Abstract

Purpose

Nós investigamos os efeitos do interferon-a2A peguilado (PEG-IFN- a2A) sobre o crescimento de células de cancro do fígado humano.

Métodos

o efeito de PEG-IFN-a2A sobre a proliferação de linhas celulares de cancro do fígado foi investigada 13

em

vitro

. As células foram cultivadas com meio contendo 0-4,194 ng /mL de PEG-IFN-a2A, e após 1, 2, 3 ou 4 dias de cultura, a observação morfológica e ensaio de crescimento foram realizadas. Depois de células (HCC) de carcinoma hepatocelular (HAK-1B e de KIM-1) foram transplantadas em ratinhos nus, várias doses de PEG-IFN-a2A foram administradas subcutaneamente aos ratinhos, uma vez por semana durante 2 semanas, e o volume do tumor, em peso, e histologia foram examinados.

resultados

PEG-IFN-a2A inibiu o crescimento de 8 e 11 linhas celulares de uma forma tempo e dependente da dose, respectivamente, embora as concentrações de inibição do crescimento de 50% de 7 linhas celulares mensuráveis ​​no dia 4 eram relativamente elevados e variaram de 253 ng /mL até 4.431 ng /mL. Vários níveis de indução de apoptose foram confirmadas em 8 linhas celulares. PEG-IFN-a2A induziram uma diminuição dependente da dose no volume de tumor e peso, e um aumento significativo de células apoptóticas no tumor. A administração subcutânea da dose clínica para a hepatite C crónica (3 ug /kg, 0,06 ug /rato) foi eficaz e induziu uma redução cerca de 30-50% do volume de tumor e peso em comparação com o controlo.

Conclusões

Embora

em

in vitro

efeitos anti-proliferativa de PEG-IFN-a2A eram relativamente fracos, PEG-IFN-a2A induziu efeitos anti-tumorais fortes em células do CHC

em

vivo

. Os dados sugerem potencial aplicação clínica de PEG-IFN-a2A para a prevenção e tratamento da HCC

Citation:. Kusano H, Akiba J, Ogasawara S, Sanada S, Yasumoto M, Nakayama M, et al. (2013) interferon peguilado a2a inibe a proliferação de células cancerígenas do fígado

In Vitro

e

In Vivo

. PLoS ONE 8 (12): e83195. doi: 10.1371 /journal.pone.0083195

editor: Diego CALVISI, Institut für Patologia, Greifswald, Alemanha, Alemanha |

Recebido: 19 Agosto, 2013; Aceito: 10 de novembro de 2013; Publicação: 12 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Kusano et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pelas Cousins ​​Sarah Memorial Fund, Boston, Massachusetts, e por um Grant-in-Aid do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os interferões (IFNs) são tipos de citoquinas que são produzidas por células hospedeiras, tais como leucócitos, em resposta à inflamação. Uma vez que os IFNs possuem actividade antiviral, antiproliferativa e actividade de várias actividades imunorreguladoras, terapia com IFN é usado para tratar doentes com hepatite crónica virai ou de certos tipos de cancro, incluindo o melanoma maligno, relacionados com o síndrome da imunodeficiência adquirida sarcoma de Kaposi e alguns tumores hematopoiéticos [1,2]. Lai et ai mostraram também que IFN recombinante é útil no prolongamento da sobrevivência entre os pacientes com carcinoma hepatocelular inoperável (HCC) [3]. Além disso, alguns estudos mostraram terapia IFN pode impedir que qualquer ocorrência ou recorrência após terapia curativa inicial de HCC, como a ressecção hepática e ablação por radiofrequência, em paciente com hepatite viral crônica [4-7]. Este efeito preventivo do cancro de IFN é considerada principalmente como resultado do seu efeito anti-viral e a consequente supressão da inflamação, e pode ser devido ao seu efeito antitumoral directa contra HCC indetectável clinicamente bem. O mecanismo detalhado do efeito antitumoral dos IFN, no entanto, permanece obscura.

interferão peguilado a2a (PEG-IFN-a2A) e interferão-a2B (PEG-IFN-a2B), que são utilizados para tratar pacientes com vírus da hepatite C crónica (HCV) ou vírus da hepatite B (VHB) infecção, são IFNs que têm uma meia-vida mais longa no soro de corpo do que as formas não peguilados de IFNs, portanto, eles podem ser dadas aos pacientes uma vez por semana modificado, enquanto que um IFN padrão sem peguilação usadas para ser injectada até três a cinco vezes uma semana. Esta injecção de uma vez por semana de IFN peguilado em combinação com a administração oral diária da ribavirina análogos de nucleosídeo melhorou substancialmente a taxa de resposta virológica sustentada em pacientes com infecção crônica de HCV e tem uma posição como a terapia de primeira linha [8,9] . Nós relatado anteriormente que o PEG-IFN-a2B que contém de 12 kDa de polietileno glicol (PEG) tem efeitos antitumorais mais fortes

in vivo do que os IFNs

não peguilados e este resultado pode ser o que indica que a exposição contínua a IFN de células cancerosas no organismo é mais eficaz do que a injecção contínua [10]. Com base no fundo acima descrito, examinámos efeitos inibidores do crescimento de PEG-IFN-a2A, que contém duas cadeias de PEG de 20 kDa e tem a sua meia-vida mais longa no soro entre os IFNs clinicamente disponíveis em linhas celulares de cancro do fígado

em vitro

e

in vivo

.

Métodos

linhas celulares e Cultura de células

Este estudo utilizou 11 linhas de células de carcinoma hepatocelular (KIM-1, KYN-1, KYN-2, KYN-3, HAK-1A, HAK-1B, HAK-2, HAK-3, HAK-4, HAK-5, e HAK-6) e 2 humana combinada hepatocelular e colangiocarcinoma (CHC ) linhas celulares (KMCH-1 e KMCH-2). Estas linhas de células de carcinoma hepatocelular e CHC foram originalmente estabelecidos em nosso laboratório, e cada linha de células mantém as características morfológicas e funcionais do tumor original, como descrito em outros lugares [11-20]. Desde tumorigenicidade é maior em HAK-1B e células KIM-1 do que nas outras linhas 11 celulares que temos, nós usamos estas duas linhas celulares de

in vivo

estudo.

As células foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (Nissui Seiyaku, Co., Japão) suplementado com 2,5% inactivado pelo calor (56 ° C, 30 min) soro fetal bovino (FBS, Bioserum, Victoria, Austrália ), 100 U /mL de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina (Gibco BRL /Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD) e 12 mmol /L de bicarbonato de sódio, em uma atmosfera humidificada de 5% de CO

2 no ar a 37 ° C.

IFN e Reagentes

PEG-IFN-a2A (PEGASYS

®, Chugai Pharmaceutical Co., Ltd., Tóquio, Japão) com a actividade específica de 1,4 X 10

7 IU /mg de proteína e não peguilado IFN-a2a (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Alemanha) com a de 2,0 X 10

8 IU /mg de proteína foram utilizados no estudo.

anti-bromodesoxiuridina anticorpo (BrdU) e imunoglobulina de fluoresceína de cabra anti-ratinho conjugado com isotiocianato de (FITC-GAM) foram adquiridos a Becton Dickinson Immunocytometry Sistemas EUA (San José, CA); controlar o mouse normal de IgG

1, da Dako (Glostrup, Dinamarca); anticorpo de rato contra células endoteliais de ratinho (anti-CD34, clone MEC14.7), a partir de Serotec Co., Reino Unido; e o anticorpo monoclonal de ratinho contra a actina de músculo liso-α humano (SMA), que reage de forma cruzada com α-SMA de ratinho (clone 1A4).

Efeitos de PEG-IFN-a2A sobre a proliferação de HCC e CHC Linhas Celulares

in vitro

os efeitos de PEG-IFN-a2A sobre o crescimento das células de cultura foram examinadas com colorimetria, utilizando 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5- difenil tetrazólio (MTT) estojos de ensaio (Chemicon, Temecula, CA) como descrito noutro local [18,21]. Resumidamente, as células (1,5 ~ 8 X 10

3 células por poço) foram semeadas em placas de 96 poços (Nunc, Inc., Roskilde, Dinamarca), em cultura durante 24 horas, e o meio de cultura foi alterado para um meio novo com ou sem PEG-IFN-a2A (0,016, 0,064, 0,256, 1,024, 4,096, 16,4, 65,5, 262, 1048, ou 4194 ng /ml). Após cultura durante 24, 48, 72 ou 96 horas, o número de células viáveis ​​foi medida com ImmunoMini NJ-2300 (Nalge Nunc International, Tóquio, Japão), definindo o comprimento de onda de teste a 570 nm e o comprimento de onda referência a 630 nm. Para manter a densidade óptica dentro de intervalo linear, todas as experiências foram realizadas enquanto as células estavam na fase de crescimento logarítmica.

A análise quantitativa de células apoptóticas induzidas por PEG-IFN-a2A

HAK-1B ou de KIM-1 de células cultivadas com meio sozinho (controlo), não tratado com PEG IFN-a2a (10 ng /ml = 2000 UI /ml) ou PEG-IFN-a2A (144 ng /ml = 2000 UI /ml) durante 72 horas foram coradas com anexina V-EGFP (reforçada proteína uorescente FL verde) Apoptosis Detection Kit (Medical Biological Laboratories Co., Ltd.) de acordo com as instruções do fabricante. Após a coloração, as células foram analisadas usando um FACScan (Becton Dickinson Immunocytometry Sistemas, San Jose, CA) e anexina-V-positivas a EGFP taxa celular por apoptose foi determinada.

morfológica Observação

Para a observação morfológica sob um microscópio de luz, células cultivadas foram semeadas em lâminas Lab-Tek de cultura de tecidos de câmara (Nunc, Inc.), cultivadas com ou sem PEG-IFN-a2A (262, 1048 ou 4194 ng /ml) durante 72 horas, fixadas durante 10 min em solução de Carnoy, e coradas com hematoxilina-eosina (HE).

Efeitos de PEG-IFN-a2A em HCC proliferação celular em ratos pelados

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê institucional para experiências com animais em Kurume University School of Medicine (Permit número de telefone: 1334) , e conduzida de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do Instituto Nacional de Saúde e do Regulamento de Experimentação animal da Kurume University School of Medicine. Os ratos foram sacrificados por deslocamento cervical sob anestesia com éter dietílico, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento. Cultured HAK-1B ou de KIM-1 (10

7 células /murganho) por via subcutânea (SC) injectada nas costas de /c machos de 5 semanas de idade atímicos nu fêmea BALB (CLEA Japan, Inc., Osaka, Japão ). Cinco a sete dias mais tarde, quando o maior diâmetro do tumor, que foi medida utilizando compasso de calibre, atingiu cerca de 5 ~ 10 mm (dia 0), o volume do tumor (mm

3) foi calculada pela equação ‘o maior diâmetro X (o diâmetro menor)

2 X 0,5 ‘, e, em seguida, os ratinhos foram divididos em 5 grupos (n = 8 cada). O volume do tumor foi medido no dia 0, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, e 14. Rato de peso corporal foi medida no Dia 0, 8, e 14. Depois de tratamento de 2 semanas, os ratinhos foram mortos no Dia 15 e o peso do tumor real também foi medido. Na Experiência 1, os 5 grupos de 8 ratinhos receberam ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Controlo) ou com PBS as diferentes doses de PEG-IFN-a2A (0,06-60 ug), uma vez por semana durante 2 semanas consecutivas (dia 1 e dia 8). A dose clínica do PEG-IFN-a2A no tratamento da hepatite C crónica é de cerca de 3 ug /kg e é equivalente à dose mais baixa (0,06 ug /rato = 840 UI /rato) nesta experiência. Depois de matar, tumores ressecados foram usadas para estudos morfológicos (por exemplo, coloração de HE e imunohistoquímica) e análise Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Cada ratinho recebeu uma injecção intraperitoneal de 1 mg de BrdU 30 min antes de matar. Na experiência 2, para examinar a diferença entre os IFNs não peguilados e peguilados, 5 grupos de 8 ratinhos receberam quer PBS (controlo), PBS com 0,0042 ou 0,042 ug de IFN-a2a (840 ou 8400 UI, respectivamente), ou PBS com 0,06 ou 0,6 mg de PEG-IFN-a2A (840 ou 8400 UI, respectivamente). Nesta experiência, os pesos dos tumores no dia 15 e o número de células apoptóticas foram comparadas entre os grupos.

Exame morfológico da subcutânea tumores de ratinhos nus

O número de células que apresentam as características de apoptose (por exemplo, encolhimento citoplásmico, condensação de cromatina e fragmentação nuclear) foi contado em pelo menos três 0,25 mm

foi obtida 2-áreas dentro de um espécime em HE, e o número médio por área. A técnica de TUNEL (ApopTag

® peroxidase

In Situ

apoptose Kits de Detecção, Chemicon International, Inc., CA) foi usado para detectar células apoptóticas, e obteve-se o número médio de células positivas TUNEL por área, como descrito acima. As amostras também foram imunocoradas para BrdU incorporada utilizando coloração BrdU Kits (Oncogene Research Products, Boston, MA), e o número médio de células positivas por área foi obtido como descrito acima. Além disso, duas vezes imunocoloração foi realizada com o anticorpo de célula endotelial anti-ratinho, anticorpo α-SMA anti-humano, Histofine simples mancha rato MAX-PO (rato) kits (Nichirei, Tóquio, Japão), e HistoMouse ™ kits para -plus detectar vasos sanguíneos arteriais-like como descrito em nosso relatório anterior [21,22]. O número de vasos sanguíneos dupla imuno-positivas no tumor foi contado em cada espécime. O tecido de granulação no interior do tumor foram excluídos na contagem de vasos sanguíneos. O tamanho da área contado foi medida traçando o contorno exibido em um monitor de computador usando Mac SCOPE (Mitani Corp., Chiba, Japão). A partir do número de vasos obtidos por unidade de área (mm

2), a média do grupo foi obtido por comparação dos grupos.

ensaio imunossorvente ligado a enzima (ELISA)

Porções da ressecado tumores de xenoenxerto foram homogeneizados em 500 mL de gelo frio-Ca

2+ e mg

2 + livre de PBS contendo 100 mg /ml de fluoreto phenymethylsulfonyl utilizando um pilão de sedimento. A mistura foi centrifugada durante 10 minutos (12000 g, 4 ° C), e o sobrenadante foi armazenado a -20 ° C até à sua utilização. Após a determinação da quantidade da proteína de tecido no sobrenadante utilizando um reagente de ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL), a quantidade de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e IL-8 foi medida usando kits de ELISA comercialmente disponíveis ( R D Systems, Minneapolis, MN)

Estatísticas

comparações de volume de tumor estimado e crescimento celular colorimétrico foram realizadas utilizando de dois fatores fatorial ANOVA e Student do

t

-. testar, respectivamente. As outras comparações de dados foram realizadas utilizando o teste de Mann-Whitney.

Resultados

Efeitos de PEG-IFN-a2A no cancro do fígado de Proliferação Celular

in vitro

Vinte e quatro horas após a adição de 4,194 ng /ml de PEG-IFN-a2A, ligeiro aumento no número de células viáveis ​​em relação ocorreu em 9 linhas celulares (todas as linhas celulares excepto KYN-2, HAK-1A, HAK- 6, e KMCH-1). No entanto, após 72 horas ou mais tarde, uma diminuição de 10% ou mais do número de células ocorreu em todas as linhas celulares (Figura 1A). Em HAK-2, 3-HAK, e HAK-4, 6-HAK, e KMCH-2, proliferação foi suprimida até 72 horas e o número de células atingiu um patamar ou ligeiramente aumentado posteriormente. Nas outras linhas 8 celulares a proliferação foi suprimida em graus variados até 96 horas.

(A) alterações cronológica em número de células viáveis ​​relativa (% do controle) após a adição de 4.194 ng /mL de PEG-IFN-a2A. O crescimento foi suprimida com o tempo em 8 linhas celulares. (B) 96 horas após a adição de 10 diferentes concentrações de PEG-IFN-a2A. A proliferação celular foi suprimida de uma forma dependente da dose em 11 linhas de células. A supressão foi significativa (

P

0,0001 ~ 0,05) nos intervalos de 0,016 ~ 4,194 ng /ml de PEG-IFN-a2A em HAK-6, 0,256 ~ 4,194 ng /mL em KYN-3 e HAK-1A, 4,096 ~ 4,194 ng /mL em KIM-1, KYN-1, HAK-1B, HAK-2 e KMCH-2, 16,4 ~ 4194 ng /mL em KYN-2, HAK-5 e KMCH-1, 262 ~ 4.194 ng /mL em HAK-4, e em 4.194 ng /mL em HAK-3 (Student

t

-teste). Oito amostras foram usadas em cada ensaio (n = 8). A experiência foi repetida pelo menos 3 vezes para cada linha celular. Os valores representam média ± SE de experimentos.

O número de células viáveis ​​em relação foi suprimido em 11 linhas de células (todas as linhas celulares excepto HAK-1A e KMCH-2) de uma forma dependente da dose depois de 96 horas de incubação com PEG-IFN- a2a (Figura 1B). Em 7 linhas celulares (HAK-1B, KMCH-1, de KIM-1, KYN-1, Hak-6, KYN-3, e KYN-2), o número foi suprimida a 50% ou menos com 4194 ng /mL de PEG-IFN-a2A, e a concentração inibitória de 50% (IC50) foi de 253 ng /mL para HAK-1B, 670 ng /mL para KMCH-1, 1105 ng /mL para o de KIM-1, 1128 ng /mL para KYN- 1, 1302 ng /mL para HAK-6, 1524 ng /mL para a KYN-3, e 4,431 ng /mL para a KYN-2. Não foi detectada relação entre o nível de diferenciação histológica do tumor original e sensibilidade ao efeito anti-proliferativo de PEG-IFN-a2A.

Setenta e duas horas após a adição de 4,194 ng /ml de PEG-IFN-a2A , 8 linhas celulares (todas as linhas celulares excepto KYN-3, HAK-1A, HAK-2, HAK-3, e KMCH-2) mostrou características de apoptose, por exemplo, encolhimento citoplásmico, condensação de cromatina e fragmentação nuclear, em vários graus e de um modo dependente da dose (Figura 2). O aparecimento de apoptose foi ainda confirmada em HAK-1B e as células de KIM-1 cultivadas com 10 ng /ml (= 2000 UI /ml) de IFN-a2A ou 144 ng /ml (= 2000 UI /ml) de PEG-IFN- a2A pelo ensaio de detecção de apoptose (Tabela 1). Não peguilado IFN-a2A induziu apoptose muito mais do que o PEG-IFN-a2A.

(A) Sem PEG-IFN-a2A em meio de cultura. (B) com 4194 ng /mL de PEG-IFN-a2A em meio de cultura. células em apoptose (setas curtas) caracterizadas pela retração citoplasmática, condensação cromática e fragmentação nuclear foram observadas (coloração HE, X 200).

anexina V-EGFP células em apoptose (%)

linha celular

a

Controle

IFN-a2A

PEG-IFN-a2A

HAK- 1B4.1 ± 0,5

b18.5 ± 0.310.9 ± 0.5KIM-19,4 ± 0.447.0 0.229.8 ± ± 2.1Table 1. a análise quantitativa de apoptose em HAK-1B ou KIM-1.

a As células foram cultivadas com meio sozinho (controlo), o IFN-a2a (10 ng /ml = 2000 UI /ml) ou PEG-IFN-a2A (144 ng /ml = 2000 UI /ml).

b Média ± SE. CSV Baixar CSV

Efeitos de PEG-IFN-a2A em HCC proliferação celular em ratos pelados

mudanças Cronológico no volume do tumor estimado após a injecção subcutânea de cultura HAK-1B ou Kim-1cells para ratos nus estão resumidos na Figura 3. supressão dependente da dose do volume do tumor foi observada em ratinhos que receberam o PEG-IFN-a2A. No experimento de tumores HAK-1B, foi observada uma diferença significativa nas mudanças no volume do tumor e do tumor de peso entre os ratinhos de controlo e os ratos que receberam 0,06, 0,6, 6 ou 60? G de PEG-IFN-a2A (

P Art 0,0001 por dois fatores fatorial ANOVA; e

P Art 0,001 ~ 0,02 pelo teste de Mann-Whitney U, Figura 3A e Tabela 2). No experimento de KIM-1 de tumores, uma redução significativa do volume do tumor também foi observada com o uso de PEG-IFN-a2A (

P

0,001 por-dois factores ANOVA factorial, Figura 3B). Houve diferenças significativas no peso do tumor real entre o grupo controle e os grupos PEG-IFN-a2A, exceto para o PEG-IFN-a2A (0,06 g) grupo (Tabela 2). O peso do tumor verificada no final da experiência 2 foi resumido na Tabela 3. A injecção subcutânea de 0,6 mg de PEG-IFN-a2A induzida a redução significativa do peso do tumor, em comparação com o grupo de controlo e o grupo que recebeu a mesma unidade internacional de não peguilado IFN-a2a (

P

0,005 e

P

0,03, respectivamente). Neste experimento, não houve diferença significativa entre o grupo controle eo grupo PEG-IFN-a2A (0,06 g) (

P

= 0,078).

Os ratinhos receberam uma injecção subcutânea de 0,06 (▲), 0,6 (○), 6 (●), ou 60 (Δ) ug de PEG-IFN-a2A, ou meio sozinho (controlo) (□) , uma vez por semana durante 2 semanas consecutivas. As setas indicam os dias da injecção. Os números representam média ± SE. *

P Art 0,0001, contra os outros grupos. †

P Art 0,01, contra os outros grupos.

peso do tumor (g)

grupo Tratamento

a

HAK-1B

KIM-1 | Control0.303 ± 0,05

b,

c1.050 ± 0,24

Epeg-IFN-a2A (0,06 g) 0,141 ± 0,03

d0.725 ± 0,17

FPEG-IFN-a2A (0,6 mg) 0,033 ± 0.010.439 ± 0.04PEG- O IFN-a2a (6 ug) 0,015 ± ± 0.010.434 0.04PEG-IFN-a2A (60 ug) 0,0 0,076 ± 0.05Table 2. O peso dos tumores subcutâneos de HAK-1B ou de KIM-1 de células em ratinhos nus em matar ( experimento 1).

a Cultivadas HAK-1B ou KIM-1 células (1,0 X 10

7) foram transplantados subcutaneamente em ratinhos nus. Cinco grupos de 8 ratinhos receberam ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Controlo) ou com PBS as diferentes doses de PEG-IFN-a2A (0,06-60 ug), uma vez por semana. Todos os ratinhos foram mortos e o peso do tumor foi medido no dia 15.

b Média ± SE.

c

P Art 0,02 versus o grupo de PEG-IFN-a2A (0,06 g);

P Art 0,001, versus o grupo de PEG-IFN-a2A (0,6 ug);

P Art 0,001, versus o grupo de PEG-IFN-a2A (6 ug).

d.

P Art 0,02 versus PEG-IFN-a2A (60 ug).

E não foi significativa, em relação ao grupo de PEG-IFN-a2A (0,06 g);

P Art 0,03 versus o grupo de PEG-IFN-a2A (0,6 ug);

P Art 0,05 versus o grupo de PEG-IFN-a2A (6 ug);

P Art 0,01 versus o grupo de PEG-IFN-a2A (60 ug).

f.

P Art 0,05 versus o grupo de PEG-IFN-a2A (60 ug). CSV Baixar grupo Tratamento CSV

a atividade

de interferon (IU)

peso do tumor (g)

apoptose (Número de células /0,25 milímetros

2)

Control0 IU0.726 ± 0,09

b, c7.6 ± 0,9

dIFN-a2A (0,0042 g) 840 IU0.588 ± 0,07

d7.9 ± 0,9

gIFN-a2A (0,042 ug) 8.400 IU0.531 ± 0,04

e7.6 ± 0,7

hPEG-IFN-a2A (0,06 g) 840 IU0.493 ± 0,04

f8.9 ± 0.9PEG-IFN-a2A (0,6 mg) 8.400 IU0.355 ± 0,03 9,7 ± 1,0 * Tabela 3. O peso real eo número de células em apoptose de tumores subcutâneos em matar (Experimento 2).

a células cultivadas HAK-1B (1,0 X 10

7) foram transplantados subcutaneamente em ratinhos nus. Cinco grupos de 8 ratinhos receberam quer PBS (controlo), PBS com 0,0042 ou 0,042 ug de IFN-a2a (840 ou 8400 UI, respectivamente), ou PBS com 0,06 ou 0,6 pg de PEG-IFN-a2A (840 ou 8400 UI, respectivamente). Todos os ratinhos foram mortos e o peso do tumor foi medido no dia 15. O número de células apoptóticas foi contado em pelo menos três 0,25 milímetros

2-áreas em cada secção corada com hematoxilina e eosina, e o número médio por área em cada grupo foi obtida.

b Média ± SE.

c

P Art 0,005, versus o grupo de PEG-IFN-a2A (0,6 ug).

d

P Art 0,02 versus o grupo de PEG-IFN-a2A (0,6 ug).

e

P Art 0,03 versus o grupo de PEG-IFN-a2A (0,6 ug).

f

P Art 0,02 versus o grupo de PEG-IFN-a2A (0,6 ug).

g

P Art 0,05 versus o grupo de PEG-IFN-a2A (0,6 ug).

h

P Art 0,001, versus o grupo de PEG-IFN-a2A (0,6 ug). CSV Transferir CSV

O exame histológico dos espécimes de tumor de HAK-1B coradas com HE revelou que o número de células apoptóticas nos ratinhos tratados com PEG-IFN-a2A (0,06 ou 0,6 ug) foram significativamente maiores do que a do controlo, e o número aumentou dependente da dose (Figura 4, a e B, Tabela 4). A incidência de apoptose em secções de TUNEL-corados mostrou as mesmas tendências que o obtido com cortes corados com HE (Figura 4C e a Tabela 4). O exame imunoistoquímico de absorção de BrdU em tumores HAK-1B revelou que não havia nenhuma diferença significativa no índice de marcação de BrdU entre o controle e grupos de PEG-IFN-a2A (0,06 ou 0,6 ug) (Tabela 4). Quanto à apoptose, achados similares foram observados no experimento 2, em que foi utilizado KIM-1. O grupo tratado com 0,6 mg de PEG-IFN-a2A mostraram um aumento do número de células apoptóticas do que o grupo controlo. Não houve diferença significativa entre o grupo controle e IFN-a2A. Além disso, o grupo tratado com 0,6 mg de PEG-IFN-a2A (8400 UI) apresentaram maior número de células apoptóticas do que aqueles com 0,042 ug de IFN-a2a (8400 UI).

(A) Um controle rato que receberam meio de cultura. O tumor apresenta uma disposição compacta de células tumorais e uma estrutura semelhante a sinusóide no estroma. (B) Um rato que recebeu uma s.c. injecção de 0,06 ug de PEG-IFN-a2A. Existem algumas células tumorais apoptóticas caracterizado pelo encolhimento e mudança eosinofílica no citoplasma, condensação da cromatina e /ou fragmentação dos núcleos (setas, a coloração em HE, X200). (C) O mesmo tumor como mostrado em (B). Existem algumas células TUNEL-positivos mostrando núcleo marrom (setas, manchado pela técnica TUNEL, X200).

Apoptose

b (Número de células /0,25 milímetros

2)

BrdU índice de marcação

c (número de células positivas /0,25 milímetros

2)

grupo Tratamento

a

HE

método TUNEL

Controle 8,4 ± 0,8

d, e 9,6 ± 1,1

e32.3 ± 1,6

FPEG-IFN-a2A (0,06 g) de 12,2 ± 1.015.4 1.827.0 ± ± 2.6PEG-IFN-a2A (0,6 mg) 12,4 ± 0.916.1 1.531.3 ± ± 6.9Table 4. O número de células em apoptose e células positivas para BrdU em tumores HCC humanos transplantados subcutaneamente em ratinhos nus.

a células cultivadas HAK-1B (1,0 X 10

7) foram transplantadas subcutaneamente em ratinhos nus. Cinco grupos de 8 ratinhos receberam ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Controlo) ou com PBS as diferentes doses de PEG-IFN-a2A (0,06-60 ug), uma vez por semana. Os tumores de murganhos que receberam 6 ou 60? G de PEG-IFN-a2A não poderia ser utilizado porque os tumores eram demasiado pequenas para avaliar. Todos os ratos foram mortos no 15º dia.

b O número de células em apoptose foi contado em pelo menos três 0,25 milímetros

2-áreas em cada seção corados com hematoxilina e eosina, e o número médio por área em cada grupo foi obtido. O número de células positivas TUNEL foram também considerados da mesma forma.

c O número de células positivas para BrdU foi contado em pelo menos três 0,25 milímetros

2-áreas em cada seção, eo número médio por área em cada grupo foi obtido como o índice de marcação.

D média ± SE.

e

P Art 0,02, contra os outros grupos.

f. Não significativo, contra os outros grupos. CSV Transferir CSV

O tumor ressecado do grupo de PEG-IFN-a2A mostrou tecido de granulação no meio do tumor para vários graus (Figura 5). Artérias que apareceram no tecido de granulação foram excluídos no vaso sanguíneo contar dentro do tumor. Não houve diferença significativa no número de vasos sanguíneos por unidade de área dentro do tumor HAK-1B e a expressão de bFGF e IL-8 nos tumores entre o grupo de PEG-IFN-a2A e o grupo de controlo (Figura 5; Tabela 5 ). As células tumorais

(A) são substituídos com grande tecido de granulação no meio do tumor ressecado. (Pontas de seta, coloração HE, X20). (B) Os navios de Artéria-like sanguíneos no tumor (seta, HE coloração, X200). (C) dos vasos sanguíneos Artéria-like no tumor (seta, CD34 /α-SMA double-imunocoloração, X200).

Artéria-como vasos sanguíneos

b (Número de vasos /mm2 )

níveis no lisado de tumor

c (pg /40 g de proteína celular)

grupo Tratamento

a

Dentro de tumor

bFGF

IL-8

Control0 0,104 ± 0,02

d, e14.0 ± 1,8

e2.8 ± 1,0

Epeg-IFN-a2A (0,06 g) 0,194 ± 0.0519.8 ± 2.14.9 ± 1.3Table 5. Números de vasos sanguíneos arteriais semelhante, e Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) de factores de angiogénese em tumores HCC humanas transplantadas subcutaneamente em ratinhos nus.

a células cultivadas de HAK-1b (1,0 X 10

7) foram transplantadas subcutaneamente em ratinhos nus. Cinco grupos de 8 ratinhos receberam ou solução salina tamponada com fosfato (PBS) (Controlo) ou com PBS as diferentes doses de PEG-IFN-a2A (0,06-60 ug), uma vez por semana. Os tumores de murganhos que receberam 0,6, 6 ou 60? G de PEG-IFN-a2A não poderia ser utilizado porque os tumores eram demasiado pequenas para avaliar. Todos os ratos foram mortos no 15º dia.

b O número de vasos sanguíneos arteriais-like dentro do tumor foi contado em cada seção, e obteve-se o número médio por área em cada grupo.

C Os níveis de factor de crescimento de fibroblastos básico (bFGF) e IL-8 dos tumores ressecados expressão foram medidos por ELISA.

D média ± SE.

e. Não é significativa, em relação ao grupo de PEG-IFN-a2A (0,06 ug). CSV Baixar CSV

Discussão

in vitro

estudo, mostramos que o PEG-IFN-a2A inibir o crescimento de 8 e 11 de 13 linhas de células em um tempo e maneira dose-dependente, no entanto, o PEG-IFN-a2A foi aparentemente menos activo em uma base de IC50, em comparação quer com PEG-IFN-a2B ou IFN-a2B ou consenso de IFN-α ou BALL-1 linfoblastóide IFN-α que foi testado em a mesma condição experimental em nossos relatórios anteriores [10,18,21]. Por exemplo, a CI 50 para as células de HAK-1B foi de aproximadamente 253 ng /ml de PEG-IFN-a2A, 13,1 ng /ml de PEG-IFN-a2B, 2,4 ng /ml de IFN-a2B, 0,7 ng /ml de IFN- consenso a e 1,1 ng /ml de BALL-1 linfoblastóide IFN-α. Por outro lado, no

in vivo

estudo, s.c. injecção de PEG-IFN-a2A, uma vez por semana mostrou o melhor efeito anti-tumor numa base de volume ou peso do tumor, em comparação com a de não peguilado IFN-a2A. Estes resultados podem apoiar a nossa hipótese de que um contacto permanente com IFN induz

In vivo

fortes efeitos anti-tumorais, e não é surpreendente porque foi relatado que PEG-IFN-a2A mostraram menos atividade ativo in vitro antiviral e mas tinha muito mais

in vivo

atividade antitumoral do que IFN-a2A não peguilado [23]. Também mostrou que o PEG-IFN-a2A pode inibir a proliferação de linhas de células CHC, bem como o HCC. No ensaio MTT, o crescimento de KMCH-1 foi também suprimida embora uma outra linha de células CHC, KMCH-2 não foi. Uma possível explicação para a diferença de sensibilidade entre KMCH-1 e KMCH-2 é que a origem de KMCH-1 é CHC, tipo clássico e que de KMCH-2 é CHC com características de células-tronco, o subtipo de células intermediário de acordo com a mais recente Classificação da OMS [24]. Tais propriedades de uma haste de células do tumor pode ser a razão para a resistência à IFN. Outro achado interessante no

in vitro

estudo é a discrepância entre os resultados de ensaios de MTT e detecção de apoptose. Quando HAK-1B ou de KIM-1 foi cultivada com PEG-IFN-a2A, IC50 para HAK-1B foi muito menor do que para KIM-1, embora HAK-1B mostrou menor taxa de células apoptóticas de KIM-1. Estes resultados sugerem que pode haver alguns outros mecanismos de apoptose, que afectam a sensibilidade a efeitos antitumorais de PEG-IFN-a2A. Nós relataram anteriormente que tanto IFN-α peguilado e não peguilado inibiu a proliferação de células de carcinoma hepatocelular cultivadas por induzir a paragem do ciclo celular [10,18]. A expressão do receptor de interferão em células de tumor pode ser possível um factor relacionado com a efeito antitumoral. Por exemplo, Nagano et ai relataram que a expressão desse receptor de IFN tipo I no tecido HCC pode ser um indicador útil para encontrar o potencial de resposta à terapia de combinação /5-fluorouracilo INF-α [25]. Imunomodulação por IFNs também foi bem estudada como um fator relacionado ao antitumorais efeito. Neste estudo, foram utilizados ratinhos atímicos, que carecem de células T maduras, e IFNs humanos. Desde IFNs são espécie-específicos [26], supomos que este efeito imunomodulador é limitado em nosso estudo, mas isso deve ser confirmado no estudo futuro usando o mouse IFN.

observação morfológica dos tumores subcutâneos de ratos nu revelou que s.c. injecção de PEG-IFN-a2A induzir o aumento significativo de células apoptóticas em comparação com o grupo de controlo. Este resultado, no

in vivo

estudo é consistente com que no

in vitro

estudo mostrando alterações características da apoptose após a adição de PEG-IFN-a2A.