Abstract

A ciclina B1, uma ciclina mitótica, tem sido implicado em malignidade. No entanto, a sua contribuição para a invasão do cancro colorectal e metástase ainda não são bem compreendidos. Aqui, nós demonstramos que a invasão e metástase de câncer colorretal é regulada pela ciclina B1. Observou superexpressão de ciclina B1 em tecidos de câncer colorretal, mas esta expressão elevada foi negativamente associado a metástases em linfonodos, estágio metástases à distância, e estágio TNM. A análise de sobrevivência de Kaplan-Meier mostrou que a baixa expressão B1 ciclina foi associado com pior sobrevida global de pacientes com câncer colorretal. A inibição da ciclina B1 em células de cancro colorrectal melhorada a migração celular e invasão de três linhas celulares de cancro colorrectal diferentes. Ao estudar o mecanismo possível pelo qual Ciclina B1 suprime a invasão e metástases de cancro colo-rectal, observou-se que a supressão da ciclina B1 diminuiu a expressão do nível de proteína E-caderina. Nossos resultados sugerem que ciclina B1 poderia suprimir a invasão e metástase de células de câncer colorretal por meio regulação da expressão da caderina-E, o que permite o desenvolvimento de estratégias de intervenção potenciais para o cancro colorectal

Citation:. Fang Y, Liang X, Jiang W, Li J, Xu J, Cai X (2015) ciclina B1 Suprime colorectal Cancer invasão e metástase através da regulação da caderina-e. PLoS ONE 10 (5): e0126875. doi: 10.1371 /journal.pone.0126875

Editor do Academic: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 18 Janeiro, 2015; Aceito: 08 de abril de 2015; Publicado em: 11 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 fang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos científicas e Tecnológicas Projectos de Cooperação Internacional da China (https://www.istcp.org.cn/) (Grant No. . 2012DFA30410 para Xiujun Cai), e da Ciência-tecnologia nacional plano de apoio Projetos de China (https://www.most.gov.cn/) (Grant No. 2012BAI14B06 para Xiujun Cai)

Conflito de interesses: os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Apesar do aumento da consciência geral, o cancro colorectal permanece como uma das três principais causas de mortalidade relacionada com doença maligna em todo o mundo [1]. A maioria dos pacientes com câncer colorretal em fase inicial (fase TNM I e II) podem ser tratadas eficazmente por ressecção cirúrgica e as taxas de sobrevivência de 5 anos para os cânceres em estágio inicial é de até 95% (fase I) e 60-80 % (fase II), respectivamente. No entanto, a maioria dos pacientes com câncer colorretal metastático em estágio avançado (estágio TNM III e IV) são geralmente refratários a terapias existentes e ter um bom prognóstico reservado desde que as taxas de sobrevida em 5 anos cair drasticamente para 35%, com envolvimento de gânglios linfáticos (fase III ) e de 10% quando a doença se espalhou para órgãos distantes (fase IV) [2-5]. Assim, a formação de metástases é o decisivo eo evento mais letal durante este curso da doença. Na verdade, a metástase tumoral é um processo complicado que envolve biológica primária angiogénese tumoral, invasão de células de cancro, intravasamento vascular /linfática, distante extravasamento de órgão-alvo, e o crescimento de células invadidas no microambiente externo para formar colonização metastático [6-8]. Embora a desregulação de vias de sinalização e disfunção de muitas moléculas foram identificadas na metástase do cancro, eles não podem explicar completamente o fenómeno da metástase do cancro colo-rectal [2]. Assim, é de grande importância para desvendar os mecanismos biológicos metástase subjacente no cancro colorectal e formular estratégias para intervir neste processo.

epitelial-mesenquimal de transição (EMT) é conhecido como um mecanismo crucial na metástase do cancro colo-rectal e um regulador chave da formação do órgão distante [9-11]. Durante o processo de EMT, derivadas de epitélio células tumorais a perda de adesão celular e de polaridade e ganho de propriedades migratórias e invasivos, resultando em permitir que as células tumorais se infiltrar nos tecidos circundantes, e permitindo assim que estas células metástases em tecidos distantes [9, 12 ]. Ao nível molecular, a E-caderina é o marcador molecular melhor caracterizado de EMT. A perda da expressão de E-caderina é conhecida como a marca mais predominante de EMT [13-15]. E-caderina, codificada pelo gene CDH1, que está localizado no cromossoma 16q22 [16], é uma glicoproteína transmembranar confinada a células epiteliais e é o principal responsável por junções de adesão intercelular [17]. Muitos fatores de transcrição, tais como Caracol, ZEB1, ZEB2, FOXC2, Slug e torção foram mostrados para causar directa ou indirectamente a repressão da atividade do promotor de E-caderina [18-21]. Além disso, a perda ou a redução da expressão de E-caderina foi encontrado para permitir ou acelerar a invasão e metástase, e, portanto, sugerido como um potencial fator prognóstico no câncer colorretal [22-25].

A ciclina B1, mapeado para a saúde humana cromossoma 5q12, é conhecida como uma ciclina mitótica devido ao seu papel chave na modulação da progressão da fase G2 /M do ciclo celular, e participa no crescimento celular, diferenciação, apoptose, e metástase em vários tipos de cancro [26-29]. Até agora, o aumento da expressão de ciclina B1 foi reportado nos cancros da mama, da próstata, do esófago, do pulmão, do cólon, e cancros gástricos [30-36]. Em nosso estudo anterior, também encontramos superexpressão de ciclina B1 promoveu a proliferação celular e crescimento tumoral em câncer colorretal humano [37]. No entanto, a ausência de relevância prognóstico ou prognóstico de ciclina B1 foi também observada em cancro colorrectal, linfoma e tumor neuroendócrino pancreático [35, 38, 39]. Estas discrepâncias indicam um estudo mais aprofundado a ser necessário.

Neste estudo, para elucidar se e como ciclina B1 está envolvido na invasão celular e metástase no câncer colorretal, inicialmente avaliamos a expressão B1 ciclina em 150 pares de câncer colorretal e combinados não-tumorais tecidos colorretais adjacentes, então analisada a sua correlação com as características clínico-patológicas. Curiosamente, descobrimos que a superexpressão da ciclina B1 no cancro colorectal foi negativamente correlacionada com metástases em linfonodos, metástases à distância, estágios TNM, e baixa sobrevida. O nosso estudo revelou também a inibição da ciclina B1 suprimiu a expressão de E-caderina, e subsequentemente levou à indução de migração e invasão de células de cancro colorrectal. Estas descobertas não só associado ciclina B1 com metástase em câncer colorretal, mas também fornecem um alvo promissor para o tratamento dos pacientes em estágio final com cancro colo-rectal.

Materiais e Métodos

Pacientes e amostras

tecidos normais adjacentes colorretais tumorais e combinados foram obtidas de 150 pacientes submetidos a cirurgia para Sir Run Run Shaw Hospital, Faculdade de Medicina da Universidade de Zhejiang (Hangzhou, China), entre abril de 2005 e junho de 2009. Em particular, os tecidos normais adjacentes foram tomadas 5 cm lateralmente desde a extremidade da região cancerosa. Nenhum destes doentes tinham recebido quimioterapia ou radioterapia antes da operação. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética Sir Run Run Shaw Research Hospital e todas as amostras foram obtidas com consentimento informado por escrito (S1 Fig). Todos os espécimes foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido após a ressecção cirúrgica e armazenadas a -80 ° C até a extração de RNA.

As informações clínicas desses pacientes, incluindo idade, sexo, estado de diferenciação, localização do tumor, tamanho do tumor, metástases linfonodais , metástases à distância, e estágio TNM, foi recolhido e apresentado na Tabela S1. Os pacientes foram acompanhados a cada 3 meses, pelo menos, 5 anos de pós-operatório. Todos os pacientes foram contactados por telefone ou questionários cartas para verificar sobre o seu estado de saúde. A morte dos doentes foi avaliada por relatório da sua família.

extracção de ARN e quantitativa PCR em tempo real

O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir de 2 ug de ARN total utilizando RT PrimeScript kit de reagente (Takara) e amplificado com SYBR Premix Ex Taq (Takara) em ABI sistema 7500HT (ABI). O iniciador da ciclina B1 foi mostrado anteriormente [37]. GAPDH foi utilizada como controlo interno. A quantificação relativa da expressão de mRNA foi calculada com a 2

-ΔCT ou 2

-ΔΔCT método.

Cultura de células e transfecção

O humano colorectal linhas celulares de cancro p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116, e SW480 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection. p53

+ /+ HCT116 e p53

– /- células HCT116 foram cultivadas em meio completo 5A de McCoy (Gibco). As células SW480 foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% FBS (Gibco). Todas as três linhas de células foram cultivadas numa câmara humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C.

ARNsi contra ciclina B1 e ARNsi de controlo negativo foram sintetizados por Bioneer. As células foram transitoriamente transfectadas com ARNsi utilizando reagentes de transfecção à base de lípidos DharmaFECT1 (Dharmacon) de acordo com o protocolo do fabricante. O nível de eficiência de transfecção e transfecção de ciclina B1 siRNA foi determinada anteriormente [37].

A migração celular ensaio

24h após a transfecção, 1 × 10

5 células cancerosas tratadas em 200 ul de meio livre de soro foram adicionados à parte superior da Transwells (tamanho de poro de 8 uM; Costar). As câmaras inferiores foram cheias com meio suplementado com 10% de FBS e incubou-se a 37 ° C /5% de CO

2 até que o tempo de detecção (24 horas para o p53

+ /+ HCT116, 36h para p53

– /- HCT 116, e 36h para SW480, respectivamente). As células na parte inferior da membrana foram fixadas, coradas com violeta de cristal a 0,1%, e contados cinco campos microscópicos (independentes com uma ampliação de 20 vezes). Os ensaios foi realizado em duplicado e repetidas três vezes independentes.

invasão celular ensaio

Um tamanho de poro de 24 poços Transwell placa (8 mícrons revestidos com Matrigel (BD Biosciences) foi usada para medir a célula capacidade de invasão. 24 h após a transfecção, 1 × 10

5 as células foram ressuspensas em meio isento de soro e adicionadas à câmara superior. o meio suplementado com 10% de FBS foi usado como quimioatractora para a câmara inferior antes da análise. as células foram incubadas a 37 ° C durante o tempo indicado (30h para p53

+ /+ HCT116, 42h para p53

– /- HCT 116, e 48h para SW480, respectivamente). as células na superfície superior foram raspadas com cotonetes de algodão e lavados, ao passo que as células invadidas na superfície inferior foram fixadas, coradas com 0,1% de violeta cristal durante 1 h, e quantificada por determinação do número de células em cinco campos visuais randmonly escolhidas dosagens foi realizada em duplicado e repetidas três vezes independentes.

Western blot análise

As células foram recolhidas e lisadas em tampão RIPA contendo inibidores da protease (Pierce). A concentração de proteína foi determinada com kit de ensaio de BCA, e igual quantidade de proteína foram sujeitos a electroforese em 10% de gel de sulfato de dodecilo de sódio-poliacrilamida e transferidos para membrances de difluoreto de polivinilideno (PVDF, Millipore). Após bloqueamento para ligação não específica, a membrana foi incubada com anticorpos primários específicos contra a ciclina B1 (1: 2000; Epitomics), a caderina-E (1: 1000; Abcam), e GAPDH (1: 2000; Santa Cruz) durante a noite a 4 ° C, e, em seguida, lavada três vezes com solução salina tamponada com Tris e Tween 20, seguido incubadas com os anticorpos conjugados com peroxidase de rábano apropriado secundárias (HRP, Dawen Biotec) durante 1 h à temperatura ambiente. A expressão da proteína foi finalmente visualizada utilizando detecção por quimioluminescência amplificada (ECL, Biological Industries). As intensidades dos sinais de expressão de proteína foram quantificados utilizando a análise densitométrica com software Quantity One (Bio-Rad), e os valores resultantes da proteína foram normalizados para os controlos de carga correspondentes.

A imuno-histoquímica

Anti foi utilizado anticorpo -E-caderina (Epitomics) para IHC coloração dos tumores de xenoenxerto. IHC foi realizada como descrito anteriormente [37].

A análise estatística

A análise estatística foi realizada usando o padrão SPSS versão 21.0 (SPSS Inc) e GraphPad Prism 5 (GraphPad Software). Diferença entre os grupos em amostras de tecidos foi avaliado pela não paramétrico de Mann-Whitney

U

teste. A quantificação relativa de expressão B1 ciclina foi calculada com a 2

-ΔCT ou 2

-ΔΔCT método (ΔCT = ciclina B1 (CT) -GAPDH (CT); ΔΔCT = ΔCT (tumor) – ΔCT (Normal)) , e os dados são apresentados como média ± SEM. log-rank testes de Kaplan-Meier e foram usadas para avaliar a sobrevivência geral do paciente (SO) e para criar curvas de sobrevivência, com base nos níveis altos e baixos Ciclina B1 (como definido pela curva ROC). A análise de sobrevida univariada e multivariada foram realizadas com o modelo de regressão de Cox. Todas as experiências in vitro foram realizadas em duplicado e repetidas três vezes. Para o in vitro e em experiências com animais in vivo, diferença entre dois grupos foi avaliada por meio de Student

t

-teste, e os dados são apresentados como média ± SD. Valor de

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

ciclina B1 superexpressão está negativamente correlacionada com matastasis linfonodo, metástases à distância e estágio TNM avançado em tecidos de câncer colorretal em humanos

Para identificar o potencial papel da ciclina B1 em metástases do cancro colorrectal, que, inicialmente, examinaram a expressão da ciclina B1 em 150 pares de cancros colo-rectais e correspondentes não-tecidos de tumor colorectal adjacentes utilizando qRT-PCR. Ciclina B1 mRNA foi sobre-expresso em 139/150 (92,7%) pares, com um aumento da variação média dobra de 5,30 em tecidos de câncer. Descobrimos ainda que a expressão média relativa de ciclina B1 foi muito menor nos pacientes com metástases em linfonodos do que em pacientes sem metástase (

P

= 0,011) (Fig 1B). Em pacientes com metástases à distância, o nível de ciclina B1 também foi significativamente menor do que em pacientes sem metástases à distância (

P

= 0,021) (Fig 1C). Como mostrado na Tabela 1, a associação entre nível B1 ciclina e características clínico-patológicos mostraram a expressão de ciclina B1 foi negativamente correlacionada com metástases em linfonodos, metástases à distância, e estágio TNM avançada (

P

= 0,007) (Fig 1D ) em pacientes com câncer colorretal. No entanto, nenhuma associação significativa foi encontrada entre a expressão B1 ciclina e outras características clínico-patológicas, tais como a idade do paciente, sexo, local do tumor, o tamanho do tumor e diferenciação (todos os

P Art 0,05). Além disso, também confirmou o nível de proteína de ciclina B1 em 30 amostras de tecidos clínicos, incluindo 10 tecidos normais colorretal, 10 tecidos de câncer colorretal sem metástase, e 10 tecidos de câncer com metástase por western blot. Foram obtidos resultado coerente com o resultado do nível de ARN. proteína ciclina B1 foi sobre-expresso em tecidos de câncer colorretal sem metástase, comparar com os tecidos colorretais normais (

P

= 5,51 × 10

-5), enquanto o nível de proteína B1 ciclina diminuiu significativamente em tecidos de câncer colorretal com metástases, quando comparados com aqueles sem metástases (

P

= 0,012) (Figura 1E). Estes dados revelam que a expressão de ciclina B1 foi inversamente associado com a metástase do cancro colo-rectal.

expressão (A) Ciclina B1 de ARNm foi testada utilizando qRT-PCR em 150 pares de tecidos de cancro colo-rectais humanos e tecidos não tumorais adjacentes. Alterações na expressão são mostrados como diagramas de dispersão, com o eixo dos y indica a expressão da ciclina B1. A sua expressão foi normalizada para o nivel de expressão de GAPDH em cada amostra. Os dados são apresentados como média ± SEM. ***

P

0,001. (B) Análise de qRT-PCR da expressão B1 ciclina em doentes com cancro colorectal, com ou sem metástase ganglionar. Os dados são representados como uma 2

-ΔΔCT (tumoral /normal). *

P Art 0,05. (C) A análise estatística dos níveis de expressão B1 relativa ciclina em tecidos de câncer colorretal, com ou sem metástases à distância. Os dados são apresentados como média ± SEM. *

P Art 0,05. (D) Avaliação do nível relativo expressão da ciclina B1 em tecidos de câncer colorretal de estágio TNM I, II, III e IV. Os dados são apresentados como média ± SEM. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; NS, não significativo. (E) de transferência de Western de validação do nível de proteína ciclina B1 em tecidos normais (N) colorectal e tecidos de cancro colorectal (CA) com metástases (M +) e sem (M ~). GAPDH foi aplicada para a normalização. A intensidade relativa de proteína ciclina B1 foi mostrado nos seguintes gráficos de barras. Os dados são apresentados como média ± DP. ***

P Art 0,001. *

P Art 0,05.

expressão B1 ciclina está negativamente associado com a diminuição da sobrevivência no cancro colorectal

Para avaliar o potencial prognóstico da ciclina B1 no cancro colorectal, analisamos a associação entre ciclina expressão B1 e duração de sobrevivência usando análise de Kaplan-Meier com o teste de log-rank. Nós inicialmente traçada a curva ROC (ROC) para ciclina B1 (Fig 2A). De acordo com o índice de Youden máxima, o valor ideal de corte para a expressão de ciclina B1 foi de 3,33 vezes no tumor /não tumor. Em seguida, os 150 pacientes com câncer colorretal foram divididos em dois grupos: alta ciclina grupo expressão B1 (n = 88) que ciclina expressão B1 relação ≥ 3,33, e baixa grupo expressão B1 ciclina (n = 62) que ciclina relação de expressão B1 3,33, de acordo com o nível de corte (Fig 2B). Kaplan-Meier de análise de estimativa revelou uma correlação entre o nível de expressão B1 ciclina e os tempos de sobrevida global. Os doentes com um baixo nível de ciclina B1 tinha uma taxa de sobrevivência de, obviamente, menor do que aqueles com um elevado nível de expressão da ciclina B1 (

P

= 0,002) (Figura 2C).

(A) O nível de corte ideal da ciclina B1 expressão relativa foi determinada com base no maior sensibilidade e especificidade de receptor por análise da curva (ROC) característica para a sobrevivência global. Área sob a curva (AUC) da ROC foi de 0,90. (B) De acordo com o valor de corte ideal (3,33 vezes), 150 pacientes com câncer colorretal foram divididos em dois grupos: ≥ 3,33 foram considerados como um grupo de expressão elevada ciclina B1 (n = 88); 3,33 foram considerados como um grupo de baixa expressão da ciclina B1 (n = 62). análise de sobrevivência (C) de Kaplan-Meier de acordo com a expressão B1 ciclina em pacientes com câncer colorretal (teste log-rank). (D) as curvas de sobrevida global cumulativas de pacientes com ciclina B1 altos ou baixos níveis de expressão por análise multivariada.

Para determinar se a expressão da ciclina B1 é um indicador independente de survical geral para pacientes com câncer colorretal, primeiro utilizado um modelo de risco proporcional de Cox univariada para estimar a razão de risco individual para todas as características clinicopatológicas. Os resultados revelaram que a sobrevida global foi significally relacionado com o nível de ciclina expressão B1 (RR = 2,062; 95% CI, 1,273-3,340; P = 0,003) e outras quatro parâmetros (tamanho do tumor, metástases em linfonodos, metástases à distância, e estágio TNM ; todos

P Art 0,05). No entanto, na análise multivariada, o modelo de riscos proporcionais de Cox incluindo expressão da ciclina B1, tamanho do tumor, metástase linfonodal e metástases à distância, o tamanho do tumor identificado, metástases em linfonodos e metástases à distância, como os indicadores prognósticos independentes para a taxa de sobrevida global de pacientes com câncer colorretal (HR: 0,564, P = 0,022; HR: 0,205, P = 2,0 × 10

-8; HR: 0,148, P = 1,0 × 10

-6, respectivamente), mas não ciclina expressão B1 (p = 0,45) (Figura 2D). Os valores estatísticos de expressão B1 ciclina e outras características clínico-patológicas derivadas do modelo de regressão de riscos proporcionais de Cox são apresentados na Tabela 2.

Supressão de ciclina B1 facilitado capacidade migratória em diferentes células cancerosas colorretais

as observações acima nos levou a explorar o potencial função biológica da ciclina desregulamentação B1 na progressão do cancro colorectal. A capacidade de uma célula de tumor a sofrer migração permitiu que para mudar a posição no interior dos tecidos, e este processo permite que as células tumorais a sair do seu tumor primário [40]. Assim, avaliamos o efeito da ciclina B1 sobre a migração em células de cancro colo-rectal, utilizando ensaio Transwell. Três linhas celulares de cancro colorrectal, p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116, e SW480 foram transfectadas com específica ciclina B1 ou ARNsi de controlo negativo, respectivamente, como relatado anteriormente. Os resultados demonstraram que a inibição da ciclina B1 proeminentemente melhorada a capacidade migratória das células p53

+ /+ HCT116 em 127% (p = 1,45 x 10

-5) (Fig 3A). Da mesma forma, a capacidade de migração de p53

– /- HCT116 foi também aumentou notavelmente por 193% (p = 3,30 x 10

-8) (Fig 3B), após a supressão da expressão da ciclina B1. Além disso, a actividade de migração em células SW480 Ciclina B1 de siRNA-transfectadas aumentou significativamente em 155% (p = 2,85 x 10

-6) (figura 3C), em comparação com as células de controlo. Estes dados indicam Ciclina B1 exerce uma função supressora de migração em células de cancro colo-rectais humanos e este efeito é independente do tipo de célula.

(A, B, C) Transwell ensaios de migração de p53

+ /+ HCT116 , p53

– /- células HCT116 e SW480 foram realizados após transfecção com a ciclina B1 siRNA ou um controlo negativo, respectivamente. Imagens representativas de ensaio de migração foram mostrados. Em todos os painéis, os resultados são representativos de pelo menos três experiências independentes. NC, controle de siRNA negativo. Os dados representam a média de três experiências independentes ± DP. ***

P

0,001

Knockdown de ciclina B1 promove a invasão de células de câncer colorretal

celular invasão é um processo celular intrínseco pelo qual as células responder a extracelular. estímulos para percorrer e degradar a matriz extracelular (ECM). No cancro, a invasão de células permite que as células cancerosas para adquirir a capacidade de entrar em vasos linfáticos e /ou difusão de sangue para dentro da circulação, seguido por invasão de órgãos distantes para crescimento metastático [8, 40]. Para investigar o potencial efeito da ciclina B1 na invasão celular em células de câncer colorretal, foi utilizado o ensaio de Matrigel Invasion para detecção. Descobrimos que a depleção de Ciclina B1 resultou em um aumento de 1,82 vezes e 1,72 vezes no número de células invasoras em ambas p53

+ /+ HCT116 e p53

– /- células HCT116 (p = 6,88 x 10

-6; p = 6,70 x 10

-6, respectivamente) (Fig 4A e 4B). Da mesma forma, a inibição da ciclina B1 também aumentou a actividade de invasão de células SW480 por 4,47 vezes (P = 2,07 × 10

-7) (Figura 4C). Colectivamente, estes resultados sugerem Ciclina B1 inibe a invasão de células de cancro colorrectal.

(A, B, C) O efeito da ciclina B1 na invasão celular foi detectado em três linhas celulares de cancro colorrectal, p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116 e células SW480, usando transpo� ensaios de câmara. As câmaras foram revestidas com Matrigel, que funciona como matriz celular extracelular. Imagens representativas de células invadidas são mostrados. Os dados são representativos de três experiências independentes. As barras de erro representam SD. ***

P .

0,001

A inibição da ciclina B1 diminui o nível de E-caderina em linhas celulares de cancro colorrectal

Dado que a ciclina B1 negativamente correlacionada com migração de células de câncer colorretal avançado e invasão, examinamos se EMT é um mecanismo subjacente. A desregulação da E-caderina foi considerado como a principal molécula crítica na metástase de células de cancro de EMT-mediada. Aqui, exploraram o papel da ciclina B1 na regulação da expressão de E-caderina nas três linhas celulares de cancro colorrectal acima. Figura 5A e 5B ambos mostraram que Ciclina B1 ARNsi transfecção em p53

+ /+ HCT116 e p53

– /- HCT116 diminuiu fortemente nível de expressão da proteína E-caderina, respectivamente (p = 0,038; p = 0,011, respectivamente) . Além disso, em Ciclina B1 ARNsi-tratados células SW480, a expressão da proteína E-caderina foi claramente reduzido em comparação com a expressão em células transf ectadas de controlo negativo (p = 0,0006) (Figura 5C). Os nossos dados indicam que a inibição da ciclina B1-mediada de invasão celular pode ocorrer por meio de regulação da expressão de E-caderina.

(A, B, C) 72 horas após a transfecção com 50 nM de ciclina B1 ou ARNsi de controlo negativo, o os níveis de proteína endógena de e-caderina e Ciclina B1 em p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116 e células SW480 foram analisadas por western blotting e quantificado. As barras mostram os níveis de proteínas relacionadas que são normalizados para GAPDH. Os dados representam a média de três experiências independentes ± DP. *

P

0,05; ***

P .

0,001

A inibição da ciclina B1 regula negativamente a expressão da caderina-E in vivo

Para determinar se ciclina B1 altera a expressão da caderina-E in vivo, foi avaliada a expressão de E-caderina nos anteriores modelos de xenoenxerto de tumor [37] por coloração imuno-histoquímica. Como mostrado na Fig 6A, nível de E-caderina foi significativamente diminuído em ciclina p53 supressora de tumores B1

+ /+ HCT116, em comparação com os tumores de controlo não-supressora B1 ciclina. Analogamente, a proteína E-caderina foi também obviamente regulada negativamente em Ciclina B1-supressora SW480 tumores, em comparação com os tumores de controlo (Fig 6B). Estes dados sugerem ainda mais o efeito da ciclina B1 sobre a expressão da caderina-E

(A) Imagens (X200; x400). Representando coloração imuno-histoquímica de E-caderina em p53

+ /+ tumores HCT116 que expressam ciclina B1 shRNA ou controle de vetores. (B) Representar imagens (X200; x400). De E-caderina nos tumores SW480 que expressam ciclina B1 shRNA ou controle de vetores

Discussão

As principais causas de mortalidade relacionada com o cancro colorectal são devido às complicações resultantes da metástase. De acordo com estatísticas de câncer, espera-se que aproximadamente 60% dos pacientes com cancro colorectal de desenvolver metástases. Apesar de várias abordagens de tratamento têm sido desenvolvidas recentemente para câncer colorretal, os pacientes com cancro colo-rectal avançado ou metastático ainda tem mau prognóstico. Neste estudo, mostramos que a ciclina B1 suprimida invasão câncer colorretal e metástases através da regulação da expressão de E-caderina.

A regulamentação da progressão do ciclo celular ordenada é essencial para células para manter a integridade genômica que é vital para a sobrevivência da célula e controlada proliferação. As ciclinas são uma família de proteínas que variam nos seus níveis de expressão, durante o ciclo celular para activar as quinases dependentes de ciclina específicas necessárias para a progressão através do ciclo celular. Entre eles, ciclina B1 é de interesse primordial porque acreditava-se inicialmente que a ciclina B1 controlada barreira da fase G2-M e regulamentado o início correto da mitose, que são ambos essenciais para a síntese de DNA e proliferação celular. evidências acumuladas mostraram que ciclina B1 foram sobre-expressos em câncer de mama, carcinoma epidermóide de esôfago, câncer de pulmão, câncer gástrico, câncer hepatocelular, e outras células cancerosas [31, 32, 41-43]. evidência estatística sugeriu que ciclina B1 foi relacionada com a malignidade do tumor. Além disso, a sobre-expressão de ciclina B1 foi identificada como um marcador de prognóstico pobre promissores em pacientes com cancro hepatocelular, cancro do pulmão de células não pequenas, e carcinoma de células escamosas da cabeça-pescoço [32, 34, 43]. No entanto, de Chae et ai. [44] relatou que ciclina expressão B1 não teve influência na sobrevivência de pacientes com câncer de mama. Björck et ai. [38] relataram que pacientes com linfoma folicular expressando maior nível de ciclina B1 apresentou melhor resultado após a quimioterapia, em comparação com pacientes que expressam menor nível de ciclina B1. Estes resultados discordantes pode ser explicado por o padrão de expressão da ciclina B1 diferente em diferentes tipos de tumores. Nós encontramos anteriormente de que ciclina B1 foi sobre-expresso e importante para a proliferação celular e o crescimento do tumor através de promover a progressão do ciclo celular e /ou reduzir a apoptose em células de cancro colorrectal [37]. No entanto, o papel eo mecanismo da ciclina B1 na metástase do câncer colorretal não tem sido bem estudada.

Neste estudo, descobrimos nível de ciclina B1 expressão em tecidos de câncer colorretal também foi maior do que em tecidos nomal em uma grande painel de 150 pacientes, de acordo com os nossos dados anteriores. No entanto, ciclina B1 superexpressão foi negativamente correlacionada com características clinicopatológicas agressivos, como metástase linfática, metástase à distância, eo estádio TNM. Os pacientes que tiveram baixa expressão da ciclina B1 eram notavelmente pobre sobrevida global em comparação com os pacientes que tiveram alta expressão de ciclina B1. A análise univariada demonstrou que a ciclina B1 foi um indicador de prognóstico para a sobrevida global em pacientes com câncer colorretal, embora a análise multivariada mostrou Cylcin B1 não foi um fator prognóstico independente. Tomados em conjunto, estes resultados demonstraram claramente que o baixo nível B1 ciclina está associada com mau prognóstico e evolução clínica desfavorável do cancro colo-rectal. No entanto, nossos resultados não estão de acordo com outros dois estudos [35, 45]. Heike et ai. mostrou ciclina B1 superexpressão era nem associados às características tumorais histopatológicos nem mau prognóstico no câncer colorretal, enquanto Jia-Qing et al. revelou ciclina B1 superexpressão intensificou durante a carcinogênese, mas diminuiu durante a invasão, e depois voltou a aumentar durante a metástase do câncer colorretal.

Para apoiar ainda mais a nossa noção, o papel eo mecanismo da ciclina B1 na metástase foram detectados em câncer colorretal diferente modelos de celulares, p53

+ /+ HCT116, p53

– /- HCT116 e SW480. Nós forneceram provas de que knockdown de expressão da ciclina B1 mais células induzidas para se infiltrar através do matrigel e Transwell cordação em todas as três linhas de células de cancro, o que demonstra que a ciclina B1 suprime a metástase do cancro colo-rectal, regulando negativamente a migração celular e invasão. EMT tinha sido implicado como o passo chave na progressão de tumores em relação a invasão e metástase [9]. E-caderina foi de uma molécula de adesão célula-célula bem conhecido, que se formou epiteliais junções aderentes e de arresto CTNNB1. Nas mudanças de EMT, a supressão da E-caderina é um passo crucial durante a progressão de muitos cânceres, incluindo câncer colorretal [15, 46]. Será de particular importância para explorar o mecanismo subjacente que resultam na supressão da caderina-E. Apesar de muitas moléculas foram identificadas para modular a expressão da caderina-E [17, 47, 48], mais estudos ainda são necessários para elucidar as moléculas de sinalização importantes para a regulação da caderina-E. Aqui, nós demonstramos que ciclina B1 participou na regulação da expressão de E-caderina. A inibição da ciclina B1 subregulado proteína E-caderina em p53

+ /+ HCT116, p53

– células HCT116 e SW480 – /. Além disso, os ensaios de xenoenxerto in vivo também mostrou nível de E-caderina foi significativamente diminuída em ciclina p53 supressora de B1

+ /+ HCT116 e SW480 tumores, em comparação com tumores de controlo respectivos.