Abstract

A família de câncer testicular (CT) de antígenos é expressa em uma variedade de tumores malignos. Na maioria dos casos, nenhum antigénio CT é encontrado em tecidos normais, excepto nos testículos, tornando-os alvos ideais para a imunoterapia do cancro. Uma análise detalhada da expressão de antigénios CT ainda não foi relatada no cancro da próstata. MAGE-C2 /CT-10 é um novo antigénio CT. O objetivo deste estudo foi analisar extensão e significado prognóstico da expressão da proteína MAGE-C2 /CT10 no câncer de próstata. 348 carcinomas da próstata de prostatectomies radicais consecutivos, o câncer de próstata 29 de castração-refractário, 46 ​​metástases e 45 hiperplasias benignas foram imunohistoquímica analisados ​​para a expressão MAGE-C2 /CT10 utilizando microarrays de tecido. expressão de MAGE-C2 /CT10 nuclear foi identificada em apenas 3,3% carcinomas da próstata primário. expressão de proteínas MAGE-C2 /CT10 foi significativamente mais frequente em metastático (16,3% de positividade) e câncer de próstata resistente à castração (17% de positividade; p 0,001). expressão MAGE-C2 /CT10 Nuclear foi identificado como preditor de recidiva bioquímica após prostatectomia radical (p = 0,015), que foi independente da PSA pré-operatório, a pontuação de Gleason, estágio do tumor e status margem cirúrgica na análise multivariada (p 0,05). expressão MAGE-C2 /CT10 no câncer de próstata se correlaciona com o grau de malignidade e indica um maior risco de recidiva bioquímica após prostatectomia radical. Além disso, os resultados sugerem MAGE-C2 /CT10 como um alvo potencial para o adjuvante e paliativo imunoterapia em pacientes com câncer de próstata

Citation:. Von Boehmer L, Keller L, Mortezavi A, Provenzano M, Sais G, Hermanns T, et al. (2011) MAGE-C2 /CT10 Protein Expression é um preditor independente de recorrência em câncer de próstata. PLoS ONE 6 (7): e21366. doi: 10.1371 /journal.pone.0021366

editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Janeiro, 2011; Aceito: 28 de maio de 2011; Publicação: 06 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 von Boehmer et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Atlantic Philanthropies (Nova York, EUA), Instituto de Pesquisa do Câncer, a Fundação Ciência para Oncology, a Fundação Hanne Liebermann (Zurique), a Hartman Müller Foundation (Zurique), o cancro da Liga Zurich (Zurique), eo Terry Fox Foundation (Winnipeg, Canadá). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Quando o cancro da próstata é localizada na próstata, o tratamento de escolha é a prostatectomia ou irradiação. No entanto, quando as recidivas de tumores ou metastático é já no momento do diagnóstico, terapia é problemática. A castração tem sido a principal opção de tratamento para a doença não confinada por mais de 50 anos. No entanto, os pacientes frequentemente progredir após o tratamento endócrino [1]. Ocorrência de resistência a castração está associada com mau prognóstico e única terapia paliativa está disponível em tais estágios tumorais avançados. Imunoterapia visando câncer testicular (CT) antígenos são promissoras novas modalidades de tratamento para câncer avançado de pulmão, câncer de ovário e pacientes com melanoma [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8 ], [9], mas antigénios CT, excepto o NY-ESO-1 [10], não têm sido utilizados como alvos para vacinas do cancro da próstata.

na maioria dos casos, os antigénios CT são expressos apenas em células germinais de testículo humano. Até à data, mais de 100 antigénios CT foram identificadas, que pertencem a pelo menos 44 famílias distintas. CT antigénios mapeamento de cromossoma X são referidos como antigénios de CT-X e distinguidos dos antigénios não-X CT localizados em outros cromossomas [11]. A expressão de antigénios CT-X varia muito entre os diferentes tipos de tumores e são mais prevalentes em maior grau e tumores avançados [12], [13], [14], [15]. Eles são mais frequentemente expresso em melanomas [16], bexiga [17], [18], pulmão [12], ovário [19], e carcinoma hepatocelular [20], e são incomuns em carcinoma de células renais [21], o cancro do cólon [22], e malignidades hematológicas [23].

Curiosamente, um membro dos antigénios CT,

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parece contribuir directamente para o desenvolvimento do crescimento do tumor da próstata independente de androgénio, estimulando a actividade do receptor de androgénio [24].

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expressão é regulada pelo estado de metilação do DNA: em tumores de próstata castração-recorrente,

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é regulada, correlacionando-se com hipometilação de locais CpG discretos adjacente ao local de início da transcrição de do gene, por contraste, o estado de metilação de outras regiões do

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ilha CpG promotor não se correlaciona com a expressão de genes [24]. Além disso, o tratamento de células da próstata com decitabina faz com que a regulação positiva de

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expressão [24], [25].

Estudos expressão análise mRNA [26], [27], [28] , [29], [30] e análises de imuno-histoquímica [31], [32], [33] de vários antigénios CT foram realizados. Há evidências de evolução que o NY-ESO-1 na expressão das alterações tumorais de negativo para positivo durante a progressão da doença [34]. No cancro da próstata, que é conhecida por ser uma doença de progressão relativamente lenta, dependente da expressão varia de 5% a 30% de fase [29], [31]. Recentemente, um anticorpo contra MAGE-C2 /CT-10, um novo antigénio CT foi gerado [35]. O gene MAGE-C2 /CT-10 mostra homologia significativa com o gene MAGE-C1 /CT-7 e ambos os genes mapear em estreita proximidade com cromossomo Xq27.13. MAGE-C2 /CT-10 foi originalmente identificada numa linha de células de melanoma. Até agora, a expressão MAGE-C2 /CT10 mRNA no cancro da próstata foi analisada em algumas amostras da próstata, apenas:. Em um estudo realizado por Prikler et al, 12 a castração-resistente e oito tumores sensíveis hormonais foram CT10 negativo. Além disso, Lucas et ai. encontrou um dos dez tecidos de câncer de próstata para ser CT10 positivo [28], [30].

Nós relatamos MAGE-C2 /CT-10 em uma grande proporção de carcinoma hepatocelular (HCC) [20]. Durante o teste do anticorpo de MAGE-C2 /CT-10 em uma micromatriz de tecido multi-tumor, identificou-C2 MAGE-expressão de proteína /CT10 em casos individuais de CaP. Com base nesta observação, foi realizada uma análise baseada em tissue microarray abrangente de CaP. Nós demonstramos que a expressão da proteína de MAGE-C2 /CT10 é encontrado num subconjunto substancial de cancro da próstata, tumores primários resistentes principalmente metastáticos e castração. Mostramos ainda que a expressão MAGE-C2 /CT10 foi identificado como preditor de recidiva bioquímica após prostatectomia radical, independente dos fatores de risco conhecidos.

Materiais e Métodos

microarrays de tecido da próstata

um total de 468, tecidos da próstata embebidos em parafina fixadas em formalina foi recuperada a partir dos arquivos do Instituto de Patologia cirúrgica da Universidade de Zurique, na Suíça e um tissue microarray (TMA) foi construído como descrito anteriormente [36]. O TMA inclui uma série de 348 consecutivo prostatectomia radical (não selecionada) amostras com câncer de próstata, amostras de cancro resistente da próstata 29 de castração, metástases 18 linfáticos, 28 metástases à distância (osso, pulmão, bexiga urinária) e 45 amostras de hiperplasia prostática benigna. H lâminas E-manchadas de todos os espécimes foram reavaliados por patologistas experientes (P.J.W., H. M.) para identificar áreas representativas para a construção TMA. estágio do tumor e pontuação de Gleason da coorte foram distribuídos de acordo com a União Internacional Contra o Câncer (UICC), e que critérios /ISUP [37]. Mediana de acompanhamento da coorte foi de 71 meses (0-163). Os dados brutos do tissue microarray foram depositadas sob (link será enviado). O cantonal comissão de ética científica Zurique para a patologia (KEK) aprovou o estudo e dispensou a necessidade de consentimento (Ref. No. STV-Nr-05/2007).

Imunohistoquímica

A expressão de MAGE-C2 /CT10 foi analisada por imunohistoquímica como relatado recentemente [20]. Os parâmetros clínicos e patológicos dos casos de cancro da próstata incluídos na TMA estão resumidos na Tabela S1. Consecutivos a 3 uM secções foram cortadas a partir dos blocos de TMA e montadas em lâminas de vidro (Super-Frost Plus, a Menzel, Braunschweig, Alemanha). Para coloração imuno-histoquímica Benchmark sistema automatizado de coloração Ventana (Ventana Medical Systems, em Tucson, AZ) foram utilizados e Ventana reagentes. Após desparafinização em xileno, foram re-hidratadas em lâminas de concentrações decrescentes de etanol. A peroxidase endógena foi bloqueada utilizando Ventana bloqueio da peroxidase endógena kit após uma lavagem com água destilada. Para o antigénio de lâminas de recuperação foram aquecida com solução de células condicionado (CC1, Ventana) de acordo com as instruções do fabricante. Para a detecção de MAGE-C2 /CT-10, o Acm # 5 CT10 gerado anteriormente pelo nosso grupo [35], para a detecção de MAGE-C1 /CT7, o clone CT7-33, DAKO S /A e pela NY- ESO-1, o E978 clone, ZYMED estavam empregadas e ajustado para o sistema de benchmark Ventana depois de realizar titulações (diluição óptima 1:100; 1:80, 1:50 respectivamente). iVIEW-DAB foi usado como cromogénio. tecido testicular normal foi escolhido como controle interno positivo para MAGE-C2 /CT10, MAGE-C1 /CT7 e NY-ESO-1 expressão. expressão de MAGE-C2 /CT10 foi nuclear, MAGE-C1 /CT7 e NY-ESO-1 era expressão citoplasmática e nuclear. Para controlos negativos, o anticorpo primário foi omitido. Dois investigadores (L.v.B., L.K.) realizaram uma avaliação cega dos slides para MAGE-C2 /CT10, MAGE-C1 /CT7 e NY-ESO-1 expressão. Os resultados não interpretáveis, devido à falta de tecido carcinoma, presença de necrose ou artefato esmagamento, foram excluídos da análise. Pelo menos 100 células foram contadas em cada núcleo TMA. Nuclear imunorreatividade MAGE-C2 /CT10 foi avaliada utilizando um sistema de pontuação gradual semi-quantitativa: negativo (0% de núcleos de células coradas); coloração nuclear fraca (1-10% de núcleos corados); coloração nuclear moderado (11-50% de núcleos corados); forte coloração nuclear (51 a 100% de núcleos corados). Busca de cortes de uma maneira imparcial é um grande problema em estudos de imuno-histoquímica lidando com uma leitura contínua. A imunorreactividade nuclear CT10 mediana em casos de prostatectomia mediana (0%) foi escolhido como ponto de corte. Por conseguinte, a imunorreactividade positiva CT10 nuclear foi definida como a coloração nuclear em, pelo menos, 1% de células alvo. NY-ESO-1 e CT7- coloração é citoplasmática ou nuclear, imunorreatividade foi avaliada utilizando um sistema de pontuação gradual semi-quantitativa: negativo (0% das células coradas); coloração nuclear fraca (1-10% de células coradas); coloração moderada (11-50% das células coradas); coloração forte (51 a 100% de células coradas). A mediana NY-ESO-1 e imunorreactividade CT7 (mediana 0%) foi escolhido como ponto de corte. Assim, coloração positiva para NY-ESO-1 e CT7 imunorreatividade foi definida como coloração nuclear ou citoplasmática em pelo menos 1% de células alvo.

Análise estatística dos dados tissue microarray

versão SPSS 17.0 (SPSS, Chicago, IL, EUA) foi usada para análise estatística. Os valores P 0,05 foram considerados significativos. Em caso de múltiplos testes foi aplicado o procedimento de Bonferroni-Holm. análise de tabela de contingência e testes exatos dois lados de Fisher foram usados ​​para estudar associações estatísticas entre os dados clínico-patológicos e imuno-histoquímico. Para a comparação de duas amostras independentes foi calculado o U-teste não-paramétrico de Mann-Whitney. Tempo de recorrência PSA (corte off≥0.1 ng /ml) foi escolhida como ponto final clínico. sobrevida livre de recidiva (RFS) curvas foram calculadas pelo método de Kaplan-Meier, com significância avaliada por dois lados estatísticas de log-rank. Os pacientes foram censurados no momento da sua última clínica visita de acompanhamento livre de tumor. Os pacientes não alcançando o nadir do PSA ( 0,1 ng /ml) foram excluídos no pós-operatório. Um modelo de regressão de Cox multivariada passo a passo foi ajustado, testando a relevância prognóstico independente de MAGE-C2 /CT10 imunorreactividade. A suposição de proporcionalidade para todas as variáveis ​​foi avaliada com funções de distribuição de sobrevivência log-negative-log. Considerações estatísticas sobre o tamanho da amostra são apresentados na Figura 1. Os cálculos foram realizados utilizando os respectivos modelos do software PASS 2008 (NCSS, Kaysville, UT).

expressão MAGE-C2 /CT10 pode ser observada em 11 dos 341 (3,2%) espécimes de prostatectomia. A ocorrência de expressão MAGE-C2 /CT10 deve dobrar o risco de recorrência PSA durante o acompanhamento, resultando em uma taxa de risco de aproximadamente 2,0. Por conseguinte, o tamanho da amostra disponível de 341 pacientes analisáveis ​​seria suficiente para detectar uma diferença relativa recorrência PSA com uma significância de p 0,05 e uma potência de aproximadamente 86%. Por razões de risco mais elevados (2.4, 2.8, 3.2) um poder estatístico de cerca de 99% foi calculado.

Resultados

MAGE-C2 expressão /CT10 no tecido normal e malignos da próstata

dados clínicos e histopatológicos abrangentes são apresentados na Tabela S1. No total, 456 dos 468 núcleos (97,4%) pode ser avaliado para MAGE-C2 /CT10 imunorreactividade. Um padrão de coloração representativo MAGE-C2 /CT10 é mostrado na Figura 2A-C. expressão de MAGE-C2 /CT10 não foi detectada em hiperplasia prostática. cancros confinado ao órgão mostraram-C2 MAGE expressão nuclear /CT10 em 3,3% (11/330) dos casos, enquanto que metastático e doença resistente a castração foram positivos em 16,3% (7/36) e 17% (5/23) dos casos, respectivamente . coloração MAGE-C2 /CT10 Nuclear progressivamente aumentada de hiperplasia prostática para o cancro da próstata confinado-a doença metastática e resistente à castração (Figura 3; p 0,001). Como mostrado na Figura S1, CT10 expressão diferencial entre o tecido normal e neoplásico pode ser observado: a percentagem de CT10 positividade aumentou significativamente de hiperplasia prostática benigna para o cancro da próstata confinado ao órgão de próstata resistentes à castração e a doença metastática, incluindo nódulo linfático e metástases ósseas. Tal como descrito anteriormente [1], diferenciação neuroendócrino é mais prevalente no cancro da próstata resistentes à castração. No entanto, nenhum co-expressão de marcadores CT10 e neuroendócrinas, tais como sinaptofisina e cromogranina poderia ser detectada (figura S2). Nenhuma correlação entre-C2 MAGE expressão nuclear /CT10 e idade no momento do diagnóstico, a pontuação de Gleason, estágio do tumor, estado nodal, status da margem cirúrgica ou níveis de PSA pré-operatório foi encontrado (Tabela 1). Curiosamente, CT10 foi significativamente co-expressa com outros antigénios CT, como NY-ESO-1 e CT7 (Figura 2D-I.)

A (Fig. 4):. Espécime prostatectomia radical (Gleason 4 + 3 ), B: metástase óssea do câncer de próstata, C: metástase óssea do câncer de próstata, D: espécime prostatectomia radical (Gleason 4 + 3), E: resistente à castração cancro da próstata (Gleason 5 + 5), F: ressecção transuretral Paliativos de cancro da próstata (Gleason 4 + 5), G: metástase óssea do câncer de próstata, H: ressecção transuretral paliativo do câncer de próstata (Gleason 5 + 4), I: câncer de próstata resistente à castração (Gleason 5 + 4). Ampliação original: 200 ×; Ampliação bar: 20 mM

BPH:. Hiperplasia benigna da próstata; ADCA: adenocarcinoma da próstata órgão-confinado; MTS: metástase do cancro da próstata; CRPC:. Câncer de próstata resistente à castração

MAGE-C2 /CT10 e prognóstico

Os pacientes com MAGE-C2 /CT10 cancros da próstata positivo foram comparados com negativa casos em relação RFS por análise univariada de regressão de Cox (Tabela 2). expressão MAGE-C2 /CT10 foi significativamente associada com RFS menor (p = 0,015; Figura 5). Pacientes com tumores MAGE-C2 /CT10 positivos teve um RFS média de 51 meses (95% intervalo de confiança de 17-86 meses) em comparação com 116 meses (95% intervalo de confiança 107-125 meses) para pacientes com tumores MAGE-C2 /CT10 negativos . Além da expressão de MAGE-C2 /CT10, o aumento da escala de Gleason (p 0,001), estágio do tumor (p 0,001), margens cirúrgicas (p 0,001) e nível de PSA pré-operatório (p 0,001) foram significativamente associados com o tempo RFS mais curto .

Em uma análise multivariada, um modelo de regressão de Cox foi desenvolvido para avaliação da taxa de RFS. Características das variáveis ​​são apresentados na Tabela 3. Apenas MAGE-C2 /expressão CT10, pontuação de Gleason, estágio do tumor, status da margem cirúrgica e os níveis de PSA pré-operatórios foram considerados. Todas as variáveis, incluindo a expressão de MAGE-C2 /CT10 (p = 0,03), permaneceu significativo. A taxa de risco para a expressão MAGE-C2 /CT10 foi 2.770 (95% intervalo de confiança 1,106-6,934).

Discussão

No presente estudo, foi analisada a presença de MAGE- proteína C2 /CT10 em uma coorte representativa de pacientes com câncer de próstata e descobriram MAGE-C2 /CT10 de ser frequentemente expressos em câncer de próstata avançado; isto é, na doença metastática e resistente à castração. Além disso, identificamos-C2 MAGE expressão nuclear /CT10 como um preditor de recidiva bioquímica após prostatectomia radical, que foi independente dos fatores preditivos bem estabelecidas incluindo PSA pré-operatório, a pontuação de Gleason, estágio do tumor eo estado das margens cirúrgicas.

Detectamos nuclear positividade MAGE-C2 /CT10 em 16,3% e 17% dos pacientes com metástases e doenças resistentes a castração, respectivamente, mas apenas em 3,3% do órgão confinados CaP. Esta descoberta é de relevância clínica, porque um sub-grupo de pacientes com CaP resistente avançada, a castração pode ser considerada para a imunoterapia no futuro. Estudos anteriores demonstraram que MAGE-C2 /CT10 é capaz de induzir respostas imunes específicas no hospedeiro autólogo. Os linfócitos T citotóxicos dirigidos contra MAGE /CT-10 epitopos foram encontrados em pacientes com melanoma e de anticorpos dirigidos contra MAGE-C2 /CT-10 foram detectados em pacientes com melanoma e pacientes [38], [39], [40], [12], [41].

MAGE-C2 /CT10 pertence à MAGE-família de antigénios CT [42]. Num estudo recente, Yang et al. demonstraram que MAGE-C2 pode actuar como co-repressor de p53 por ligação a KAP1 reforço supressão da p53. Estes resultados sugerem que o MAGE-C2 contribui para o desenvolvimento de doenças malignas, fornecendo uma vantagem de sobrevivência [43]. a expressão do gene MAGE é epigenetically reprimida por metilação da região promotora na maioria das células, mas fatores que controlam gene MAGE metilação do promotor não foram totalmente identificados. Yang et ai. demonstraram que a expressão do gene MAGE epigeneticamente é controlada pelo kit da tirosina-quinase [44]. Compreender os fatores que controlam a expressão de genes MAGE pode permitir estratégias terapêuticas mais eficazes visando antígenos MAGE [45], [46], [47].

Embora nosso estudo corrobora estudos anteriores relatórios baixa incidência de antígenos CT no órgão-confinado câncer de próstata, o aumento da expressão de antigénios MAGE-C2 /CT10 em CaP avançado foi um achado romance inesperado. Também CT expressão do antigénio ainda não tenha sido analisado em grupos maiores de pacientes com CaP. Para nosso conhecimento, apenas 30 tumores foram analisados ​​para MAGE-C2 /CT10 expressão de ARNm anteriormente: positividade foi relatada em 1/10 e 0/20 amostras de tumores [30], [32]. Noutros tumores, proteína MAGE-C2 /CT10 foi anteriormente identificado em 34% -48% dos carcinomas hepatocelulares [20], [48], em 43% de mieloma múltiplo [49], em 20% dos carcinomas uroteliais de alto grau de a bexiga urinária [18], em 20% dos cânceres de cabeça e pescoço [28], e em 43% dos melanomas, respectivamente. A prevalência de 5% do MAGE-C2 /CT-10 expressão em cânceres colorretais [50] é comparável a nossa descoberta de rara expressão de MAGE-C2 /CT-10 em CaP primário. Uma pobre sobrevivência foi observada em avançado MAGE-C2 /CT-10-positivo carcinoma urotelial da bexiga urinária, mas MAGE-C2 /CT-10 de expressão não tinha impacto prognóstico no carcinoma hepatocelular.

importante, o nosso estudo identificou MAGE-C2 /CT-10 como um preditor independente de recorrência bioquímica após prostatectomia radical, proporcionando uma base potencial para um melhor prognóstico e tratamento estratificação de pacientes com PCA. O uso disseminado de antigénio (PSA) rastreio específico da próstata no soro levou à identificação de um número crescente de tumores de fase baixa assintomáticos em homens mais jovens [51], [52]. A questão clínica importante ainda sem resposta é se esses pacientes necessitam de tratamento e em caso afirmativo, quão agressivamente deveriam este tratamento potencial de ser. Os doentes com doença localizada sejam preferencialmente a ser tratados quer com prostatectomia radical ou terapia de radiação, quer com finalidade curativa [53], [54]. Actualmente, prognóstico e tratamento de estratificação no momento do diagnóstico são baseadas no estágio clínico, biópsia Gleason, e níveis de PSA no soro. Em casos tratados por prostatectomia radical, o prognóstico pode ser refinado usando estágio patológico e grau de Gleason. No entanto, estes indicadores prognósticos não prever com precisão o resultado clínico para pacientes individuais. marcadores melhoradas são necessários para determinar quais pacientes estão em risco e devem, portanto, ser tratados de forma mais agressiva. MAGE-C2 /CT-10 deve ser adicionado à lista de marcadores de progressão tumoral prognósticos propostos, incluindo MUC-1 [55], AZGP1 [55], EZH2 [56], E2F3 [57], Ki67 [58], [59], e CD10 [60].

em conclusão, nossos dados fornecem evidências de que MAGE-C2 /CT-10 pode ser um candidato para adjuvante e paliativo vacinação em um subgrupo de pacientes com câncer de próstata avançado. Além disso, MAGE-C2 /CT-10 expressão em tumores de estádio inicial indica um maior risco de recidiva bioquímica após prostatectomia radical.

Informações de Apoio

Figura S1. expressão

CT10 Diferencial entre o tecido normal e neoplásico: o percentual de positividade CT10 por tecido núcleo microarray aumentou significativamente de hiperplasia benigna da próstata ao câncer de próstata órgão confinado à próstata castração resistente e doença metastática, incluindo linfonodo e metástases ósseas

. doi: 10.1371 /journal.pone.0021366.s001

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Figura S2.

seções inteiras de CT10 metástase óssea positiva de dois pacientes foram coradas para cromogranina (CRGA) e sinaptofisina, dois marcadores neuroendokrine. No co-expressão de CT10 e neuroendócrinas marcadores poderiam ser detectados

doi:. 10.1371 /journal.pone.0021366.s002

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Tabela S1.

características e resultados de imunohistoquímica clínicopatológicos para os pacientes que receberam a prostatectomia radical

DOI: 10.1371 /. journal.pone.0021366.s003

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Agradecimentos

Os autores gostaria de agradecer Martina Storz, Susanne Dettwiler e Silvia Behnke para excelente assistência técnica.