Abstract

O câncer de próstata é um importante problema de saúde para os homens em sociedades ocidentais. Aqui relatamos um cancro da próstata-específico Segmentação Gene-Viro-Terapia (CTGVT-PCA), em que PTEN foi inserido em um oncolytic vetor viral controlada pelo DD3 (OV) para formar Ad.DD3.E1A.E1B (Δ55) – ( PTEN) ou, resumidamente, Ad.DD3.D55-PTEN. A marmota elemento pós-transcricional (WPRE) também foi introduzido na a jusante da sequência de codificação de E1A, resultando em muito mais elevado de expressão do gene E1A. DD3 é um dos genes específicos do cancro da próstata mais e tem sido utilizado como um marcador clínico bio-diagnóstico. PTEN é frequentemente inactivado em cancros da próstata primário, que é crucial para a progressão do câncer de próstata. Portanto, o Ad.DD3.D55-PTEN tem efeito antitumoral potente e específico do cancro da próstata. A taxa de crescimento tumoral foi quase completamente inibida com o volume final do tumor após o tratamento Ad.DD3.D55-PTEN menos do que o volume inicial no início do tratamento Ad.DD3.D55-PTEN, que mostra o efeito anti-tumoral potente de Ad.DD3 .D55-PTEN no crescimento do tumor do câncer de próstata. O CTGVT-PCA constructo aqui relatado matou todas as linhas de células de cancro da próstata testados, tais como DU145, 22RV1 e CL1, mas tinha um reduzido ou nenhum efeito de morte de todas as linhas de células de cancro da próstata não testados. O mecanismo de acção de Ad.DD3.D55-PTEN foi devido à indução de apoptose, como detectado por ensaios de TUNEL e citometria de fluxo. A apoptose foi mediada pela mitocôndria-dependentes e independentes de vias, como determinado por ensaios de caspase e potencial de membrana mitocondrial

Citation:. Ding M, Cao X, Xu Hn, Fan Jk, Huang Hl, Yang dq, et ai. (2012) Cancer-específico da próstata e Potent antitumoral Efeito de um

DD3

oncolytic vírus controladas pelo portador do

PTEN

Gene. PLoS ONE 7 (4): e35153. doi: 10.1371 /journal.pone.0035153

editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Setembro, 2011; Aceito: 09 de março de 2012; Publicação: 11 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ding et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Programa de Pesquisa básica Nacional da China (973 Pro_ram) (No. 2010CB529901) (X. Liu), Science Tecnologia projeto específico da hepatite e hepatoma programa relacionado (2008ZX10002-023) (X. Liu), Programa Nova Inovação (2009-ZX-09102-246) (X. Liu), a concessão Zhejiang Sci-Tech University (1.016.834-Y) , o Programa Nacional de Pesquisa básica da China (2009CB941704) (R. Li), o Comité de Ciência e Tecnologia (09140903200, 09DJ1400400, 08140901700 e 06ZR14072) (R. Li) Municipal Xangai. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer de próstata é um importante problema de saúde para os homens em sociedades ocidentais. A cada ano, aproximadamente 230.000 homens americanos são diagnosticados com câncer de próstata e cerca de 30.000 morrem devido a esta doença [1], [2]. O melhor tratamento disponível para os pacientes com a doença avançada é a terapia de ablação de androgénios, com base nas observações de Huggins e Hodges [3] que o câncer de próstata clínica está sob a influência trófica de hormônios masculinos. a regressão do tumor e melhora dos sintomas clínicos são temporários e que a doença inevitavelmente evolui para um estado independente de androgénios. Atualmente, nenhuma terapia curativa está disponível para câncer de próstata andrógeno-independente.

Bio-terapia oferece uma oportunidade atraente para alvejar cancros da próstata andrógeno-independente. Ao contrário da quimioterapia tradicional, ele pode ser criado e personalizado para alvejar especificamente cancros de acordo com nossa compreensão da doença em um nível molecular. O vector adenoviral tem sido usado como um veículo de transferência para introduzir genes em células de cancro, porque é mais eficiente do que os métodos de transferência de genes não virais [4], [5]. O vector adenoviral é estável

In vivo

, proporciona eficientemente genes para ambas as células que não se dividem e divisória e raramente causa nenhuma doença significativa em si [6], [7]. No entanto, o adenovírus tradicional usado para a terapia genética é uma replicação deficiente, com baixo nível de expressão do gene terapêutico. replicação específico do cancro do vector oncolytic, portanto, é absolutamente necessário para evitar esses problemas. As duas principais estratégias têm sido utilizadas para a construção de um adenovírus de replicação e oncolítico específico do cancro. A primeira consiste em eliminar o elemento virai que é necessária para a replicação do vírus em células normais, que não é necessário em células tumorais. Por exemplo, o gene E1B-55K, que foi suprimida nos vírus oncolíticos ONYX-015 e ZD55 [8], [9], [10], é necessária para a replicação virai em células normais, mas é dispensável em células de cancro devido a uma compensação mecanismos. A segunda estratégia é substituir o promotor de um gene essencial na replicação de adenovírus, tal como o gene de E1A ou E1B, com um tumor promotor espec�ico [11], [12]. Assim, o vírus oncolítico é altamente replicadas quando o promotor é activado.

Para ultrapassar as limitações da terapia de genes tradicional com uma replicação deficiente vector adenoviral, um-Targeting Câncer Gene Therapy-Viro-(CTGVT) foi construído pela inserção de um gene anti-tumoral para um virai (OV) vector de duplo-alvo oncolítico. É na verdade um OV-gene, e tem muito melhor efeito anti-tumoral do que a de qualquer terapia genética sozinho ou viroterapia sozinho. O próprio vírus oncolítico tem o poder anti-tumoral e replica selectivamente várias centenas de vezes em células de tumor e, assim, os genes terapêuticos também deve ser selectivamente replicadas várias centenas de vezes em células tumorais [11]. Ao integrar de forma inovadora terapia genética e Viro-terapia, o efeito anti-tumoral do CTGVT é geralmente muito maior do que qualquer um dos métodos sozinho. Em 27 de janeiro de 2011, Amgen gastou 1 bilhão de dólares para comprar OncoHSV-GM-CSF (um vírus oncolytic do Herpes Simplex Virus-1), que está em fase III para o melanoma avançado [13], [14], o que sublinha a importância ea potencial da estratégia CTGVT.

neste estudo, nós primeiro gerado um adenovírus double-regulada, Ad.DD3.D55, em que o gene E1A está sob o controle de

DD3

promotor e o gene E1B-55K foi suprimido.

DD3

é um dos genes específicos do cancro da próstata mais e tem sido utilizado como um biomarcador clínica para o cancro da próstata [15]. Curiosamente, um fragmento de 214 pb do promotor-núcleo do DD3 tem uma elevada actividade de promotor de [16], e, por isso, foi utilizada para controlar a expressão de E1A na adenovírus oncolítico. Porque a expressão DD3 é altamente restrita no cancro da próstata, que anteriormente utilizado o promotor DD3 mínima para conduzir a expressão de E1A para a geração de um vírus oncolítico [17]. O nível de expressão de E1A DD3 conduzido pelo promotor era insuficiente, por conseguinte, WPRE foi introduzido para aumentar a expressão do gene E1A no presente estudo. WPRE promove a expressão do gene de uma forma promoter- e célula-dependente-line [18]. WPRE tem sido explorada como um potenciador da expressão do transgene, aumentando exportação nuclear de um RNA mensageiro de forma aberrante retida a partir do núcleo para o citoplasma [19]. Além disso,

PTEN

é um gene supressor de tumor bem conhecida que codifica para uma fosfatase de proteína [20]. A sua eliminação tem sido observada em cancro da próstata de alto grau e é muito importante para a progressão do cancro da próstata [21]. Neste estudo,

PTEN

com um promotor de CMV foi inserido para formar Ad.DD3.D55 Ad.DD3.D55-PTEN, que tem uma especificidade para o cancro da próstata especificidade de replicação e o gene de anti-tumor. Ad.DD3.D55-PTEN eficazmente induz a apoptose em células de câncer de próstata, eliminando xenoenxertos de cancro da próstata com maior eficiência antitumoral.

Resultados

Atividade Prostate Cancer-Specific transcrição do DD3 Promotor e efeito citopático de Ad.DD3.D55

a actividade do promotor DD3 mínima na ausência de WPRE foi medida através de expressão de luciferase repórter, que mostrou o promotor mínimo DD3 exibiram tipicamente muito mais actividade nas linhas de células de cancro da próstata do que na outra linhas de celular. O pGL3-controlo, que contém o promotor SV40 e potenciador, foi utilizado como um controlo positivo (actividade = 1,000). Como mostrado na Figura 1A, a expressão conduzida pelo

DD3

promotor com WPRE foi muito maior em LNCaP e 22RV1 do que em outras células, incluindo as linhas celulares de cancro da próstata DU-145, PC3 e CL1. Embora não houvesse diferenças nos níveis de expressão nestas linhas de células da próstata, estes resultados indicam que WPRE poderia mediar aumento da expressão de genes e mantêm a actividade relativamente restrita do promotor DD3 em linhas de células de próstata.

. A actividade de luciferase do promotor DD3 na presença de WPRE é expressa em comparação com a de pGL3-controlo (actividade = 1,000). As células foram semeadas em placas de 24 poços. Quarenta e oito horas após a infecção com o repórter plasmídeos pGL3-controlo ou pGL3-DD3-WPRE, as células foram colhidas e a actividade de luciferase foi medida. A actividade de pGL3-DD3-WPRE em relação ao controlo pGL3-se apresentados como a média ± desvio padrão (DP) de três transf ecções. B. A expressão de E1A, por Ad.DD3.D55 (sem WPRE) e Ad.DD3.D55 em diferentes linhas celulares foi avaliada. ácido a-tubulina foi avaliada como um controlo de carga. C. Ensaio de cristal violeta. As células em placas de 24 poços foram infectadas com vírus diferentes no MOI indicado. A citotoxicidade foi observada por coloração violeta cristal em cinco dias após a infecção.

Nós construímos um novo vírus oncolytic, Ad.DD3-E1A.E1B (Δ55), brevemente Ad.DD3.D55 (Fig. 2A ), que é um adenovírus duplo regulados em que o promotor nativo de E1A foi substituída pela mínima

DD3

promotor e o gene E1B-55K foi deletada. O efeito citopático de Ad.DD3.D55 foi avaliado em células normais e tumorais por coloração com violeta de cristal (Fig. 1B). Em linhas celulares de cancro da próstata 22RV1 e DU145, a citotoxicidade de Ad.DD3.D55 era comparável à do adenovírus single-regulada e Ad.DD3 Ad.D55. Em contraste, na célula de cancro da próstata não BEL-7404 e T24, o efeito citopático do Ad.DD3.D55 e Ad.DD3 foi muito mais baixa, indicando que o cancro da próstata-especificidade da citotoxicidade exercida por Ad.DD3.D55 foi muito mais mais melhorada.

A. Diagrama esquemático do Ad.DD3.D55-PTEN. O promotor endógeno de E1A foi substituído pelo promotor DD3, e o gene E1B-55K foi suprimido. O

PTEN

cassete de expressão foi inserido Ad.DD3.D55 para construir Ad.DD3.D55-PTEN. ITR, repetição terminal invertida. B. Caracterização de Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 e expressão Ad.DD3.D55-PTEN por análise de Western blot. Foi avaliada a expressão de PTEN, E1A e E1B-55K por Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 ou Ad.DD3.D55-PTEN em células CL1. Ad.WT foi usada como um controlo positivo. ácido a-tubulina foi avaliada como um controlo de carga. C. níveis de mRNA relativa de

PTEN Comprar e E1A em 22RV1 células infectadas com Ad-PTEN, Ad.DD3.D55 e Ad.DD3.D55-PTEN. GAPDH foi avaliada como uma referência interna. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências separadas. análise de mancha de D. ocidental dos níveis de proteína Akt totais e fosforilada nas células infectadas com CL1 Ad.DD3.D55 e Ad.DD3.D55-PTEN. E. Análise de secções de tumor derivadas de tumores tratados com PBS ou um de vários adenovírus por hematoxilina e eosina e do hexon e PTEN imunocoloração. barra de escala, 100 mm.

Em seguida, mediram os níveis de expressão de E1A nas diferentes células infectadas com Ad.DD3.D55 (com WPRE) ou Ad.DD3.D55 (sem WPRE) (Fig. 1C), respectivamente. A expressão de E1A foi mais forte nas células 22RV1 entre todas as linhas celulares testadas e não se alterou significativamente na presença de WPRE. No entanto, a introdução de WPRE efectivamente aumentado os níveis de E1A de expressão em vários linha de células de cancro da próstata, incluindo CL1, LNCaP, PC3 e DU-145. Além de que, os dados demonstraram que a introdução de WPRE não afectou significativamente a expressão restrita de E1A conduzido pelo promotor DD3 em células de cancro da próstata, proporcionando uma forte evidência de suporte que WPRE é um candidato promissor para a construção de um adenovírus oncolítico para alvejar o cancro da próstata células.

Construção e Caracterização de Ad.DD3.D55-PTEN

o

PTEN

cassete de expressão foi introduzida no DD3 controlar dupla Ad.DD3.D55 regulada por adenovírus para gerar Ad.DD3.D55-PTEN (Fig. 2.A). Os níveis de expressão de PTEN e E1A em células infectadas CTGVT vírus diferentes foram determinados por Western blotting Depois de infectar a linha celular de cancro da próstata humano CL1 (Fig. 2B). O adenovírus deficiente na replicação Ad-PTEN com exclusão região E1 eo adenovírus duplo regulada Ad.DD3.D55 foram utilizados como controle. Como esperado, os vírus double-regulada Ad.DD3.D55 e Ad.DD3.D55-PTEN proteína expressa E1A em aproximadamente os mesmos níveis como fez Ad.WT e não conseguiu expressar a proteína E1B-55K. Resultados semelhantes foram obtidos quando a expressão de proteínas foi medida ao nível do ARNm por PCR em tempo real (Fig. 2C). Para caracterizar a função de PTEN em Ad.DD3.D55-PTEN, os efeitos da sua expressão sobre o estado de fosforilação de Akt foram examinados por transferência Western. Como mostrado na Fig. 2D, a infecção pelo vírus oncolítico conduziu a um aumento na expressão de fosfo-Akt, que foi detectável tão cedo quanto 24 h após a infecção. Além disso, a expressão de PTEN inibiu a fosforilação de Akt no seu resíduo de activação (Ser473) sem diminuir os níveis de proteína Akt totais em comparação com o Ad.DD3.D55 vetor. Estes resultados são consistentes com a actividade de fosfatase de lípidos de PTEN. Para caracterizar ainda mais os vírus

in vivo

, os níveis da proteína hexon viral e o gene terapêutico

PTEN

foram medidos em amostras de tumores 7 dias após a injecção do vírus. Tal como mostrado na Figura 2E, foram observados níveis elevados de hexon nos grupos Ad.DD3.D55 e Ad.DD3.D55-PTEN. A expressão do gene terapêutico

PTEN

foi também medido nestas amostras tumorais. As amostras infectadas com Ad-PTEN e Ad.DD3.D55-PTEN exibida elevados níveis de expressão de PTEN, mas

PTEN

expressão não foi observado no grupo tratado com Ad.DD3.D55.

A citotoxicidade cancer-específico da próstata de Ad.DD3.D55-PTEN

In Vitro

A citotoxicidade do Ad.DD3.D55-PTEN foi avaliada por ensaio MTT em linhas celulares de cancro da próstata de três CL1, LNCaP, DU145, 22RV1, PC3 e duas linhas celulares de cancro da próstata não-T24 (linha celular humana urinária carcinoma da bexiga) e BEL-7404 (linha de células de câncer de fígado humano). Os resultados mostraram que o crescimento de células de cancro da próstata foram infectados muito inibida com diferentes graus, enquanto que a máxima eficiência de inibição por Ad.DD3.D55-PTEN foi observada em células LNCaP e células CL1 (Fig. 3A). Estes dados também mostram que a citotoxicidade de Ad.DD3.D55-PTEN é significativamente mais elevada do que a de Ad.DD3.D55. No entanto, ambos os vírus foram mostrados para ser incapaz de inibir o crescimento de células de cancro da próstata não significativamente (Fig. 3A).

. ensaio MTT. As seis linhas celulares indicadas acima foram semeadas em placas de 96 poços e infectadas com vírus diferentes a uma MOI de 10. A viabilidade celular foi medida por ensaios de MTT a 0, 24, 48, 72, 96 e 120 horas pós-infecção. Os resultados são apresentados como a média ± desvio padrão de cinco experiências separadas e estão expressos como a percentagem relativa de células de controlo falsamente tratados. B. Ensaio de cristal violeta. As células em placas de 24 poços foram infectadas com vírus diferentes no MOI indicado. A citotoxicidade foi observada por coloração com violeta de cristal a cinco dias após a infecção.

A citotoxicidade de Ad.DD3.D55-PTEN foi também analisado através de coloração com violeta de cristal, como mostrado na Figura 3B. Ad.DD3.D55-PTEN tiveram um forte efeito citotóxico sobre as células cancerosas da próstata. células LNCaP e células CL1 foram mais sensíveis à citotoxicidade exercida por Ad.DD3.D55-PTEN que foram DU-145 e células 22RV1. No entanto, pouca ou nenhuma citotoxicidade foi observada em linhas de células de cancro da próstata não, tais como T-24, BEL-7404, e as linhas de células normais, HFL-I e BEAS-2B. Estes resultados indicam que a citotoxicidade do Ad.DD3.D55-PTEN foi não apenas muito mais forte do que a de Ad.DD3.D55 devido à expressão de

PTEN

, mas também foi altamente restrita para células de cancro da próstata.

Ad.DD3.D55-PTEN induz a apoptose em células cancerosas da próstata

In Vitro

Nós manchado células com Hoechst33258 para analisar ainda mais a capacidade de indução de apoptose de Ad.DD3 .D55-PTEN

in vitro

. Como mostrado na Figura 4A, Ad.DD3.D55-PTEN induzida apoptose significativa em CL1 e 22RV1 células. No entanto, a replicação-incompetentes Ad-PTEN e Ad.DD3.D55 double-regulada exibiu uma capacidade marginal para induzir a apoptose. A citometria de fluxo foi realizada no qual as células mortas foram representados por a fracção de células na fase sub-G1. A infecção com Ad.DD3.D55-PTEN aumentou o número de células na fase sub-G1 nas linhas de células da próstata testadas (CL1, DU145, 22RV1, PC3) e um índice de apoptose mais elevado foi encontrado em células 22RV1 (43,135%) do que em DU145, as células PC3 ou CL1, consistente com a maior expressão de E1A na linha de células 22RV1 (Fig. 4B).

a. CL1 e 22RV1 células foram corados com Hoechst 33258 a 48 horas depois da infecção virai. As setas indicam as células apoptóticas. Barra de escala, 10 | im. B. Análise de citometria de fluxo de células coradas com iodeto de propídio foi efectuada às 48 horas após a infecção. As percentagens de células sub-G1 são mostrados. Os resultados são apresentados como a média ± DP de três experiências separadas (** indica

P

0,01; * indica

P

0,05; N /S indica

P

. 0,05)

Ad.DD3.D55-PTEN induz a apoptose através intrínsecos e extrínsecos vias de sinalização

O mecanismo de apoptose induzida por Ad.DD3.D55-PTEN foi estudada. Como mostrado na Figura 5B, o inibidor da pan-caspase Z-VAD-fmk inibiu a morte celular induzida por Ad.DD3.D55-PTEN em células CL1. Este resultado indica que a morte celular induzida por Ad.DD3.D55-PTEN é dependente da caspase. Além disso, uma série de cascatas de sinalização de apoptose dependente de caspases foram analisados ​​por transferência de Western (Fig. 5A). reforçada clivagem de PARP e a activação de pro-caspase-3, pro-caspase-8 foram detectados em células Ad.DD3.D55-PTEN-infectadas (Fig. 5a). Nós também detectada uma redução tempo-dependente do nível de precaspase-9 em células Ad.DD3.D55-PTEN-infectadas (Fig. 5a), consistente com a activação da via de sinalização da apoptose mediada por mitocôndrias. A integridade das mitocôndrias das células foi avaliada com o corante fluorescente potenciométrica de JC-1 (Fig. 5B). A citometria de fluxo revelou que a infecção com Ad.DD3.D55-PTEN resultou numa diminuição significativa no potencial eléctrico mitocondrial transmembranar (Fig. 5C). Em conjunto, estas observações indicam que PTEN melhorar eficazmente a apoptose induzida por Ad.DD3.D55 por vias intrínseca e extrínseca.

A. A análise Western blot de proteínas relacionadas com a apoptose em células infectadas com CL1 Ad.DD3.D55 ou Ad.DD3.D55-PTEN. células B. CL1 foram tratados com os agentes e viabilidade celular indicada foi analisada pelo ensaio de MTT depois de 120 horas. Para o ensaio de inibição de Z-VAD-fmk, as células foram pré-tratadas com z-VAD-fmk (20 pM) 2 horas antes da infecção do vírus. Os resultados são apresentados como a média ± DP de três experiências separadas (** indica

P

0,01; * indica

P

0,05; N /S indica

P

0,05). C. Análise do potencial de membrana mitocondrial de células CL1 por FACS após coloração com JC-1. A porcentagem de células na região do trapeziform é mostrado.

A supressão do crescimento do tumor por Ad.DD3.D55-PTEN induz a apoptose

In vivo

Os resultados apresentados acima mostram que o efeito anti-tumoral do agente CTGVT Ad.DD3.D55-PTEN é muito melhor do que quer o Ad.DD3.D55 vírus oncolítico sozinho ou Ad.PTEN. Das linhas celulares de cancro da próstata testados, Ad.DD3.D55-PTEN matou células LNCaP e CL-1, com a maior eficiência. Nós selecionamos a linha de células CL1, um subclone independente de andrógeno de LNCaP, para avaliar o potencial oncolytic de Ad.DD3.D55-PTEN porque as células LNCaP têm capacidade de formação de tumor pobres

in vivo

. Como mostrado na Figura 6A, o crescimento do tumor após a injecção de estava quase completedly inibida com o volume final do tumor após o tratamento Ad.DD3.D55-PTEN menos do que o volume inicial no início do tratamento Ad.DD3.D55-PTEN. Outra maneira de dizer, não só Ad.DD3.D55-PTEN-infectados tumores não crescer, mas os seus volumes na verdade diminuiu em 41,3% quando medido 20 dias após a injecção. Isto mostra o efeito potente de Ad.DD3.D55-PTEN no crescimento do tumor. No entanto, tanto Ad.DD3.D55 Ad.PTEN e inibiu o crescimento do tumor, com uma eficiência muito mais baixa, comparada com a de Ad.DD3.D55-PTEN.

. efeito anti-tumoral de tumores de xenoenxerto de infecção CL1 com diferentes adenovírus. O volume do tumor foi medido e é apresentado como a média ± DP. B. Ad.DD3.D55-PTEN inibe o crescimento de tumores de xenoenxerto CL1. Análise da cinética virais de Ad-PTEN ou Ad.DD3.D55-PTEN-tratada 22RV1 tumores por PCR em tempo real. região E3 de adenovírus foi amplificado para avaliar o conteúdo de ADN viral. ADN de p-actina foi utilizado como um controlo interno. (Meio NS

P Art 0,05, sem significância estatística). C. Análise de secções de tumor derivadas de tumores tratados com PBS ou um de vários adenovírus por coloração TUNEL. barra de escala, 100 mm.

O estudo de cinética viral

in vivo

ilustrar ainda mais a superioridade do Ad.DD3.D55-PTEN com sua quantidade de DNA viral em até 100 vezes maiores do que que de Ad-PTEN dentro de 72 h e com duração de 2 semanas (Fig. 6B). análise de TUNEL revelou que a injecção de Ad.DD3.D55-PTEN causada quantidade significativa de apoptose em tumores, ao passo que não foi observada apoptose em tumores tratados com PBS, e pouco em tumores tratados com Ad-PTEN (Fig. 6C).

Discussão

neste estudo, Ad.DD3.D55-PTEN demonstraram um efeito antitumoral excelente

in vitro

e

in vivo

. Dois fatores principais contribuem para a citotoxicidade exercida por Ad.DD3.D55-PTEN. A primeira é que se replica selectivamente em células de cancro da próstata. Nós relatado anteriormente que o DD3 controlado por promotor de vírus oncolítico mínima replicado selectivamente em células de cancro da próstata [17], embora a actividade do promotor não era muito satisfatória. O PSA é um biomarcador bem conhecido do cancro da próstata e o seu promotor tem sido amplamente utilizada para estudar bioterapias para o cancro da próstata, incluindo a terapia de gene com vectores diferentes [22], [23], [24], [25]. Diferentes promotores recombinantes foram gerados com base na actividade específica do cancro da próstata de um promotor ou um potenciador para aumentar a actividade específica do cancro da próstata de o promotor que controla a replicação do vírus oncolítico [26], [27], [28], [ ,,,0],29]. De morte celular eficácia pode ser melhorada por vários métodos, tais como a combinação de adenovírus oncolítico com radioterapia ou quimioterapia. Ensaios clínicos demonstraram que a combinação de vírus ONYX-15 e quimioterapia provoca uma resposta anti-tumoral forte contra o câncer de cabeça e pescoço do que ONYX-15 ou quimioterapia sozinha [30]. Os pacientes com câncer de próstata foram tratados com mais freqüência com ablação de androgénios. Uma vez que a actividade da PSA promotor /potenciador é altamente dependente de androgénio endógeno [31], o

In vivo

citotoxicidade de um promotor de PSA /vírus oncolítico baseada potenciador poderia ser reduzida de forma significativa, se foi utilizado em doentes foram tratados com ablação de androgénios. Neste estudo, foram introduzidos WPRE na cassete de expressão de E1A controlado-DD3. Interessantemente, a presença de WPRE elevou os níveis de expressão do repórter consideravelmente, mas não afectou significativamente a expressão restrita em células de cancro da próstata. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relato de uso de WPRE na geração de um vírus oncolytic. Além disso, os nossos dados mostram que Ad.DD3.D55-PTEN, em que a expressão de E1A está sob o controlo do promotor e DD3 WPRE, exerceram uma forte efeito inibidor sobre o crescimento de androgénio-dependente, bem como linhas de células independentes de androgénios , incluindo CL1, DU145 e 22RV1 em cultura de células e crescimento do tumor CL1 num ratinho nu de xenoenxerto. Ad.DD3.D55-PTEN tem um efeito citotóxico potente em linhas de células independentes de androgénios. Portanto, a expressão de E1A, sob o controlo do promotor e DD3 WPRE pode ser clinicamente significativo para a terapia oncolitica viral de pacientes com cancro da próstata.

Os nossos resultados mostraram que a expressão de PTEN jogado o segundo papel chave na citotoxicidade de Ad.DD3.D55-PTEN. PTEN actua como uma fosfatase fosfatidilinositol com um possível papel na fosfatidilinositol-3′-quinase (PI3’K) de transdução de sinal mediada por, suprimindo a via PI3K /Akt por redução do nível de PI3’K na célula [32], [33] . O vírus oncolítico Ad.DD3.D55 e Ad.DD3.D55-PTEN conduziu a um aumento na expressão de fosfo-Akt em 24 h após a infecção (Fig 2.D.); a activação da sinalização de Akt-PI3K é a via utilizada pelo vírus para a endocitose e a replicação virai [34], [35], [36], [37]. Ad.DD3.D55-PTEN inibiu a fosforilação de Akt no seu resíduo de activação (Ser473) como um resultado da expressão de PTEN, enquanto a activação de Akt foi mantida com a infecção de Ad.DD3.D55 (Fig. 2.D). A diferença indicou claramente o papel poderoso da PTEN. Além disso, PTEN foi identificado como a alteração de inactivação em vários tipos de cancro humanas, tais como glioma, mama, pulmão, próstata, bexiga, tumores de melanoma e nos rins, astrocitoma, leucemia e [38]. No cancro da próstata, a perda da proteína PTEN está correlacionada com tumores de alto grau e estágio, sugerindo que as alterações na

gene PTEN

pode estar associada com a progressão do cancro da próstata [21], [39]. Wu et al. estabeleceu um modelo de rato com exclusão específico da próstata de PTEN [40]. Este modelo do rato recapitula a progressão do cancro da próstata em seres humanos: a iniciação do câncer de próstata com neoplasia intra-epitelial prostática, seguido de progressão para adenocarcinoma invasivo e metástases subsequente. Portanto, PTEN é um candidato ideal para a terapia genética do cancro devido às suas propriedades únicas. Introdução de PTEN por adenovírus ou retrovírus tem sido estudado para bio-terapia de diversos tipos de câncer, incluindo ovário, do endométrio, bexiga, gástrico, colo-rectal e cânceres de esôfago e glioblastoma [41], [42], [43], [44 ], [45], [46], [47]. Por exemplo, Gallick et ai. relataram que a expressão adenoviral-mediada de PTEN inibiu a proliferação e metástase das células cancerosas humanas da próstata

in vitro Comprar e no

vivo

[48]. expressão do transgene PTEN adenoviral mediada combinada com radioterapia, quimioterapia e outros genes de supressão do câncer tem sido utilizada para tratar as células de cancro da próstata para aumentar o efeito anti-tumoral [49], [50], [51], [52]. Neste estudo, os níveis elevados de expressão de PTEN conduzido pelo promotor de CMV foram mediados por um vírus oncolítico que selectivamente replicado em células de cancro da próstata através da utilização promotor DD3 para conduzir a expressão de E1A. A eficácia antitumoral de PTEN em que o vírus oncolítico foi muito melhorados em relação ao PTEN mediada por adenovírus que foi previamente relatado para uso no cancro da próstata [48], [52], que pode ser resultado de que Ad.DD3.D55-PTEN induzida uma apoptose massiva em células de câncer de próstata por vias intrínseca e extrínseca.

Observamos sensibilidades das diferentes linhas de células de câncer de próstata para a citotoxicidade de Ad.DD3.D55-PTEN. O nível de expressão de repórter dirigido pelo promotor DD3 e WPRE nas células LNCaP foi apenas 21,79% de células que, em 22RV1 (Fig. 1), sugerindo uma menor replicação de Ad.DD3.D55-PTEN em células LNCaP, que parece inconsistente com a maior eficácia de eliminação de Ad.DD3.D55-PTEN em células LNCaP do que em 22RV1 células (Fig. 3). No entanto, 22RV1 células expressam um PTEN funcional, enquanto as células LNCaP não [53] fazer. Tendo em conta os dados acima, Ad.DD3.D55-PTEN provavelmente exerce um forte efeito citotóxico em células de CaP PTEN-negativos do que em células CaP PTEN-positiva.

Os volumes de tumor de células CL1 foi redued por 41,3% 20 dias depois infectadas com Ad.DD3.D55-PTEN no ratinho nu (Fig. 6A) sugere fortemente que Ad.DD3.D55-PTEN tem o potencial terapêutico para o tratamento de cancros independentes de androgénios. Este estudo revelou que a replicação adenoviral diminuiu após aproximadamente 12 dias de replicação activa (Fig. 6B). Curiosamente, mesmo a taxa de vírus oncolytic mantido muito baixo

in vivo

após o período (Fig. 6B), o tumor infectado ainda não cresceu significativamente (Fig. 6A). Seu mecanismo para esse fenômeno ainda é desconhecida. Uma explicação plausível é que a grande maioria das células cancerosas foi morto nos primeiros dias após a injecção de Ad.DD3.D55-PTEN, enquanto o crescimento das células cancerosas remanescentes é eficientemente inibida mesmo na presença de uma quantidade mínima de vírus oncolytic. O fenômeno é provavelmente incentivar pois a maioria dos vírus será esclarecido

in vivo

quando o vírus oncolytic são utilizados clinicamente.

Em conclusão, nós desenvolvemos um romance CTGVT específico da próstata (CTGVT-PCA ), Ad.DD3.D55-PTEN, através do controlo da expressão do gene E1A, com um promotor mínimo e DD3 WPRE. Ad.DD3.D55-PTEN tinha excelente eficácia anti-tumoral em linhas celulares de cancro dependentes de androgénio da próstata independente de e. Este relatório também fornece uma nova estratégia para a construção de um CTGVT-PCA com tipos de tumores especificidade que têm poucos promotores específicos de tumores disponíveis.

Materiais e Métodos

Ética Declaração e animal Experiment

Homem BALB /c ratos pelados (4 semanas de idade) foram mantidas e utilizadas em uma sala de luz e temperatura controladas em uma instalação AAALAC credenciados, e receberam água e comida de laboratório

ad libitum

[17] . Todos os procedimentos experimentais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal de Xangai Instituto de Bioquímica e Biologia Celular sob o protocolo IBCB-SPF0029. Para estabelecer os tumores de xenoenxerto, 5 × 10

6 22RV1 ou CL1 células em 150 ul DMEM foram injectados por via subcutânea no flanco direito de cada ratinho. Quando os tumores atingiram 70-150 mm

3 em tamanho, os murganhos foram distribuídos aleatoriamente para um de quatro grupos (seis ratinhos por grupo). Adenovírus (2 × 10

9 PFU por ratinho) ou PBS foi injectada nos tumores a cada dois dias, com um total de três injecções. O volume do tumor (mm

3) foi medida com um paquímetro de quatro em quatro dias, e calculada como (comprimento x largura

2) /2. Para estudar cinética viral

in vivo

, tumores injectados com Ad-PTEN ou Ad.DD3.D55-PTEN foram coletadas em 3, 6, 9, 12 e 15 dias após a última injecção e rapidamente congelados em nitrogênio líquido . O DNA total do tumor foi extraído utilizando o Kit DNA genômico minipreps (Generay Biotech, Xangai, China).