Abstract

Purpose

Nós descrever os efeitos do consumo de isoflavona de soja sobre antigénio específico da próstata (PSA), os níveis hormonais, colesterol total, e apoptose em homens com câncer de próstata localizado.

Metodologia /Principais achados

Foi realizado um estudo duplo-cego, randomizado, controlado por placebo, para examinar o efeito de cápsulas de isoflavonas de soja (80 mg /d de isoflavonas totais, 51 mg /unidades aglucon d ) sobre biomarcadores séricos e teciduais em pacientes com câncer de próstata localizado. Oitenta e seis homens foram distribuídos aleatoriamente para tratamento com as isoflavonas (n = 42) ou placebo (n = 44) durante até seis semanas antes da prostatectomia programada. Foram realizadas análises de microarray utilizando um chip de gene alvo regulação do ciclo celular e apoptose (GEArrayTM). As alterações na testosterona total no soro, a testosterona livre, estrogénio total, o estradiol, PSA, e colesterol total foram analisados ​​na linha de base, ponto médio, e no momento da prostatectomia radical. Nesta análise preliminar, 12 genes envolvidos no controle do ciclo celular e 9 genes envolvidos na apoptose foram regulados negativamente nos tecidos tumorais tratamento versus o controle placebo. Mudanças na testosterona sérica total, testosterona livre, o estrogênio total, o estradiol, PSA, e colesterol total no grupo tratado com isoflavona comparação com os homens que receberam placebo não foram estatisticamente significativos.

Conclusões /Significado

estes dados sugerem que a ingestão de curto prazo de isoflavonas de soja não afetou os níveis séricos de hormônios, o colesterol total, ou PSA

registo julgamento

ClinicalTrials.gov NCT00255125

Citation.: Hamilton-Reeves JM, Banerjee, S, Banerjee SK, Holzbeierlein JM, Thrasher JB, Kambhampati S, et al. (2013) Intervenção de Curto Prazo soja isoflavona em Pacientes com câncer de próstata localizado: um estudo randomizado, duplo-cego, placebo-controlado. PLoS ONE 8 (7): e68331. doi: 10.1371 /journal.pone.0068331

editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne Escola de Medicina da Universidade de Estado, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de dezembro de 2012; Aceito: 28 de maio de 2013; Publicação: 12 de julho de 2013

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. O “Isoflavonas de Soja no Estudo do cancro da próstata” foi apoiada por VA bolsas de mérito Revisão (PV, SB, SKB) e da Universidade do Kansas Centro de câncer programa Pilot Grant (JHR). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é o câncer não-cutâneo mais comum em homens americanos [1]. Estudos epidemiológicos associado consumo de alimentos de soja em populações asiáticas com uma diminuição no risco de cancro da próstata [2], [3], embora a concentração de genisteína plasma não tem sido associada com o risco de cancro da próstata em exposições dietéticas típicas das populações ocidentais [2] – [4] . As concentrações circulantes de isoflavona de soja em homens japoneses são pelo menos 10 vezes maior do que o americano [5], [6] e homens europeus [4]. A dieta japonesa rica em soja típico consiste de 25-100 mg de isoflavonas de soja /dia, enquanto uma dieta americana típica contém cerca de 2-3 mg de isoflavonas de soja /dia [7]. estudos de migração de homens asiáticos sugerem que as suas taxas de incidência de câncer de próstata aumenta em relação direta com o tempo de permanência residente nos Estados Unidos [8], [9]. Da mesma forma, incidência e mortalidade por cancro da próstata tem aumentado nos países asiáticos simultaneamente com a ocidentalização da sua dieta [10].

Os componentes da dieta de soja pensado para suprimir o câncer são a isoflavonas de soja daidzeína, genisteína e gliciteína. As isoflavonas de soja ligam-se a receptores de estrogénio e de exercer efeitos hormonais. As duas isoflavonas principais da soja são a genisteína e daidzeína. Daidzeína é convertido para equol no intestino de certos indivíduos. As isoflavonas acumular na glândula da próstata [10] e foram mostrados para modular as hormonas endógenas relevantes para a carcinogénese da próstata [11], [12]. As isoflavonas de soja também exercer efeitos não hormonais para suprimir o câncer através de vias que visam ciclo celular e apoptose, como G2 M prisão /e expressão p21

in vitro

em células cancerosas andrógeno PC3 próstata independentes [13]. Soy isoflavona inibição induzida da proliferação celular e indução de apoptose são parcialmente mediadas através da regulação da rede de sinalização Akt /FOXO3a /GSK-3b /AR [14].

intervenções de isoflavona de soja curto prazo em pacientes com câncer de próstata tiveram resultados contraditórios. Em um não-cego julgamento não randomizado, de 38 pacientes (20 com câncer de próstata clinicamente significante e 18 controles), um consumo diário de 160 mg /d de isoflavonas derivadas do trevo vermelho por cerca de 20 dias até a prostatectomia radical levou a significativamente maior apoptose de células tumorais [15]. Nos homens com câncer de próstata, a soja ou o consumo de isoflavonas diminuiu significativamente significa PSA total no soro em comparação com controles [16] – [18], apesar de vários estudos não demonstraram efeitos estatisticamente significativos sobre PSA nesta população [15], [19], [20]. Os efeitos de abaixamento de colesterol de alimentos de soja são pensados ​​principalmente para ser mediada através da proteína de soja [21]; embora recentemente, uma intervenção só de genisteína em pacientes com câncer de próstata localizado diminuiu significativamente o colesterol total e essa mudança foi estatisticamente significativa em comparação com o placebo [18].

Nós já publicamos dados de um estudo piloto realizado pela nossa de laboratório em uma coorte de 13 pacientes com cancro da próstata (sem qualquer tratamento prévio), que foram tratados com um suplemento de isoflavona de soja contendo 112 mg de isoflavonas totais (n = 4), 168 mg de isoflavonas totais (n = 3), ou 224 mg de isoflavonas totais ( n = 4). Estes dados piloto mostraram uma redução na PSA, testosterona, e estrogénio, e um efeito variável na expressão ERa com a infra-regulação da expressão do receptor visto aos 224 mg de isoflavonas totais por nível de dose dia, enquanto não houve nenhum efeito observado sobre a expressão de AR [22 ].

o presente estudo duplo-cego, randomizado, controlado por placebo foi desenhado para investigar mais profundamente a eficácia do consumo total de isoflavona de soja em uma coorte maior de homens monitorando os níveis hormonais séricos, colesterol total e PSA . Além disso, foram avaliados os efeitos sobre o tumor e tecido prostático normal adjacente com matrizes de genes para a regulação do controle do ciclo celular e apoptose em homens com câncer de próstata localizado.

Resultados

Detalhes do estudo

Oitenta e sete indivíduos foram selecionados para o estudo; 1 optou por não participar (Figura 1). Vinte e três indivíduos não completaram a terceira visita porque sua cirurgia ou terapia de radiação data de tratamento ocorreu antes da última visita foi agendada. Cinquenta e seis dos pacientes foram submetidos a prostatectomia [placebo (n = 27), isoflavona de soja (n = 29)]. Vinte e oito sujeitos a terapia de radiação eleito no final do estudo [placebo (n = 16), isoflavona de soja (n = 12)] e 2 sujeitos escolheram vigilância activa [placebo (n = 1), isoflavona de soja (n = 1)]. Todos os 86 pacientes completaram 2 semanas do estudo, com boa adesão, e 63 sujeitos completaram o estudo completo. Dos 86 participantes, 74 amostras de urina de ponto de tempo de 2 semanas foram analisável para metabólitos urinários de fitoestrógenos (daidzeína, genisteína, glyctein, O-desmethylangolensin, dihidrodaidzeína, e equol). Os participantes concordaram em evitar a ingestão de soja na dieta e não tomar quaisquer novos suplementos. No entanto, dois participantes no grupo de placebo mostrou altas concentrações de metabolitos urinários fitoestrogénio, sugerindo que eles eram consumidores de soja a partir de outras fontes. Todos os participantes analisados ​​no grupo de intervenção parecia estar em conformidade, e 29% (10/35) foram classificados como produtores equol, determinando se o seu (equol: daidzeína) log 10. Relação era maior que -1.75 [23]

eventos adversos

Todos os eventos adversos foram Grau 1 (leve). No braço de isoflavona, 4 eventos foram registrados: 2 gastrointestinal e 2 geral. No braço do placebo, 9 eventos foram registrados: 6 gastrointestinal e 3 geral. Nenhum paciente abandonou o tratamento devido a eventos adversos.

Linha de Base Características

antropométricos basais, demografia, estágio clínico, e atividade física não diferiu entre os grupos (Tabela 1). Não houve diferenças na hormona do soro da linha de base, as concentrações de colesterol e de PSA entre os grupos (Tabela 2).

marcadores séricos

Não há modulações significativas de testosterona total no soro, testosterona livre, o estrogênio total, o estradiol, antígeno específico da próstata, ou colesterol total foram observados no grupo tratado com isoflavona comparação com os homens que receberam placebo (Tabela 2).

Marcadores de tecido

gene do ciclo celular expressão.

Doze genes envolvidos no ciclo celular foram sub-regulada no tecido prostático maligno tratado com soja quando comparado ao tecido maligno tratado com placebo, respectivamente (FIGURA 2). O conjunto de genes do ciclo celular demonstrou a regulação negativa do ciclo de divisão celular 27 (CDC27), envolvidos em interacções proteína-proteína e tempo de mitose; apoptótica fator peptidase de ativação 1 (APAF1), envolvidos na iniciação de apoptose; B2 ciclina (CCNB2), envolvido no fator de crescimento transformador controle do ciclo celular mediada por beta; G1 cyclin (CCNG1) e G2 ciclina (CCNG2), activado pela proteína p53 do tumor; ciclina C (CCNC), envolvida na fosforilação da RNA polimerase II; ubiquitina-como modificador de activação da enzima 1 (UBE1), envolvida na marcação de proteínas celulares para a degradação; Cullin 2 (Cul2) e Cullin 3 (CUL3); fator de transcrição E2F 4 (E2F4); cinase 2 checkpoint (CHEK2) a expressão do gene; e ataxia telangiectasia mutado (ATM), um importante ponto de verificação do ciclo celular.

A figura mostra a relação entre o gene de GAPDH.

apoptose expressão do gene.

nove em genes envolvidos na apoptose foram sub-regulada no tecido prostático maligno tratado com soja quando comparado ao tecido maligno tratado com placebo, respectivamente (Figura 3). O conjunto de genes de apoptose demonstrado infra-regulação de CD40, envolvido numa variedade de respostas imunitárias e inflamatórias; -Células B de linfoma não-Hodgkin-2 (BCL-2); baculoviral IAP repetição contendo 1, 2, e 6 (BIRC1 /NAIP, BIRC2, BIRC6), envolvidos no bloqueio da apoptose; proteína X associada ao BCL2 (BAX); TRAF associado membro familiar ativador NFKB (tanque); HUS1, e caspase 7 (CASP7) a expressão do gene.

A figura mostra a relação entre o gene de GAPDH.

Discussão

Apesar de os dados de nossa investigação piloto [22], não observamos mudanças significativas nas concentrações de PSA ou hormonais neste ensaio clínico maior fase II. O nosso estudo anterior relataram uma redução na PSA, testosterona, e estrogénio em 13 pacientes consumindo o mesmo suplemento de isoflavona em diversas dosagens. Embora a formulação de suplemento foi idêntico em ambos os estudos, as diferenças no resultado pode ser devido ao tamanho da amostra maior e a grande variabilidade de PSA e soro hormônios no presente estudo. Nossa análise exploratória no estudo atual sugere que a ingestão de isoflavonas de soja pode alterar a expressão genética no tecido da próstata.

Nossos resultados para hormônios séricos são consistentes com estudos anteriores. Uma meta-análise de 32 estudos publicados em 2010 por Hamilton-Reeves et al. relataram que o consumo de alimentos de soja não está associado com efeitos significativos na testosterona livre ou testosterona circulante em homens [24]. Recentes publicações desde o meta-análise não mostraram efeitos significativos da ingestão de isoflavonas sobre a testosterona [18], [25], [26]. Os dados para as concentrações de estrogênio no sangue estão disponíveis para quatorze estudos, que consiste em cinco ensaios clínicos randomizados [11], [27] – [30]. Apenas um estudo relatou um aumento significativo nas concentrações de estradiol no sangue de linha de base com 40 mg /d de isoflavonas, mas não a 60 ou 80 mg /d de suplementação de isoflavonas, e comparação estatística com o grupo placebo não foi publicada [29]. Em resumo, a ingestão total de isoflavonas não parece influenciar hormônios sexuais que circulam de um consumo comparável à ingestão alimentar em países asiáticos como a dose administrada no presente estudo.

Nossos achados em relação colesterol total estão em contraste com uma meta- a análise mostra uma diminuição do colesterol total com isoflavonas de soja, quando consumidos em alimentos de soja [21]. A teoria de que os componentes a partir da própria proteína de soja diminuir o colesterol pode explicar por que razão as isoflavonas única não iria provocar o mesmo efeito. No entanto, um relatório recente mostrou um decréscimo de 4% no colesterol total em doentes com cancro da próstata que consumiram 30 mg de genisteína sintética comparativamente ao placebo [18]. A explicação provável para estes resultados contrastantes em comparação com o nosso estudo deve-se à formulação de suplemento determinado neste ensaio. O suplemento de isoflavona de soja foi obtido a partir de gérmen de soja, que oferece uma mistura de isoflavonas de soja, que é maior em daidzeína de genisteína. Além disso, nós não estratificar a nossa randomização com base nos valores de pré-tratamento de colesterol total, mas fez incluem o valor basal como covariável no modelo estatístico.

suplementações de isoflavona em doses semelhantes a este estudo ter mostrado geralmente nenhum efeito sobre a redução das concentrações de PSA em homens com cancro da próstata localizado. Os resultados para PSA no soro são consistentes com alguns [19], [20], [28], [31], mas nem todos os relatórios [16], [17], [32] – [34]. PSA total reduzido em 4% quando um suplemento rico em isoflavonas foi dado como parte de uma dieta intensiva e intervenção estilo de vida em pacientes com câncer de próstata que sugere mudanças mais dramáticas na ingestão dietética do que a adição de isoflavonas pode ser necessária para alterar PSA em homens com câncer de próstata localizado [16]. É possível que uma intervenção mais longa ou follow-up pode ter rendido um efeito inibidor significativo de isoflavonas sobre PSA, apenas 2 casos de semana de 5 e 4 casos de semana de 6 (num total de 42 casos do grupo de tratamento com isoflavona) estavam disponíveis para PSA testes.

para o nosso conhecimento, este estudo foi um dos primeiros a comparar os efeitos do consumo total de isoflavonas de soja sobre a expressão gênica no tecido prostático obtido a partir de um estudo de intervenção humana. No entanto, existem várias limitações do nosso estudo, incluindo a falta de estratificação dos resultados com base na pontuação de Gleason, estágio patológico, ou PSA. Isto pode influenciar o efeito de soja especialmente nas vias apoptóticas. Além disso, foram analisadas apenas um número muito pequeno de amostras de tecido, assim, os resultados devem ser validados com uma amostra maior. Além disso, dada a múltiplos focos de cancro, as diferenças conjunto de genes a partir das amostras entre os grupos não pode representar a expressão do gene no tecido como um todo. Novamente, o pequeno tamanho da amostra pode ter levado a um viés de amostragem; no entanto, foi avaliada tanto do tumor e tecido normal e poderia prever que o efeito do efeito de isoflavonas de soja seria equivalente por todo o tecido.

Conclusões

A ingestão de isoflavonas de soja aparecem seguro com eventos adversos única leves relatados e não há efeitos sobre as hormonas de soro. Uma avaliação mais aprofundada do papel das isoflavonas de soja na indução de apoptose e ciclo celular controle é garantido no cenário preventiva e terapêutica.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O DPS Institucional Review Board: Seres Humanos Comissão eo Kansas City VAMC Institutional Review Board aprovou o protocolo do estudo. Todos os pacientes assinaram um consentimento informado antes da participação no estudo. O protocolo para este ensaio e apoiando lista de verificação CONSORT estão disponíveis como informação de apoio; veja Checklist S1 e Protocolo S1.

Os pacientes

Entre abril de 2006 e maio de 2009, 86 homens com câncer de próstata localizado, foram recrutados pela Universidade de Kansas Hospital (DPS) Urology Clinic and the City Kansas Veterans Affairs Medical Center (VAMC). Pacientes com estágio clínico T1 ou T2 câncer de próstata (utilizando Comité Misto Americana sobre critérios de câncer) e os candidatos cirúrgicos foram considerados eram elegíveis para o estudo. Os pacientes em quimioterapia concomitante, radioterapia ou terapia hormonal neoadjuvante foram excluídos do estudo. Os pacientes que consumiram alimentos de soja nos 90 dias anteriores à inscrição também foram excluídos, e ingestão de soja antes foi determinada no início do estudo por meio do questionário validado alimentos de soja [35]. Também foram excluídos pacientes com uma história conhecida de alergia a soja ou intolerância. Durante o curso do estudo, os pacientes concordaram em evitar a ingestão de soja na dieta e não tomar qualquer nova suplementação de vitaminas ou fitoterápicos.

Estudo Design by

controlado por placebo, duplo-cego, randomizado, julgamento paralelo foi realizado, no qual 86 homens com diagnóstico histológico de câncer de próstata que seriam submetidos a prostatectomia receberam cápsulas de isoflavonas de soja (Flav-ein, 3 B Ltd, Lenexa, KS) ou correspondentes cápsulas de placebo. Os pacientes foram divididos aleatoriamente em sequencialmente um dos dois braços. Aleatório aleatorização bloco permutada foi utilizado para manter as alocações equilibrados em vários pontos ao longo do paciente inscrição. O estatístico gerado códigos e forneceu uma cópia deles para os farmacêuticos. A farmácia distribuiu os suplementos para os pacientes. O cego foi mantida pelo farmacêutico e o estatístico até ao final do estudo. Os 42 pacientes randomizados para isoflavonas de soja que contribuem recebeu cápsulas 51 mg de equivalentes totais de isoflavonas agliconas /D com uma distribuição média de isoflavonas de 55% de daidzeína, 30% gliciteína, e 15% de genisteína, tal como analisada por NP Analytical Laboratories em St. Louis, MO. Os 44 pacientes que receberam suplementação placebo consumido 0,06 mg total de equivalentes de isoflavonas agliconas /d. Ambos os grupos consumiram as cápsulas em doses divididas duas vezes por dia. Os pacientes tomaram a última dose do suplemento a noite antes da admissão para a cirurgia. As cápsulas foram adquiridos em grandes quantidades, a fim de minimizar a variação no teor de isoflavona que pode ocorrer a partir de lote para lote. Os indivíduos foram instruídos a consumir suas dietas habituais, e para excluir os produtos de soja, a fim de minimizar o consumo de isoflavonas de outras fontes. Para avaliar a conformidade no ponto de tempo de 2 semanas, a concentração urinária de seis isoflavonoids [genisteína, daidzeína, gliciteína, equol, DHD e ODMA] foram medidos na Universidade de Minnesota usando uma alta pressão cromatografia líquida-espectrometria de massa (LC- método de MS /MS) modificado da metodologia publicada [36]. Os dados foram normalizados através do ajuste com a excreção de creatinina ea creatinina urinária foi analisada por Kansas City VA Medical Center da usando um método do picrato alcalino cinética (Abbott 8200, Abbott Laboratories., Abbott Park, IL).

Collection Serum e Análise

no sangue em jejum foi coletada pela manhã, em 0, 2 semanas e um dia antes da cirurgia programada ou tratamento curativo. O último ponto de tempo variou por assunto com base na data marcada para a cirurgia. O tratamento não foi adiada para atender os requisitos do estudo. O soro foi separado e enviado para Quest Diagnostics (Lenexa, KS) para análise. As amostras de soro foram analisadas quanto à testosterona total por cromatografia líquida com espectrometria de massa em tandem, testosterona livre por diálise de equilíbrio, o estrogénio total através de radioimunoensaio, estradiol e antigénio específico da próstata (PSA) por imunoensaio quimioluminescente, e o colesterol total pelo ensaio enzimático.

Recolha de tecidos e Análise

no momento da cirurgia e amostras de núcleo, ainda no centro cirúrgico, o cirurgião urológico obtidos tanto da próstata normal adjacente e tecido tumoral a partir de cada amostra da próstata. Em resumo, a próstata foi seccionado e o tumor identificados com base na palpação, visualização e localização do cancro conhecidos. Estes núcleos foram em seguida colocados imediatamente em azoto líquido e transferidos para o laboratório para processamento. No laboratório foi obtida uma (5 uM) fina secção congelada do núcleo e H E coradas. Esta seção foi então analisado por um patologista que confirmou a presença de cancro ou tecido normal em cada amostra de núcleo. A amostra de núcleo foi então marcado, colocado em meios de armazenamento, e mantido até a análise. Este processo de coleta de núcleo não interferiu com a avaliação posterior processamento e tumor patológico.

ciclo celular e apoptose Gene Arrays

A fim de identificar o ciclo celular dependente de soja e relacionados com a apoptose perfil de expressão gênica em amostras de tumores, utilizou-se do ciclo celular humana e kits de análise de expressão gênica SuperArray apoptose (série GEArray-Q 01001, Super matriz Co, MD). O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol, tal como descrito anteriormente [37] a partir de duas amostras de doentes seleccionados aleatoriamente, um que consumiram isoflavonas e um que tomaram o placebo. Em seguida, marcado com biotina a síntese de ADNc, e a hibridação com a membrana foi realizada de acordo com as instruções do fabricante para o conjunto de genes de nosso interesse. Os sinais foram detectados usando os tampões e condições optimizadas experimentais. Os dados foram corrigidos para o fundo e normalizada a um gene housekeeping.

Análise Estatística

O tamanho da amostra foi determinado a partir de um estudo piloto anterior, utilizando a mesma formulação suplemento [22]. Os dados do estudo piloto indicou que o total de reduções de estrogénio no soro seria 0 e 47 no grupo de controlo e tratamento, respectivamente, com um desvio padrão comum de 36. A partir do mesmo estudo piloto previmos que a redução de soro de testosterona seria 0 e 1,36 para o controle e tratamento braço, respectivamente, com um desvio padrão comum de 2. O tamanho da amostra foi calculado com dois parâmetros primários, estrógeno sérico total e testosterona, em um nível de dois lados de significância de 0,025. Usando um t de duas amostras-teste, 43 indivíduos por grupo nos deu o poder de 95% para detectar a diferença esperada nos níveis de estrogênio e 80% de energia para detectar a diferença esperada nos níveis de testosterona.

As características basais foram comparados com t -Testes para variáveis ​​contínuas depois de verificar os pressupostos de normalidade eo teste exato de Fisher para as variáveis ​​categóricas. Este experimento utilizou um desenho de medidas repetidas e as análises para os resultados de soro foram conduzidos utilizando Proc Mixed que permite a modelagem de ambos os meios de resultado de soro e a estrutura de covariância, o que é necessário para estes projetos. Dois modelos distintos foram considerados, uma análise do modelo de covariância foi utilizado para comparar os grupos ajustadas quanto ao valor da linha de base do resultado utilizando uma variável adicional para a observação de base e uma variável de classe tempo para os restantes dois pontos de tempo, e um segundo modelo que fez não dividir a observação inicial como uma variável separada. Para todos os resultados de soro e modelos, um tratamento por semana interacção foi considerada. Ambos os modelos usaram uma estrutura de covariância autoregressive AR (1), que foi selecionado com base em modelo estatísticas de ajuste de Proc Mixed ea estrutura de correlação esperada para o experimento. Um nível de significância de

p Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Todas as análises foram realizadas utilizando o software SAS versão 9.3 TS Nível T1M0 (SAS Institute, Inc., Cary, NC).

Informações de Apoio

Checklist S1.

CONSORT Checklist

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068331.s001

(DOC)

Protocolo S1.

Julgamento Protocolo

doi:. 10.1371 /journal.pone.0068331.s002

(DOC)

Reconhecimentos

Os autores gostariam de agradecer a Sara Spencer, Christopher Bairl e Neela Saxena para assistência com visitas clínicas, entrada de dados e ensaios de matriz gene.