 uL bem, /diluição 1: 6000) foi incubada durante 1 hora a 37 ° C com mistura. A placa foi lavada 3x com PBST e uma solução 1 mg /ml de 2,2′-azino-bis (ácido 3-etilbenz-tiazolina-6-sulfúrico) (ABTS) foi preparado de ácido cítrico 50 mM e fosfato de sio dibico 100 mM . Imediatamente antes da utilização, a solução ABTS foi misturada com 10 ul 30% de H

2O

2 e adicionadas aos poços (100 ul). ABTS desenvolvimento da cor com base na presença do anticorpo secundário marcado com HRP foi medida a 405 nm no prazo de 15 minutos a uma sinergia H4 híbrido MultiModo leitor de microplacas (Biotek, Winooski, VT). A quantidade de anticorpos MUC1-C AuNR-MUC1 ligado-N e foi determinada subtraindo-se as concentrações detectadas nos sobrenadantes de amostras das condições de carga conhecidas durante a preparação. As concentrações foram calculadas a partir da regressão linear curvas padrão ponto-a-ponto

espectroscopia óptica

UV-Vis-NIR espectrofotometria

:.. UV-Vis-NIR espectros de variadamente AuNRs modificados foram registrados em um espectrofotômetro Hitachi U-2010 (Hitachi City, Japão). posições longitudinais LECC pico foi determinada e utilizada como um indicador de modificação da superfície e agregação

dicroísmo circular

:. dicroísmo circular (CD) Os espectros foram registados com um espectrofotómetro de CD J-815 (Jasco, Easton, MD) na gama extrema de UV (190-300 nm, uma resolução nm) em cuvetes de 1 mm de comprimento da trajectória de quartzo à temperatura ambiente. AuNR peletes (30 ul) foram diluídos em 900 ul de água ultrapura para todas as medições. BSA (0,25 mg /ml) serviu como uma proteína de referência, enquanto a água ultrapura foi usado para subtracção do fundo. O arranjo espacial e espinha dorsal conformação de amidas de proteína dá origem a espectros de CD característica de estruturas secundárias específicas. Minima a 222 e 208 nm resultar de amidas de proteína a-helicoidal e a luz polarizada na direcção dos hélices a, respectivamente [25]. Embora os métodos para o cálculo da% de helicidade estão amplamente disponíveis [26], que requerem concentrações de proteína que não podia ser determinada com precisão nas nossas experiências, devido à interferência de catecolaminas [27]. Assim, para quantificar a extensão da preservação da estrutura secundária em BSA, a propensão α-helicoidal [26], (1) pode ser utilizado como uma estimativa grosseira, mas conveniente do conteúdo α-helicoidal, em que

θ representa o

elipticidade cru em millidegrees em 208 e 222 nm, respectivamente. Razões entre 0,80 e 0,95 representam cadeia simples hélices a e aumentar com o aumento do teor α-helicoidal [26].

cultura celular.

células MCF-7 de cancro da mama foram cultivadas em meio DMEM de glicose elevada (Invitrogen, Carlsbad, CA) suplementado com FBS a 10% (Invitrogen), 1% de sulfato de gentamicina (Invitrogen), e 10 ug /ml de insulina humana recombinante (Santa Cruz Biotechnology). As células MDA-MB-231 foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen) com 10% de FBS e 1% de sulfato de gentamicina. carcinoma epidermóide oral SCC15 foi cultivada em DMEM alta glicose suplementado com 10% FBS e 1% de sulfato de gentamicina. Todas as linhas de células foram cultivadas a 37 ° C em incubadoras umidificada com 5% de CO

2.

imagiologia celular.

Para fluorescência e luminescência de dois fótons (TPL) imagem confocal, suspensões de células (1×10

5) em 0,2 ml de meio foram semeadas em cada uma das 8 cavidades de um Lab-Tek slides lamela câmaras (Nunc, Rochester, NY). As células foram cultivadas até à confluência e foram incubadas com meio fresco contendo AuNRs (03:00). As células foram incubadas com AuNRs durante 24 horas, lavadas duas vezes com PBS, e fotografada vivo para emissões TPL em meio fresco. imagens confocais foram adquiridos com um Axio Observer invertido. Z1 microscópio equipado com uma lente objetiva de 20X e estágio aquecida (37 ° C) definido para 5% de CO

2 incubação (Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Para imagens de TPL, AuNRs foram animado por um femtosegundo Mai Tai (fs) Ti: Safira laser (Mai Tai, Spectra-Physics, Santa Clara, CA) com uma taxa de pulso de 130 fs e uma taxa de repetição de 80 MHz. O comprimento de onda de excitação TPL foi ajustado para o pico da amostra LECC AuNR (780 nm). Um detector espectral interna ajustada para as emissões entre 500-615 nm detectados a TPL a partir AuNRs. Um laser de HeNe 543 nm foi utilizada para geração de imagens de campo claro. Em campo escuro (DF) dispersando experiências, as células foram semeadas (1×10

4 células /cavidade) em 16 lâminas de câmara bem (Lab-Tek, Nunc), cultivadas até à confluência, e tratou-se com 3,75 AuNRs pM em meio durante 1 hora. Os poços individuais foram lavadas 3X com PBS. Os poços e juntas de câmara foram cuidadosamente removidos eo slide foi lamínulas para a imagem latente imediato em aumento de 40 vezes com uma Leica DM2500 (Wetzlar, Alemanha) microscópio de campo escuro vertical. As imagens foram adquiridas em uma exposição constante (f-stop 1/15) através de uma câmera EOS Rebel T2i.

Electron microscopia.

microscopia eletrônica de grades (EM) (Ted Pella) foram carregados com AuNRs peletizada (5 ul, 1 nM), contra-coradas com ácido phosphotungstinic, e seco durante a noite nas condições ambientes. Grades foram fotografadas com um Hitachi Ultra alta resolução de emissão de campo de varredura microscópio eletrônico de transmissão (FE-STEM) (Hitachi City, Japão) em EM transmissão (MET) e elétrons secundários (SE) Modos de HD-2300.

ζ-potencial análise.

modificados e não modificados AuNRs (15 pM) foram injetadas em células capilares padrão dobrado para medições Ç potencial. As medições foram realizadas em um Zetasizer Nano (Malvern Instruments, Worcestershire, Reino Unido) à temperatura ambiente e calculada como a média de sete scans.

terapia fototérmica com AuNRs modificado por MUC1.

MCF- 7, MDA-MB-231, e SCC15 (5,0 x 10

5) as células cancerosas foram cultivadas em placas de 12 poços de TCP e crescidas até à confluência ao longo de 2-3 dias. Os poços foram lavados com PBS e tratados com 0-3 pM de anti-MUC1-N, anti-MUC1-C, ou AuNRs diluídos em meio de cultura de células de BSA-only-modificado. Após 1 h de incubação a 37 ° C e 5% de CO

2, os poços foram lavados 3x com PBS para remover AuNRs não ligado e marcado em dois pontos focais com níveis equivalentes de confluência. Um de cada um destes pontos foi exposto a uma fonte de laser de banda larga SuperK versa (NKT Photonics, 480-850 nm, um milímetro local) durante 3,5 minutos, a uma densidade de potência de 0,18 W /nm no comprimento de onda centro de plasmão (780 nm). Após uma incubação de 24 h, as células foram lavadas com PBS, e coradas com calceína AM (2 uM) e iodeto de propídio (4 uM) para geração de imagens ao vivo /morto. A microscopia de fluorescência foi realizada com um microscópio Leica DMIRB (Wetzlar, Alemanha) equipado com uma lâmpada de arco de 250 W Hg e uma câmara QIClick (QImaging, Surrey, BC, Canadá). Pontos de irradiação e irradiação não foram capturados em cada poço para comparação. As imagens foram processadas com o Programa GNU Image Manipulation (GIMP, v. 2.8.0). ImageJ foi usado para converter imagens ao vivo /morto em preto (fundo) e brancos (células) thresholded máscaras. A porcentagem de área de fundo pixels com (Área%

+ NIR) ou sem exposição laser (Área%

-NIR) foi calculado com o

Medida

função em ImageJ. A seguinte equação foi utilizada para quantificar a eficácia do tratamento: (2) Os resultados foram normalizados para poços não tratados ± exposição NIR. As experiências foram repetidas com linhas orais e de células de cancro da mama MDA-MB-231 SCC15.

A análise estatística.

O teste t de Student foi utilizado para analisar por cento de carga de anticorpos via ELISA. análise de duas vias de variância (ANOVA) com Bonferroni pós-testes foi usado para determinar se a média% áreas viáveis ​​entre MUC1

+ e MUC1

– linhas celulares foram significativas no que diz respeito às condições de dosagem e de tratamento. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando o

P

valor foi 0,05 (n = 3-6). Todas as análises foram realizadas por GraphPad Prism versão 5.0a para Mac (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Resultados e Discussão

albumina como agente passivador superfície

incrustações não específica mínima de superfícies é frequentemente um objectivo desejável na investigação biomédica e concepção do dispositivo médico [28, 29], para que a enxertia de biomoléculas e polímeros sintéticos a uma superfície tem sido proposto como uma solução [30, 31]. O grau e a natureza da adsorção de proteína não específica a uma superfície depende de muitos factores, incluindo a composição de proteína (tamanho, concentração, taxa, e estabilidade interna), condições ambientais (pH, temperatura e força iónica), e propriedades de superfície (morfologia, cobrar e energia livre) [32]. O uso de BSA adsorvido como uma abordagem para a superfície passivação tem sido uma estratégia intrigante para os investigadores biomédicos. Um dos primeiros usos desta estratégia foi a observação por Packham e outros que resistem à adsorção de plaquetas a tubos de vidro revestidas com albumina [33]. A passivação com albumina foi proposto para circuitos de plasmaferese, próteses arteriais, e outros dispositivos de contacto com o sangue para evitar a trombogénese, no entanto esta abordagem mostrou uma eficácia limitada devido à cobertura da superfície de baixo ou deslocamento de albumina physisorbed por proteínas com afinidades de ligação mais elevadas [34].

As tentativas posteriores foram feitas para reticular adsorvido albuminas com glutaraldeído ou irradiação gama tratamentos; No entanto, a perda resultante em flexibilidade da proteína limita a sua capacidade de contribuir para a repulsão estérica [35]. Uma vez que estas primeiras observações, a albumina tem sido usada para modificar o óxido de ferro [36], poliestireno [37], Ag e Au [38, 39], quantum dot [40], e nanopartículas de lipossomas [41]. Estudos não só demonstraram que as nanopartículas BSA-conjugados reduzir a formação de agregados, mas eles também revelaram aumento de rendimento quântico, que é de relevância para as aplicações fototérmicos explorados neste estudo [42].

polydopamine para funcionalização de nanopartículas com biomoléculas

neste estudo, descrevemos uma estratégia inspirada proteína adesiva do mexilhão para ancorar BSA e do anticorpo sobre a superfície de nanobastões de ouro. incrustação promíscuo do mexilhão marinho de superfícies orgânicas e inorgânicas tem sido atribuída por Waite e outros para as proteínas incomuns encontrados nas placas adesivas terminais dos seus tópicos byssal [43, 44]. Especificamente, os níveis elevados de aminoácido contendo-catecol 3-4-di-hidroxifenilalanina (DOPA) e a lisina de aminoácidos contendo amina ocorrer em placas byssal, e esta observação foi fortemente influenciado o desenho de adesivos moleculares versáteis, ancoragens para polímeros sintéticos, e as estratégias gerais para revestimentos de superfície [44, 45].

motivado pelo elevado teor de catecolamina de proteínas adesivas mexilhão, dopamina foi identificado como uma mímica estrutural simples da proteína mexilhão pé 5 (MFP-5) e mostrado para depositar espontaneamente filmes finos de melanina semelhante em praticamente qualquer superfície material a granel [46]. Polydopamine (PD), os filmes são formados através da polimerização espontânea de moléculas de dopamina sob condições aquosas moderadamente alcalinas que imitam o ambiente marinho. Embora o mecanismo de formação e a composição final do DP estão ainda sob investigação [47, 48, 49, 50, 51, 52], sob as condições normalmente utilizadas para formar revestimentos PD dopamina é oxidado para produzir dopamina-quinona que subsequente ao rearranjo intramolecular , a continuação da oxidação e o acoplamento intermolecular, produz um polímero heterogéneo eumelanina semelhante [44]. É provável que uma variedade de subunidades e tipos de ligação estrutural são encontrados dentro do filme PD, bem como a PD-substrato e interfaces de PD-proteína, incluindo ligações covalentes, electrostáticas e fortes interacções não covalentes tais como a transferência de carga, ligação de hidrogénio, e π-empilhamento. O adesivo e a natureza reactiva dos filmes finos polydopamine foi explorada como uma plataforma conveniente ou “iniciador” para o qual podem ser depositados revestimentos secundários adicionais através de uma variedade de potenciais mecanismos, incluindo a ligação covalente com o tiol, amina, e resíduos de histidina orgânicos [53]. Com este modelo de dois passos em uma ampla variedade de aplicações funcionais de polydopamine têm sido desenvolvidos para aplicações biomédicas [54], como o enxerto de PEG-tióis para suprimir a incrustação biológica [46, 55] ou a promoção específica de adesão celular a superfícies [ ,,,0],46].

Preparação e caracterização de BSA modificado AuNRs

modificação de AuNRs com DP foi realizada como descrito anteriormente [56, 57], obtendo-se AuNRs rodeado por um revestimento fino de PD. A presença de DP foi confirmada por desvio para o vermelho de UV-vis (Fig Um ficheiro em S1). PD-NRs foram encontrados para agregar em tampão, mas redispersão em solução de BSA e isolamento por centrifugação levou-se a dispersões estáveis ​​de BSA-PD-NRs. Usando a solução AuNR LECC intensidade e deslocamento do pico (Figura B em Ficheiro S1) analisado através de UV-Vis-NIR espectrofotometria como uma medida de estabilidade NR, rastreio de uma gama de concentrações de BSA (0-30 mg /mL) utilizadas nos dois método de revestimento -passo levou à identificação de um protocolo óptimo consiste em 0,1 mg de dopamina /mL para o revestimento de CTAB PD-NRs seguido de estabilização em ≥10 mg /ml de BSA. Sob essas condições ideais, agregação de BSA-PD-NRs era sete vezes menos em comparação com PD-NRs (Fig B no Arquivo S1). Todas as experiências subsequentes foram realizados sobre Pd-NRs modificados a 20 mg /mL de BSA, a fim de assegurar a completa passivação da subcamada DP que podem de outro modo servir para promover a agregação AuNR. AuNRs (20 x 60 nm) modificados com PD e BSA (20 mg /mL) foram fotografadas através de TEM seguinte contracoloração com ácido fosfotúngstico para proporcionar contraste para a camada orgânica BSA. A medição da camada ~ 15 nm de espessura foi visualizado no bem-separados BSA-PD-NRs no modo SE (Fig 2A). A atenuação do sinal de XPS Au4f de uma superfície de ouro observados após exposição a dopamina e BSA é consistente com a deposição de um revestimento de paládio seguido por enxerto de BSA (Fig C em Ficheiro S1).

(A) por microscopia electrónica de BSA-PD-NRs no modo de elétrons secundários. Barra de escala = 600 nm; Inset = 50 nm; (B) dicroísmo circular de vs. modificado NRs ouro não modificado. NRs-BSA modificados foram modificados com 10 ou 20 mg /mL de BSA, como indicado. A concentração de BSA de controlo foi de 0,25 mg /mL. desnaturação da proteína na formação β-folha é indicado no NRs tratados com PD modificados com uma concentração sub-óptima de BSA. Caso contrário, estrutura secundária BSA é preservada, como quantificado pelo respectivo propensão α-helicoidal de cada modificação.

AuNRs foram ainda avaliadas através de espectroscopia UV-Vis-NIR para analisar mudanças na posição longitudinal de pico LECC (Fig B em ficheiro S1). BSA-DP-NRs demonstrou um desvio para o vermelho de plasmão de 10 nm, devido a alterações no ambiente dieléctrico locais resultantes dos acontecimentos de adsorção de superfície. Essa mudança no máximo LECC comprimento de onda, Δλ

max, corresponde a uma espessura adsorvida

d

de 15 nm com base na equação [57, 58], (3) Onde

m

é a resposta do índice de refração maior parte da nanopartícula, Δ

n

é a mudança do índice de refração induzida pelas espécies adsorventes, e

l

d

é o comprimento de decaimento do campo electromagnético. Esta espessura calculada está de acordo com nossas observações TEM (Fig 2A). Além disso, as medições Ç-potencial foram registados para rastrear AuNR biofunctionalization e são reportados na Tabela 1. A variação gradual no ζ-potencial com PD e modificação de BSA culminou com um revestimento de BSA carregada negativamente.

BSA ligação a DP-NRs ocorreu muito provavelmente através de mecanismos não covalentes descritos acima ou por acoplamento covalente a qualquer um dos 60 resíduos de lisina disponíveis superfície [38]. experiências paralelas realizadas em não tratados de CTAB-NRs disperso em 10 mg /ml de BSA não deu uma suspensão estável, indicando a importância da DP no reforço de BSA passivação. Embora concentrações mais elevadas de BSA foram encontrados para estabilizar CTAB-AuNRs na ausência de paládio como indicado por experiências de sedimentação (fig B em Ficheiro S1) e ELISA (dados não mostrados), estas construções de falha para facilitar a imobilização de anticorpo óptima em experiências posteriores.

A estrutura terciária da albumina do soro é composta por três domínios (I-III), que são mais organizados em nove ciclos por 17 ligações dissulfureto [59]. Notavelmente, BSA mantém um único resíduo de sulfidrila livre em Cys-34, cuja presença está implicado em ambos quelação de metais ea atividade de eliminação de radicais livres [60]. Em condições fisiológicas, BSA mantém 67% de teor de α-helicoidal, 10% beta-voltas, e 23% estendeu cadeias [59, 61]. A pH fisiológico BSA mantém uma carga líquida negativa (pI = 4,7), contribuindo para a sua excelente solubilidade em água, apesar de uma diminuição da carga efectiva é esperado como uma função do aumento do pH da solução [59, 62], elucidar a importância potencial de interacções electrostáticas em albumina de ligação a CTAB ou superfícies polydopamine modificado. Mais importante, a adsorção de electrostaticamente conduzido negativamente carregados de BSA a pH 8,5 a superfícies decoradas AuNR por grupos de cabeça de amónio catiónicos CTAB foi encontrada para induzir alguma desnaturação da estrutura secundária α-helicoidal através de CD como observado (Fig 2B).

propusemos adsorção mediada por polydopamine de BSA, como uma estratégia simples para melhorar a estabilidade coloidal das suspensões nanorod ouro, enquanto minimiza o impacto para a estrutura secundária da proteína de revestimento. Descobrimos que a BSA-PD-NRs eram capazes de manter uma maior propensão α-helicoidal (P (α) = 0,899) em comparação com homólogos de BSA somente modificados (p (α) = 0,824), e que esta relação se aproximou mais de perto a padrão de controlo de BSA (0,25 mg /ml, P (α) = 0,917). A propensão elevada alfa-helicoidal é considerada vantajosa, como a desnaturação pode conduzir à exposição indesejada de domínios imunoestimulantes em BSA [42, 63]. Além disso, uma modificação electrostaticamente conduzido como seria o caso na ausência de DP, podem ser instáveis ​​em ambientes fisiológicos [11], permitindo o deslocamento de passivação de BSA por proteínas de maior afinidade que podem conduzir à eliminação de nanopartículas através do sistema reticuloendotelial [64 ]. Desnaturação parcial de BSA pode revelar e perturbar ligações dissulfureto internas, que foram mostrados para contribuir para a ligação através de interacções Au-tiol [65].

Surpreendentemente, BSA-PD-NRs preparado no sub-óptima de 10 mg /mL As concentrações de BSA agregados como beta-sheets desnaturadas (Figura 2B).