Abstract

Primeira linha de tratamento de pacientes com câncer de próstata resistente à castração (CRPC) envolve principalmente a administração de quimioterapia docetaxel. Infelizmente, a resistência ao tratamento com docetaxel é uma ocorrência final. Alterações no receptor de andrógeno (AR) expressão e de sinalização são mecanismos subjacentes resistência ao tratamento com docetaxel em CRPC associado. proteína de choque térmico 90 (Hsp90) é uma chaperona molecular, que regula a activação, maturação e estabilidade de proteínas de sinalização críticos envolvidos no cancro da próstata, incluindo a AR. Este conhecimento e os recentes avanços em design e desenvolvimento composto destacaram Hsp90 como um alvo terapêutico atractivo para o tratamento da CRPC. Nós informou recentemente o desenvolvimento de uma castração MYC-Cap resistente (MYC-CAP /CR) modelo de tumor de transplante, que expressa amplificados do tipo selvagem AR. Dentro, relatamos que uma segunda geração Hsp90 inibidor, NVP-AUY922, inibe o crescimento celular e induz significativamente a morte celular em MYC-CAP /CR e linhas de células /CE2 Pten-tampão. NVP-AUY922 induziu degradação de proteassoma de AR, embora interessante porque não requerem a perda de proteína AR para inibir a actividade de transcrição AR. Além disso, NVP-AUY922 aumento da toxicidade do docetaxel no MYC-CAP /CR e linhas de células /CE2 Pten-Cap

in vitro

. Finalmente, NVP-AUY922 /terapia de combinação de docetaxel em ratinhos portadores de MYC-CAP /tumores CR resultou em maior actividade anti-tumoral em comparação com um único tratamento. Este estudo demonstra que NVP-AUY922 provoca uma potente actividade no sentido de sinalização AR e aumenta a resposta à quimioterapia em um modelo de rato com CRPC, fornecendo justificação para o desenvolvimento clínico contínuo de inibidores de Hsp90 em ensaios clínicos para o tratamento de pacientes com CRPC.

Citation : Ku S, Lasorsa E, Adelaiye R, S Ramakrishnan, Ellis L, Pili R (2014) a inibição da Hsp90 aumenta o tratamento com docetaxel em Castro resistente do cancro da próstata. PLoS ONE 9 (7): e103680. doi: 10.1371 /journal.pone.0103680

editor: Bandana Chatterjee, Universidade do Texas Saúde Science Center, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de julho de 2013; Aceito: 06 de julho de 2014; Publicação: 29 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ku et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi em parte financiado pelo Departamento de Defesa – PC094159 (LE) e do Instituto Nacional do Câncer – P50 CA58236 (RP). Os financiadores não têm nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores gostariam de declarar os seguintes conflitos: Roberto Pili tem sido um consultor pago e recebeu financiamento de pesquisa da Novartis. Como tal, isso não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Castro cancro da próstata resistente (CRPC) é um cancro da próstata incurável e agressivo (PCA) fenótipo. Durante vários anos, a opção de tratamento primário de CRPC tem sido limitada à quimioterapia docetaxel, que se prolonga a sobrevivência ainda que por um tempo limitado [1]. Embora o tratamento da CRPC tem sido extremamente desafiador, nos últimos 2 anos tem visto uma mudança dramática em opções terapêuticas para esta doença. A segunda cabazitaxel linha [2], a imunoterapia sipuluecel-T [3], o acetato de síntese de andrógenos inibidor de abiraterona [4], o enzalutamida antagonista do AR [5], e rádio-223 [6] todos recebemos recente aprovação da FDA para o tratamento da CRPC. Embora estas novas terapias têm expandido as opções de tratamentos para pacientes, supressão sustentável de crescimento CRPC continua a ser um desafio primário e novas estratégias de tratamento são ainda necessários.

Porque docetaxel é uma terapia eficaz, continua a ser um componente crítico para estratégia de tratamento de primeira linha de CRPC. Superando ambas adquiridas e intrínseca resistência ao docetaxel tem sido um grande desafio clínico e melhorar os resultados do tratamento para pacientes com resistência docetaxel é de alta prioridade. Com uma maior compreensão dos mecanismos subjacentes de resistência aos medicamentos, novas oportunidades terapêuticas estão surgindo. Isso pode criar caminhos para o tratamento de monoterapia de docetaxel CRPC resistência ou potencialmente re-sensibilizar os pacientes CRPC para o tratamento com docetaxel com novas estratégias de combinação.

Segmentação do eixo andrógeno-AR com acetato de abiraterona [4] e enzalutamida [5], em monoterapia, em pacientes com docetaxel resistente CRPC demonstrou um benefício clínico. Enquanto segmentação de acção directa AR é desejada, principalmente, a segmentação indireta, através da inibição de proteínas AR associados é uma abordagem atraente. A chaperona molecular a Hsp90 é um membro da família de proteínas de choque térmico [7] e verificou-se ser sobre-expressos em vários cancros, incluindo CaP. Hsp90 tem mais de 200 clientes documentada, incluindo a AR, onde Hsp90 evita a degradação do proteassoma e estabiliza a conformação AR pronta para ativação do ligando [7]. Porque Hsp90 interage com várias proteínas clientes, percebe-se que a inibição de Hsp90 poderiam potenciar um maior efeito anti-tumoral catastrófica quando comparados com as terapias mais directa dirigidas. Em estudos pré-clínicos, a inibição de Hsp90 sozinho [8], [9], ou, mais recentemente, em combinação [10], [11], produzido resultados promissores no tratamento de células APC. Infelizmente, inibidores de Hsp90 primeira geração não resultou em significativa eficácia em ensaios clínicos [12] – [14]. Estes inibidores iniciais Hsp90 conhecidos como análogos de geldanamicina, 17-alilamino-17 demetoxigeldanamicina (17-AAG) e 17- (dimethylaminotheyl-amino) -17-demetoxigeldanamicina (17 DMAG) foram atribuídos a falhar na clínica devido à baixa solubilidade e farmacocinética , hepatotoxicidade, susceptibilidade para efluxo de P-glicoproteína e a falta de metabolismo por enzimas de NQO1 /DT-diaforase [15].

NVP-AUY922 (AUY922) é uma amida isoxazol resorcinlyic (Fig. 1A) demonstrou ser um potente inibidor de Hsp90 [16]. AUY922 é um análogo não-geldanamicina, e não apresenta as limitações dos análogos de geldanamicina, e por isso tornando este agente mais promissor para o teste clínico. AUY922 medeia o seu efeito através da ligação ao domínio ATPase do terminal N de Hsp90 para inibir a função de chaperona da Hsp90. Esta acção leva à degradação proteossomal de várias proteínas de cancro relevante Cliente [16], incluindo AR [17]. AUY922 demonstrou actividade anti-tumor numa variedade de modelos de ratos pré-clínicos de tumores sólidos, incluindo o cancro da próstata PC3 célula e xenoenxertos de [16], [18]. Mais recentemente, os novos inibidores de Hsp90, incluindo geração AUY922 têm sido relatados para alcançar respostas biológicas em linhas celulares de cancro da próstata e tecido de cancro da próstata humano, quando comparado com a geldanamicina análogo 17-AAG [17]. Fase I e II estudos em malignidades hematológicas e tumores sólidos, incluindo câncer de mama e mieloma múltiplo, estão em curso com AUY922.

(A) Estrutura química da NVP-AUY922. (B) castrar resistentes linhas celulares (MYC-CAP /CR e Pten-CAP /EC2) foram tratadas com concentrações indicadas de AUY922 para 48h. As células aderentes foram fixadas com 70% de EtOH. O crescimento celular foi avaliada por coloração das células fixadas com violeta de cristal e medindo a absorvância a 570 nm. Cada ponto foi normalizada para o controlo não tratado (0) e é representado por 3 experiências independentes, média ± SE. células (C) MYC-CAP /CR e Pten-CAP /CE2 foram tratadas com concentrações indicadas de AUY922 para 48h. As células aderentes e não aderentes foram recolhidas e lavadas em PBS 1x. As células foram incubadas com iodeto de propídio e a morte celular foi avaliada por citometria de fluxo. Cada ponto representa a média ± DP de 3 experiências independentes. * Indica P 0,05 comparado com o controlo não tratado (0), por dois-tailed t-teste

O objectivo deste estudo foi para testar a capacidade de AUY922 para antagonizar a transcrição e /ou proteína. estabilidade da AR na castração resistente MYC-CAP /CR e /CE2 linhas celulares de cancro da próstata Pten-PAC, bem como um modelo de rato transplante recentemente desenvolvido em nosso laboratório [19], [20]. Além disso, quisemos investigar a antitumoral e eficácia terapêutica dos AUY922 como um agente único e em combinação com quimioterapia docetaxel.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

O animal Institute Cuidado e Uso Committee (IACUC) em Roswell Park Cancer Institute (RPCI) aprovou todos os protocolos de mouse utilizados neste estudo. Nossa ID aprovação /protocolo é 1137M.

cultura de células e reagentes

O isolamento de uma linha de células de castração resistente MYC-Cap.

A /linha celular CR MYC-CAP foi gerada a partir de nosso modelo de tumor relatado anteriormente MYC-Cap castração transplante resistentes [19]. MYC-CAP /peças tumorais Cr (~ 4 mm

2) foram colocadas numa placa de cultura de 6 poços e removido depois de ter sido cultivadas durante 24 horas em DMEM suplementado meios de glucose elevada (10% de FBS; 1% de penicilina /estreptomicina). As células aderentes foram uma população mista de células tumorais MYC-CAP /Cr e fibroblastos. Estas células foram cultivadas até cerca de 80% confluente. passagens em série destas culturas heterogêneas foi realizada, até que uma monocamada homogénea de MYC-CAP /células CR estava presente. MYC-cap linhas de células /CR foram subsequentemente cultivadas em meio DMEM (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C, 5% de CO

2. PTEN-CAP /cE2cE2 células foram uma gentil oferta do Dr. Roy-Burman (Universidade da Califórnia, Los Angeles, CA) e cultivadas em meio DMEM (Gibco) suplementado com 10% de soro fetal bovino e 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C, 5% de CO

2. células PC3 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC) e mantida em meio RPMI 1640 (Gibco) suplementado com soro bovino fetal a 10% e 1% de penicilina /estreptomicina a 37 ° C, 5% de CO

2.

para

in vitro

experiências, NVP-AUY922 (Novartis) foi dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) para a preparação de soluções de reserva (10 mM). O androgénio sintético, metiltrienolona (R1881, Sigma-Aldrich), foi dissolvido em etanol para a preparação de soluções de reserva (10 mM). O inibidor de proteassoma, MG132 (Sigma-Aldrich), foi dissolvido em DMSO para a preparação de soluções de reserva (10 mM). O inibidor da tradução, ciclo-heximida (Sigma-Aldrich), foi dissolvido em etanol para a preparação de soluções de reserva (5 mg /ml). Os anticorpos utilizados para imunotransferência e /ou imuno-histoquímica (IHC) foram anti-receptor de androgénio (Santa Cruz), GAPDH (Cell Signaling), c-myc (Epitomics) e activou caspase 3 (Cell Signaling). Para

In vivo

estudos, o docetaxel foi obtida a partir da farmácia Cancer Institute Roswell Park e diluído para 1 mg /mL em PBS antes da administração aos animais. NVP-AUY922 foi dissolvido em 5% de dextrose em água destilada (D5W) a uma concentração de 4 mg /ml.

Ensaios

de crescimento celular e morte celular

MYC-CAP /CR ou Pten- células CAP /CE2 (4 × 10

4 /mL) foram deixadas a aderir durante a noite em placas de 24 poços (BD Biosciences) e incubadas com as concentrações indicadas de NVP-AUY922 para 24 e 48 horas. O crescimento celular foi medido por fixação e coloração das células aderentes com 10% de metanol em violeta de cristal durante 30 minutos. As células coradas foram feitas solúvel em metanol absoluto e a absorvância foi detectada a um comprimento de emissão de 570 nm. A viabilidade (morte celular) foi medida através da incubação de células aderentes e não aderentes com 1 ug /mL de iodeto de propídio (Sigma-Aldrich) a captação e quantificada com um FACS Calibre citómetro de fluxo.

Western blot

células MYC-CAP /CR ou Pten-CAP /CE2 foram lavadas em PBS e lisadas em tampão RIPA (Sigma-Aldrich), contendo 1 × inibidores da protease e da fosfatase (Sigma-Aldrich). Quantidades iguais de proteína foram separados por electroforese usando 4-15% de gel de gradiente de SDS-PAGE (Bio-Rad) e a proteína foi transferida para membranas de nitrocelulose (Biometra). Os anticorpos secundários conjugados com HRP foram da Dako. A detecção foi realizada utilizando reagentes de quimiluminescência (PerkinElmer).

actividade de transcrição do receptor de andrógeno

O status de resposta andrógeno de células MYC-CAP /CR foi determinada utilizando uma luciferase relatou kit baseado em lentiviral comercialmente disponível (Cignal Lenti AR Repórter (Luc) kit; SABioscience) de acordo com as instruções do fabricante

Quantitative real-time PCR

O ARN total foi extraído por TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.. Um micrograma de ARN foi utilizado para realizar a síntese de ADNc por kit de síntese de ADNc iScript (Bio-Rad). Um microlitro de reacção de síntese de cDNA foi, em seguida, submetido a amplificação por PCR usando iQ kit SYBR verde (Bio-Rad). sinais de PCR foram registados e analisados ​​pelo sistema de detecção por PCR em tempo real da Bio-Rad CFX Ligação. As sequências dos iniciadores são: FKBP5 para a frente, 5 ‘GCCGACTGTGTGTGTAATGC 3’, e reversa, 5 ‘CACAATACGCACTTGGGAGA 3’; GAPDH para a frente, 5 ‘GTCTTCACCACCATGGAGAAG 3’, e inverter, 5’CAAAGTTGTCATGGATGACCTTGG 3 ‘. valores ΔΔCt foram calculados e usados ​​para determinar mudanças vezes de mRNA.

Histologia /imuno-histoquímica

Os ratos foram sacrificados por CO

2 asfixia em pontos de tempo definidos. O tecido tumoral foi fixado em 10% de formalina tamponada durante a noite seguido de um período adicional de 24 horas em 70% de etanol. Para a recuperação de antigénio, as lâminas foram fervidas durante 10 minutos em 10 mM de solução de citrato de sódio a pH 6 para todos os anticorpos. sistema de detecção ImmPRESS (Vector Laboratories) foi usada para a detecção de todos os anticorpos primários. A coloração foi visualizada utilizando 3,3′-diaminobenzidina (DAB) (Sigma, Saint Louis, MO, o FAST 3,3-diamino benzidina) e lâminas foram contrastadas com hematoxilina. Para quantificação de imagens representativas de coloração IHC (3-6) foram obtidos utilizando um microscópio óptico Zeiss (Zeiss). coloração nuclear positiva para c-MYC e caspase ativada 3 foi quantificada por Aperio ImageScope (v11.1.2.760).

In vivo

estudos com animais

O Animal Care Institute e Uso Comissão em Roswell Park Cancer Institute aprovado todos os protocolos de mouse utilizados neste estudo. Os ratinhos foram alojados numa instalação para animais mantidos num 12 h ciclo de luz /escuro, a uma temperatura constante (22 ± 2 ° C) e humidade relativa (55 ± 15%). água da torneira e alimentos estavam disponíveis

ad libitum

. ratinhos FVB macho (4-6 semanas de idade) foram adquiridos a partir de NCI Frederick (Maryland, EUA). SCID foram adquiridos a partir de uma colónia na casa mantida em Roswell Park Cancer Institute. Todos os ratinhos foram castrados cirúrgico até 10 dias antes da inoculação do tumor. A castração cirúrgica foi realizada raspando o local cirúrgico. Foi feita uma incisão no escroto e na túnica dos testículos com uma tesoura. O testículo, canal deferente e gordura testicular anexado pad foram removidos através do local da incisão. O local da incisão será fechada com grampos cirúrgicos. O independente modelo de xenotransplante (AI) LuCaP23 andrógeno [21] foi uma oferta generosa do Dr. Robert Vessella (University of Washington, Seattle WA). Este modelo foi mantido por passagens em série de tecido tumoral de pré-castrados ratos machos SCID.

estudos de terapia.

Pré-castrados camundongos machos FVB machos foram inoculados com células CR MYC-Cap /( 1 × 10

6) suspensas em PBS por injecção subcutânea. Do mesmo modo, os ratinhos SCID machos castrados pré-inoculados com PC3 (1 × 10

6) células suspensas em PBS por injecção subcutânea, ou implante com um pedaço do tumor LuCaP 23 IA (4 mm

2) por via subcutânea. Para estudos de tratamento com docetaxel único, os ratinhos portadores de tumor receberam o tratamento com docetaxel (10-50 mg /kg uma vez por semana; injecção i.p.). Para os estudos de combinação, portadores de tumores animais receberam veículo (D5W), docetaxel (10 mg /kg, uma vez por semana; injecção i.p.), NVP-AUY922 (40 mg /kg, 5 dias em 2 dias de folga; injecção i.p.) ou de combinação. Em todos os estudos, os ratos foram pesados ​​semanalmente para monitorizar a toxicidade. O crescimento do tumor foi avaliada por medições de calibre de série duas vezes por semana.

Análise Estatística

Os dados são apresentados como a média ± SE. As diferenças foram determinados utilizando um ou two-way ANOVA e dois de cauda testes t emparelhados onde indicado, utilizando o software GraphPad Prism. Os valores de P inferiores a 0,05 foram atribuídos estatisticamente significativa.

Resultados

Resposta de células resistentes câncer de próstata castração ao tratamento AUY922

in vitro

MYC-tampão castrar células resistentes (MYC-CAP /CR) e castrados Pten-Cap resistentes (Pten-CAP /CE2) foram expostas durante 48 horas a concentrações crescentes de AUY922. Como mostrado na Fig. 1B, baixas concentrações nanomolares de AUY922 foram suficientes para inibir o crescimento de MYC-CAP /CR e células /CE2 Pten-tampão. Além disso, AUY922 induziu um aumento dependente da dose na morte celular de MYC-CAP /Cr e Pten-CAP /CE2 células em concentrações de 50-500 nM com base na análise de absorção pi (P 0,05; Fig. 1C).

AUY922 induz a degradação de proteassoma de AR e inibe AR atividade transcricional em MYC-CAP /CR e Pten-CAP /cE2Pten-Cap células /CE2

está documentado que a inibição de Hsp90 muitas vezes resulta na degradação de proteassoma de sua proteínas clientes [16]. Nós mesmos queria para determinar a estabilidade da proteína AR e /ou a actividade de transcrição foi atenuada por AUY922 em nossos modelos resistentes castrados. MYC-CAP /Cr e Pten-CAP /CE2 células tratadas com concentrações crescentes de AUY922 durante 48 horas, demonstrou uma perda dependente da dose de proteína AR, mais notável em concentrações de 100 nM e 500 nM (Fig. 2A e 2C). O tratamento concomitante com AUY922 e o inibidor de proteassoma, MG132 (0,5 uM), que confirmou AUY922 mediada perda de proteína AR foi por degradação de proteassoma (Fig. 2A). O efeito da AUY922 sobre a atividade transcricional AR foi avaliada pelo uso MYC-CAP /células CR com expressão estável de um repórter de luciferase dirigido por elementos de resposta de andrógenos (ARE-Luc). MYC-CAP /células CR /ARE-Luc foram incubadas com concentrações crescentes de AUY922 e 1 nM R1881 em simultâneo durante a noite ou pré-tratadas com 1 nM de R1881 durante 4 horas, seguido por concentrações crescentes de AUY922 dia para o outro. Devido à expressão constitutiva de luciferase em células Pten-CAP /CE2, avaliou-se o nível de expressão de ARNm de gene a jusante AR, FKBP5, para investigar o efeito da actividade de transcrição em AUY922 AR. Os nossos resultados demonstram que inibe a actividade de transcrição AUY922 AR em baixas concentrações nanomolares em ambos castrar linhas de células resistentes (Fig. 2B e 2C). Além disso, estes resultados também indicam que a degradação da proteína a RA não é necessário para AUY922 para antagonizar transcrição AR. Além disso, utilizou-se ciclo-heximida para bloquear a síntese de proteínas de novo para baixo sugerem ainda que AUY922 nanomolar é capaz de reduzir a actividade de transcrição AR sem afectar o nível de proteína AR (Fig. 2D).

Resistente

(A) MYC-tampão de castração de células foram tratadas durante 48 h com concentrações crescentes de AUY922 ou concentrações crescentes de AUY922 concorrentemente com o inibidor de proteassoma MG132 [0,5? M]. A expressão da proteína AR foi avaliada por Western blot. linhas celulares (B) MYC-CAP /CR com a transfecção estável de um plasmídeo repórter AR (ARE-Luc) foram incubados em condições de cultura de células de androgénio empobrecido durante 6 horas. As células foram tratadas simultaneamente com 1 nM R1881 e indicaram concentrações de AUY922 durante a noite ou pré-tratadas com 1 nM R1881 durante 4 h antes de se adicionar as concentrações indicadas de intensidade AUY992 luminescência foi medida e quantificada. As colunas representam 3 experimentos independentes; significa ± SE. células (C) Pten-CAP /CE2 foram tratadas com concentrações crescentes de AUY922 durante 48 h. A expressão da proteína AR foi avaliada por Western blot. actividade transcricional do AR foi realizada por medição do nível de expressão de ARNm FKBP5. As células foram incubadas em condições de cultura de células esgotadas andrógeno durante 6 horas, e, em seguida, tratada em simultâneo com 1 nM R1881 e indicaram concentrações de AUY922 dia para o outro. Experimentos representam 3 experimentos independentes, com média ± SE. células (D) MYC-CAP /CR e Pten-CAP /CE2 foram tratados concomitantemente com 5 mg /ml de cicloheximida e concentrações crescentes de AUY922. A expressão da proteína AR foi avaliada por Western blot. GAPDH serviu como controle de carga de proteína. A densitometria foi realizada por análise de imagem j. Os números foram mostrados abaixo das bandas em relação às células de controlo.

Co-tratamento de AUY922 e docetaxel aumenta a morte celular de MYC-CAP /CR e Pten-Cap células /CE2

em primeiro lugar, investigou a sensibilidade da MYC-CAP /CR e células /CE2 Pten-tampão para as habilidades de inibição do crescimento de docetaxel. O tratamento medicamentoso exibiram a capacidade de inibir o crescimento das células em concentrações nanomolar baixa em ambas as linhas celulares (Fig. 3A-B).

Castrados linhas de células resistentes foram tratados com as concentrações indicadas de docetaxel e /ou AUY922 durante 48 h. linhas celulares MYC-CAP /CR (A) e Pten-CAP /CE2 (B) foram tratadas com concentrações indicadas de docetaxel para 48 h. As células aderentes foram fixadas com 70% de EtOH. O crescimento celular foi avaliada por coloração das células fixadas com violeta de cristal e medindo a absorvância a 570 nm. MYC-CAP /CR (C) e Pten-CAP /CE2 células (D) foram tratadas com concentrações indicadas de AUY922 e /ou docetaxel por 48 h. As células foram lavadas e trypinized em 1x PBS e incubadas com iodeto de propídio (PI). As percentagens de células mortas (células positivas PI) foram determinadas por citometria de fluxo. As colunas representam a média ± SE, * indica significativamente maior na combinação em comparação com o tratamento com cada fármaco isoladamente (p = 0,03, conforme determinado pelo one-way ANOVA).

Foram selecionados para tratar MYC-tampão /células CR durante 48 horas com 10 nM AUY922 (uma concentração, quando a proteína AR não é degradada mas AR actividade de transcrição é inibida) e 100 nM AUY922 (uma concentração, onde a proteína AR é degradada e Ar actividade de transcrição é inibida) com 500 nM de docetaxel. FIG. 3C mostra que a combinação de 10 nM AUY922 com docetaxel aumenta significativamente a morte celular em comparação com o tratamento com qualquer um dos fármacos sozinhos. Combinação de 100 nM AUY922 com docetaxel ainda aumentou a morte celular em comparação com cada um único tratamento que não foi significativo. Além disso, nós tratados Pten-CAP /células CE2 com 30 e 40 nM AUY922 (concentrações de AUY922 que não afetar drasticamente a expressão da proteína AR) com 500 nM de docetaxel, mostrando que estes tratamentos combinados de AUY922 e docetaxel são capazes de induzir uma maior morte celular em comparação com cada tratamento individual (Fig. 3D). Estes dados indicam que a Hsp90 é potencialmente envolvidos na atividade transcricional do AR e que interromper a interação AR com Hsp90 através da sua inibição antagoniza significativamente a atividade da AR no MYC-CAP /CR e Pten-CAP /células CE2 independentes da expressão da proteína AR, permitindo maior indução de morte celular em combinação com docetaxel.

MYC-CAP /tumores CR são resistentes ao tratamento com docetaxel

in vivo

para avaliar a capacidade de actividade anti-tumoral docetaxel

in vivo

direção MYC-Cap tumores /CR, ratos FVB castrados rolamento MYC-CAP /tumores CR foram tratados com diferentes doses de docetaxel. Como controlos, também tratada SCID castrados com tumores xenoenxerto humano, LuCaP23.1 AI e PC3, que são conhecidos para responder ao tratamento com docetaxel

in vivo

. FIG. 4B e 4C mostram que LuCaP23.1 AI e tumores PC3 foram sensíveis ao tratamento com docetaxel. Além disso, cada dose não gerou uma toxicidade significativa durante o tratamento (Fig. 4E e 4F). Em contraste, MYC-CAP /CR tumores eram resistentes a todas as doses de tratamento com docetaxel (Fig. 4A), e a toxicidade foi indicado nos ratinhos tratados com 50 mg /kg de docetaxel (Fig. 4D).

(A ) MYC-CAP /células CR (5 × 10

6), (B) pedaço do tumor LuCaP23.1 AI (~ 5 mm

2) e (células PC3 C) (5 × 10

6) foram injetados ou colocado subcutaneamente no flanco de FVB castrados masculino (MYC-CAP /CR) ou SCID (LuCaP23.1 AI e PC3) camundongos. O tratamento foi iniciado quando os tumores medidos cerca de 50 mm

2. Docetaxel foi recebido a partir da Farmácia RPCI como uma solução aquosa (20 mg /ml) e diluiu-se para 1 mg /ml em 1 x PBS diariamente. Os ratinhos foram tratados com doses de docetaxel de 10, 25 e 50 mg /kg semanalmente por injecção intra-peritoneal (i.p.) para a duração de 2 ciclos (MYC-CAP /CR) ou 3 ciclos (LuCaP23.1 AI e PC3). O crescimento do tumor foi monitorizado por medições de calibre em série duas vezes por semana. O tamanho do tumor foi calculado pela L × W. Todos os grupos de tratamento consistiram em 3-4 ratinhos. Cada grupo de tratamento foi normalizada para as medições de pré-tratamento e convertida para o crescimento do tumor por cento. Cada ponto representa o tamanho do tumor média ± SE. (D-F) Todos os murganhos foram pesados ​​2 vezes /semana para monitorizar a toxicidade do docetaxel. A toxicidade foi considerado estar a ocorrer quando o peso do corpo do rato foi reduzido ≥20%. Cada coluna é representado por 3-4 indivíduo ratos /tratamento e representada como variação percentual de peso corporal em comparação com medições de pré-tratamento, a média ± SE.

AUY922 diminui expressão AR em MYC-Cap tumores /CR e combina com docetaxel para aumentar a eficácia terapêutica

a actividade anti-tumoral de AUY922 e docetaxel

in vivo

foi investigada por tratamento castrados ratos FVB com MYC-CAP /tumores CR. Portadores de tumor os murganhos foram tratados com veículo (D5W; 5d em 2d largo), AUY922 (40 mg /kg ip: 5d em 2d largo), docetaxel (10 mg /kg ip: uma vez por semana) ou a combinação durante 2 ciclos (14 dias) . Nenhuma toxicidade significativa foi observada em todos os grupos de terapia como se mostra por meio de medições de peso corporal (Fig. 5B). Como pode ser visto na Fig. 5A, em comparação com tratamento com veículo, um tratamento de duas semanas com AUY922 ou docetaxel não reduziu significativamente o crescimento do tumor. Notavelmente, a combinação de terapia com AUY922 docetaxel revogada significativamente o crescimento de tumores MYC-CAP /CR em comparação com cada um único tratamento (AUY922, p = 0,002; docetaxel, p = 0,009). Além disso, a análise histoquímica do tratado MYC-CAP /tecido tumoral CR para a expressão AR revelou que tanto veículos e docetaxel tumores tratados exibido coloração nuclear AR forte (Fig. 5C). Curiosamente, AUY922 como um tratamento único ou em combinação com docetaxel demonstraram que a inibição de Hsp90 teve um efeito global heterogénea na expressão do AR tumor. FIG. 5D e 5E mostram imunocoloração representativa de secções de tumor /CR MYC-tampão, que demonstram seções do tumor thatremained positivo para a expressão nuclear AR, enquanto as seções adjacentes de tumores exibiram perda de expressão AR nuclear.

(A) MYC- células CAP /CR (5 × 10

6) foram injectadas subcutaneamente no flanco de ratinhos FVB machos castrados. O tratamento foi iniciado quando os tumores medidos cerca de 50 mm

2 (L × W). Os murganhos foram tratados com veículo (D5W, IP,

n = 6

), docetaxel (10 mg /kg, semanalmente, IP,

N = 7

), AUY922 (40 mg /kg, 5d em 2d off, ip,

n = 5

) ou a combinação (

n = 6

) por 2 semanas. O tamanho do tumor foi monitorizado por medições de calibre em série a cada duas semanas. O tamanho do tumor foi calculado pela L × W. Cada grupo de tratamento foi normalizada para as medições de pré-tratamento e convertida para o crescimento do tumor por cento. Cada ponto representa o tamanho do tumor média ± SE. Two-way ANOVA: ** p = 0,009 docetaxel contra combinação, p = 0,002 AUY922 contra combinação. (B) as medições de peso corporal por semana indicam que a terapia não era tóxico. Cada ponto representa a média ± SE. (C-E) O tecido tumoral foi recolhido no final da terapia, fixadas em 10% de formalina tamponada normal e embebidos em parafina. Quatro micron (4 mm) seções do tecido do tumor foram avaliados por imuno-histoquímica para a expressão do receptor de andrógeno. Ampliação (x40), barra de escala = 500 mm. coloração nuclear positiva para AR foi quantificada usando análise de APERIO imagescope de 6 campos aleatórios na ampliação x40. Barra de escala = 500 uM. Não pareado bicaudal teste t com correção de Welch: **** p 0,0001 associação versus docetaxel; ** P = 0,0016 docetaxel contra AUY922.

AUY922 diminui a atividade transcricional AR em MYC-Cap tumores /CR e combina com docetaxel para aumentar tumor morte celular

Para avaliar a atividade de AUY922 sobre a atenuação da actividade transcricional

in vivo

, usamos a imunocoloração para determinar a expressão do transgene de c-myc, que neste modelo de tumor é impulsionado por transcrição AR através de um promotor probasina [22], [23 ]. tratamento com docetaxel não induziu uma perda de expressão de c-myc (42,3%) em comparação com tumores tratados com veículo (41,2%; Fig. 6A), o que foi consistente com a expressão do AR em tecidos tumorais. Em contraste, os tumores tratados com AUY922, apresentado redução significativa da expressão de c-myc em comparação com tratamento com veículo (42,3% verso 24,6%; p 0,0001) e o tratamento com docetaxel (41,2% verso 24,6%; p = 0,006). Além disso, o tratamento de combinação exibiram perda similar de expressão c-MYC comparação com AUY922 tratamento único, e foi significativo quando comparado com docetaxel tratamento único (28,7% verso 41,2%; p = 0,03; A Fig. 6A).

( A) Representante imunocoloração c-MYC. coloração nuclear positiva para c-MYC foi quantificada usando análise de imagescope APERIO de 6 campos aleatórios na ampliação x40. Barra de escala = 500 uM. Bicaudal teste t: **** p 0,0001 contra AUY922 veículo; ** P = 0,006 contra AUY922 docetaxel; * P = 0,03 contra combinação de docetaxel. (B) representativas caspase-3 clivada imunocoloração. coloração nuclear positiva para a caspase-3 clivada foi quantificada usando análise de imagescope APERIO 6 campos aleatórios com uma ampliação de X20. Barra de escala = 500 uM. Bicaudal teste t: **** p 0,0001 contra combinação tratamentos individuais

Os tecidos foram em seguida avaliadas para a indução da morte celular por immunstaining para a caspase-3 clivada.. Um baixo nível de morte celular foi observada em tecido tratado veículo (3,3%) sem aumento significativo na morte de células após o docetaxel (2,1%) ou AUY922 (4,4%) tratamentos individuais. No entanto, o tratamento combinado aumentou significativamente o número de células tumorais caspase-3 clivada positivos em comparação com docetaxel (14,5% verso 2.1%; p 0,0001) e AUY922 (14,5% verso 4,4%; p 0,0001) tratamentos individuais (Fig. 6B) .

Discussão

O docetaxel quimioterapia continua a ser um padrão primário de cuidados para pacientes com câncer de próstata resistente à castração. Infelizmente, a doença progride, apesar do tratamento com docetaxel ou não responder a todos. Portanto, a identificação de novas drogas, o que pode aumentar ou sensibilizar os pacientes para a quimioterapia docetaxel, é grandemente necessário. Os mecanismos subjacentes a resistência ao docetaxel demonstraram ser multifactorial em linhas celulares e espécimes clínicos de diferentes tipos de tumores [24]. mecanismos identificados incluem a diminuição da acumulação celular devido a proteínas de efluxo, incluindo a P-glicoproteína (P-gp) /MDR1 e MDR2 [25] e as mutações que inibem a ligação de docetaxel directamente β-tubulina [26]. No presente estudo, nós demonstramos que a segunda geração de Hsp90 inibidor AUY922 induz a inibição potente da transcrição AR associado com actividade antitumoral, e aumenta a morte celular em combinação com docetaxel em linhas celulares de cancro da próstata resistentes à castração. Além disso, mostramos que os resultados da terapia combinação AUY922 /docetaxel em atividade antitumoral significativa.