Sumário

Altamente tumores aneuplóides são comuns em cânceres de ovário (EOC). Investigou-se a expressão de NuMA foi associada a este fenómeno.

os níveis de proteínas NuMA em tecidos normais e tumorais, linhas celulares de ovário e culturas primárias de células malignas derivadas a partir de fluidos ascíticos ovarianos foram analisados ​​por análise de micromatriz Affymetrix, imunotransferência, imuno-histoquímica (IHC) e imunofluorescência (IF), com resultados correlacionados com os dados clínicos associados. estado aneuploidia em culturas primárias foi determinada por análise FACS.

Os dados de microarray Affymetrix indicou que NuMA foi sobre-expressa no tecido do tumor, as culturas primárias e linhas de células em comparação com o tecido normal do ovário. IHC revelou baixa a expressão NuMA fraco em tecidos normais. Expressão foi regulada em tumores, com uma associação significativa com o estágio da doença em subtipos EOC mucinoso (p = 0,009), comprometimento de linfonodos (p = 0,03) e idade do paciente (p = 0,04). análise de dados descontínuos adicionais revelaram que os níveis elevados NuMA em tumores diminuiu com o grau (p = 0,02) mas aumentaram com a fase da doença (p = 0,04) em EOC seroso. expressão de NuMA diminuição na doença tarde EOCs fase 4 endometrióides. Altos níveis NuMA diminuiu com o aumento da invasão tumoral em todos os subtipos (p = 0,03). IF de culturas primárias revelaram que níveis elevados de NuMA em pólos do fuso mitótico foram significativamente associados com uma diminuição da proporção de células na citocinese (p = 0,05), o aumento da binucleação (p = 0,021) e multinucleação (p = 0,007), e aneuploidia (P = . 0.008)

NuMA é altamente expresso em tumores EOC e altos níveis de NuMA correlacionam com aumentos de defeitos de mitose e aneuploidia em culturas primárias

Citation:. Brüning-Richardson a, bond J, Alsiary R , Richardson J, Cairns DA, McCormac L, et ai. (2012) NuMA superexpressão em epitelial cancro do ovário. PLoS ONE 7 (6): e38945. doi: 10.1371 /journal.pone.0038945

editor: J.Christopher Unidos, Universidade de Louisville, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Janeiro, 2012; Aceito: 14 de maio de 2012; Publicação: 14 de junho de 2012

Direitos de autor: © 2012 Brüning-Richardson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho e Dr. Brüning-Richardson foram financiados pela Yorkshire Cancer Research [L328]. A Universidade de Leeds suporta Dr. Bond, Dr. Burns, Dr. Hall e Dr. Morrison. Dr. Bell é suportado pelo Breast Cancer Campaign [2007NovPR53], Dr. Alsiary por uma bolsa do Ministério saudita do Ensino Superior, Dr. Cairns pelo Medical Research Council do Reino Unido [G0802416], Dr. McCormac por Oncolytics Biotech Inc, (Calgary, Canadá) e Dr. Wilkinson e Dr. Hutson por Leeds Teaching Hospitals NHS Trust. Dr. Bond, Dr. Burns, Dr. Wilkinson, Dr. Morrison e Dr. Bell segurar financiamento do Yorkshire Cancer Research, GDH do Cancer Research UK, e Dr. Burns e Dr. Wilkinson de Bem-estar das mulheres. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a proteína de 238 kDa aparelho mitótico nuclear (NuMA) é um componente do núcleo de interfase e da matriz polar do fuso mitótico [1]. NUMA tiver funções na montagem do fuso através de sua associação com motores de microtúbulos [2], [3] e no posicionamento do fuso durante a divisão celular assimétrica [4]. Um papel interfase adicional como uma proteína de andaimes nuclear foi proposto [4] – [6]. NuMA é expressa ubiquamente [6], [7]. Os pólos do fuso nucleares e localizações de NuMA são bem caracterizado no tecido normal [8], [9] e em tecidos de tumores por imuno-histoquímica (IHC) na proteína de humano de ‘Atlas. O papel que as proteínas mitóticas tais como NuMA pode jogar no câncer recentemente se tornou um assunto de interesse renovado como se tornou evidente que a aneuploidia é uma característica comum dos tumores que possam conduzir a sua progressão [10], [11].

EOC é uma doença complexa que é difícil de tratar devido à apresentação tardia, a recorrência da doença após o tratamento e altas taxas de quimio-resistência. A biologia do EOC é mal compreendida e melhorias para diagnóstico e terapia são altamente desejáveis ​​[12]. carcinomas de ovário são muitas vezes caracterizada por cariótipos com aneuploidia grave devido a instabilidade cromossômica (CIN) e triploidization [13]. Tem sido proposto que aneuploidia é uma característica dos primeiros aberrações em EOC [14]. tumores aneuplóides respondem menos favoravelmente ao tratamento de tumores diplóides, levando a menores taxas de sobrevivência [15]. O

NUMA1

mapas de genes no cromossoma 11q13 [16], uma região comumente amplificado no cancro do ovário [17]. No entanto, para o nosso conhecimento nenhuma publicação ligaram expressão NuMA a aneuploidia em EOC. Analisou-se os níveis de NuMA em culturas primárias de células malignas derivadas a partir de fluidos ascíticos do ovário, nos seus tecidos associados a tumores, em tecidos de tumores ovarianos primários não ligados e em tecido de ovário normal usando análise Affymetrix matriz, slot blotting, IHC e imunofluorescência (IF). expressão NuMA foi encontrado para ser regulada em amostras de tumor em comparação com controles normais. Se a análise de culturas primárias identificada uma associação entre o aumento das quantidades de Numa nos pólos do fuso e as taxas de binucleação e multinucleações, enquanto a análise FACS revelou uma correlação positiva entre o aumento da expressão NUMA e aneuploidia. Este estudo demonstra pela primeira vez que a expressão NuMA é regulada em EOC e que esta está associada com a aneuploidia visto nesta câncer.

Resultados

Affymetrix Microarray Analysis

Exame de dados de micromatriz Affymetrix a partir de um painel de linhas celulares de cancro do ovário, e culturas primárias de tecidos de tumor demonstraram que nuMA foi consistentemente sobre-expresso a um nível de transcrição em comparação com o tecido normal do ovário. Apenas duas amostras de ascites tinham níveis de expressão mais baixos em comparação com um controlo normal interna (N) (Figura 1A). Este trabalho inicial sugeriu que um estudo mais aprofundado de expressão NUMA EOCs se justificava.

A. dados Affymetrix mostrando NuMA sobre-expressão em 6 linhas de ovário celulares (JAMA-2, iove (linha celular adicional imortalizado epitelial de ovário), Skov-3, TR175, OVCA-433 (além) e 1847 (todas as barras cinza, designado CL) , 38 amostras de células primárias cultivadas a partir de fluido ascítico (barras pretas, designados – a, incluindo algumas amostras com colecções consecutivos ou passagens) e 4 estabelecidas culturas primárias de tecidos de tumor (designada para -T1 – T4) A1, A2 e A4 são. tecido tumoral (T1, T2, T4) amostras de ascites associadas. os valores de intensidade obtidos para as amostras foram normalizados para um controlo interno (tecido epitelial de ovário normal (N)) e expressão de genes níveis são apresentados como a proporção dos níveis de intensidade /controlar o nível de intensidade como um valor de log 10. B. níveis de NuMA em lisados ​​de células. um exemplo representativo de um lisados ​​analisados ​​para a expressão de NuMA por ranhura mancha preta asterisco indica linhas celulares de ovário (1847, TR175, JAMA-2), o asterisco castanho linha celular de neuroblastoma SH- SY5Y, asterix-de-rosa da linha de células de adenocarcinoma de cólon SW480, azul asterix a linha de células de câncer cervical HeLa, e asterix amarelo a linha de células do cancro da mama MCF7. Todas as outras amostras são lisados ​​de culturas primárias do ovário. C. histograma que compara níveis de NuMA em linhas celulares de ovário, uma linha de células primárias derivadas a partir de uma patologia benigna ginecológico (1153-A1) e culturas primárias após normalização contra α-tubulina. D. Seção do normal (N) epitelial de ovário e tecido do estroma e do ovário combinados (Ca) em x10 e x40 ampliação após NuMA imunocoloração. As setas indicam células epiteliais. Baixo para níveis médios de NuMA coloração nuclear pode ser visto nas células epiteliais normais, com níveis mais elevados de coloração nuclear de NuMA em células epiteliais de cancro do ovário. E. Análise de uma pequena TMA ovário mostra que Numa intensidade de coloração aumenta com o grau no tecido tumoral de ovário.

Slot de Blotting

Um total de 35 amostras foram analisadas por slot de blotting. Este grupo consistiu de 7 linhas celulares estabelecidas (JAMA-2, TR175, 1847, SW480, MCF-7, HeLa e SH-SY5Y), uma amostra benigna (1153-A1) e 25 culturas primárias. Os lisados ​​obtidos a partir de 2 tecidos de tumor de ovário crescidas em cultura de tecidos (BE4163-T1 e AQ70880-T1) também foram incluídos. Um exemplo representativo de uma imagem de ranhura blot de algumas das amostras é mostrado na Figura 1B. Normalização contra um controlo interno α-tubulina confirmou que havia uma variação nos níveis de proteína NuMA entre as amostras testadas (Figura 1C). Entre as linhas celulares de 1847 teve o maior nível de expressão Numa, seguido por TR175 e JAMA-2. A amostra benigna 1153-A1 tinham um nível médio NuMA enquanto houve variação entre as culturas ascite primárias com 3 (1141-A1, 1134-A1 e AE6792-A1) que expressam os níveis mais altos NUMA todas as amostras. Nenhuma associação significativa entre os resultados NuMA immunoblotting e os dados clínicos associados foi visto. Reassuringly, os níveis de proteína NUMA geral correspondeu bem com os níveis de expressão de RNA visto pelas culturas primárias e linhas celulares de ovário examinados por análise de Affymetrix microarrays.

Imunohistoquímica

A imunocoloração indicou que a expressão NuMA em seções inteiras de tecido normal do ovário foi variável, que vão de muito baixas a níveis fracos no estroma e núcleos de células epiteliais (n = 7) (Figura 1D). Para 5 casos de tecido normal com o tecido associado a tumor, identificou-se um claro aumento em expressão de NuMA em 40% (05/02) de amostras de tumor. Até 95% dos núcleos em tumores primários exibida forma a forte coloração de NuMA (Figura S1a-d). NuMA também foi observada nos pólos do fuso mitótico das células tumorais (Figura S1B, seta). Análise de uma pequena cancro do ovário in-house gerado TMA revelou que 95% dos núcleos das células tumorais foram coradas positivamente para NUMA em 24 de 25 núcleos. Surpreendentemente, a análise dos dados após a aplicação de um sistema de pontuação que subdividida amostras em baixo de NuMA (todos os pontos negativos, muito fracos e fracos) e níveis elevados de NuMA (pontuações médias e altas) mostraram que os níveis elevados NuMA só foram detectados em 3 tumores de grau (33%; Figura 1E). Coloração de uma TMA ovário maior confirmou baixa e alta expressão de NuMA entre os núcleos (Figura 2). análise inicial dos dados globais independentemente do subtipo do câncer mostraram que os níveis elevados NuMA aumentou com o grau do tumor (de 20,3% para 1 tumores de grau para 24,1% para 3 tumores de grau,

p

= 0,0016) e estágio da doença (um aumentar de 19,6% para a fase de 1-33,3% para a fase 4,

P

= 0,0077) (dados não mostrados). A análise dos dados contínuos para o grau do tumor e estágio da doença, que incluiu subdivisão em os tipos de câncer para os quais há dados suficientes estavam disponíveis (serosa, mucinoso e endometrioid), indicou que a expressão NuMA correlacionada com o aumento do grau no subtipo mucinoso (

p

= 0,009) (Figura 3A). A correlação significativa com envolvimento de gânglios linfáticos (

p

= 0,03) (Figura 3B) e idade (

p

= 0,04) (Figura 3C) foi observada em todos os subtipos. Uma análise mais aprofundada dos resultados como dados descontínuos (baixo NuMA vs alta NUMA) revelou associações estatisticamente significativas adicionais. A proporção de amostras com níveis elevados NuMA diminuiu com o grau (

p

= 0,02) (Figura 3D) e aumento no estágio da doença no final EOC serosa (

p

= 0,04) (Figura 3E) . Em EOCs mucinoso, os níveis NuMA aumentou com grau (

p

= 0,005) (Figura 3F). Em EOCs endometrióides de fase tardia, a expressão de NuMA diminuiu (Figura 3G) e alta NuMA diminuiu com o aumento do estado de invasão tumoral (

P

= 0,03) (todos os subtipos) (Figura 3H). baixa expressão NuMA foi observada em toda a população amostra de 13 EOCs de células claras, independentemente do estágio da doença.

padrões de coloração NuMA baixos e altos observados em núcleos de serosa, mucinoso, endometrial e carcinoma de células claras em um ovário em grande escala TMA. x10 ampliação.

A. A análise estatística da grande cancro do ovário TMA que mostra a expressão de NuMA aumenta com o estádio da doença no subtipo mucinoso. expressão B. NuMA está associada com envolvimento de gânglios linfáticos (T3cN1MO) (todos os subtipos). expressão C. NuMA está associada com a idade do paciente (todos os subtipos). D. níveis elevados de NuMA a diminuir com o grau do tumor no subtipo seroso. níveis E. alta NuMA estão associados com doença em estágio 4 em EOCs serosa. níveis F. alta NuMA aumentar com o grau do tumor em EOCs mucinoso. níveis G. alta NuMA diminuir com o estágio da doença no EOC endometrioid. níveis H. alta NuMA diminuir com o status de invasão tumoral (T1 a T3) (todos os subtipos).

As análises de imunofluorescência

Se a análise revelou a existência de um padrão de coloração NuMA nuclear interfase em todas as linhas de células, uma cultura primária adaptada como uma linha celular (GYNA0089) e 23 culturas primárias (Figura 4A, B). Na mitose NuMA foi encontrado nos pólos do fuso (Figura 4C) em todas as linhas celulares e culturas primárias examinados. um número suficiente de células mitóticas para posterior análise foram identificadas em 16 culturas primárias. Nestas amostras de células em divisão foram examinados para estadiamento mitótico e a presença de defeitos específicos mitóticas. Finalmente, uma pesquisa de indicadores interfase de aneuploidia foi realizada em todas as amostras.

A. Exemplos de núcleos em interfase com baixo (a-d) e alta (e-h) os níveis de NuMA, e fusos mitóticos com baixo (i-l) e alta (M-P) os níveis de NuMA em pólos do fuso. Green – Numa, vermelho – a-tubulina, azul – DAPI. Barra de escala = 5 uM. B. Histograma comparando NuMA fluorescência nuclear intensidades de coloração em quatro linhas celulares de ovário, uma linha de células estabelecida a partir de uma cultura primária (GYNA0089) e 23 culturas primárias derivadas a partir de fluido ascítico. C. histograma que compara as intensidades de coloração NuMA em pólos do fuso no subconjunto de linhas celulares e culturas onde um número suficiente de células mitóticas foram para análise.

intensidades de coloração diferia entre as amostras (Figura 4). Notou-se que algumas amostras foram compostas por células com baixa coloração nível de NuMA em núcleos em interfase e nos pólos do fuso mitótico (Figura 4A, a-d e i-l; 4B, C) e algumas amostras foram compostas por células com coloração de alta NuMA intensidades (Figura 4A, e-h e m-P; Figura 4B e C). Observamos, também, que cada amostra diferente no que diz respeito à proporção de células em cada fase mitótica e que exibiu uma ampla variedade de defeitos de mitose. Estes defeitos metafase incluídos, tais como veios de tripolar e multipolares (Figura 5A, a-d) e o fuso desalinhamento (Figura 5A, E); anafase defeitos, tais como cromossomas e atrasadas ponte cromossómico (Figura 5B, a-c); e defeitos cytokinetic ponte incluindo os cromatídeos e a geração de células filhas dimensionadas de forma irregular (Figura 5C, a-d). Binucleação, multinucleação e a presença de micronúcleos foram defeitos comuns na interfase células (Figura 5D, a-c). Os exemplos mostrados na Figura 5E foram os erros mitóticas mais comuns observados.

A. defeitos mitóticas observados na metáfase incluído (a) assimétricas fusos bipolares (b) pólos múltiplos fusos, (c) fusos tripolar, (d) fusos bipolares com vários pólos do fuso (e) células com fusos extraviado e desalinhados (periferia da célula delineado). defeitos B. mitóticas observados em anaphase incluídos atrasadas cromossomos e bridging anaphase (a -c). C. defeitos observados durante a mitose e citocinese telofase incluiu (a) fusos anormais, (b) citocinese anormal com a formação de micronúcleos, (c), unindo os cromatídeos e (d) a formação de células filhas dimensionadas de forma desigual. D. Exemplos de (a) binucleação, (b) multinucleação e (c) micronúcleos em culturas primárias. Green – Numa, vermelho – a-tubulina, azul – DAPI em todos os painéis. A barra de escala em A e B = 5 uM. A barra de escala em C e D = 10 um. gráfico E. Pie ilustrando a frequência global de defeitos mitóticas observados nas culturas primárias.

Foi realizada uma comparação dos perfis de coloração NuMA para mitótica dados. Altos níveis de Numa em núcleos interfásicos foram significativamente associados com uma pequena proporção de células em telophase (

p

= 0,012) e uma alta proporção de células exibindo uma placa metafásica solta (

p = 0,032

) (Figura 6A e B). Altos níveis de Numa nos pólos do fuso mitótico significativamente correlacionada com altas taxas de binucleação (

p =

0,021) e multinucleações (

p =

0,007) (Figura 6C e D) e novamente com metaphase solta placas (

p =

0,041) (Figura 6E). Os baixos níveis de NuMA em pólos do fuso significativamente correlacionada com uma alta proporção de células em citocinese (

P =

0,05) (Figura 6F). Curiosamente, os níveis intermediários de Numa nos pólos do fuso significativamente correlacionada com baixas taxas de erro em citocinese. (

p =

0,01) (Figura 6G). Para verificar ainda mais os dados observados na nossa análise de imunofluorescência das culturas primárias que imunocoradas secções inteiras de tecido de tumor sólido a partir de 23 pacientes cujos fluidos de ascites foram usados ​​para gerar as culturas. Isto confirmou que os tumores sólidos que apresentam níveis elevados de coloração de NuMA gerado culturas primárias ascítico onde as células exibiram níveis de expressão elevada NuMA (Figura S1 a-d). Para verificar que a interfase observado e defeitos mitóticas também foram uma característica comum dos tecidos tumorais associadas analisamos 23 secções de tumor disponíveis para nós por Numa imunocoloração e H E coloração IHC. Notou-se que os mesmos defeitos interfase e mitose estavam presentes nesses tumores, como nas amostras de ascite. Imagens representativas e um resumo dos defeitos observados entre as amostras são mostradas na Figura S2A-D. Além disso, as culturas de células com um elevado índice mitótico foram encontrados para exibir elevada actividade mitótica no tecido associado a tumor (Figura S3). Por fim, explorou a relação entre os níveis de expressão NUMA culturas primárias e sobrevida do paciente. Isto sugere que os pacientes com moderada a forte imunomarcação NuMA nos pólos do fuso em culturas primárias têm uma taxa de sobrevivência mais baixa do que os pacientes com fraca imunomarcação Numa, embora esses dados preliminares não alcançou significância estatística (Figura S4), talvez devido ao tamanho reduzido da amostra.

forte expressão NuMA nuclear foi associada com (a) a menor proporção de células telophase e (B) a maior proporção de células com uma placa metafásica difusa. rotulagem pólo NuMA eixo forte foi associada com altas taxas de (C) binucleação, (D) multinucleações, (E) uma placa difusa metaphase e (F) a menor proporção de células na citocinese. (L) Intermediário fuso coloração pólo foi associado com a menor proporção de células que exibem um defeito citocinese. (H) FACS análise revelou que apenas as células com altos níveis de Numa foram aneuploidia.

FACS

análise FACS indicou que apenas as células de culturas primárias com alta NuMA intensidades de coloração fuso pólo eram aneuploidia (Figura 6H), uma observação estatisticamente significativa (

p =

0,008).

Discussão

neste estudo teve como objetivo investigar

expressão NuMA1

em EOC e relacionar isso a aneuploidia encontrado neste tipo de câncer. Uma pesquisa inicial Oncomine indicou que a expressão NuMA é regulada em EOC. Nossos dados piloto geradas por Affymetrix profiling também sugeriu que

NuMA1

expressão foi regulada no cancro do ovário. Nós confirmou esta observação no nível de proteína por IHC, notando que Numa nuclear estava presente em níveis baixos nos núcleos de estroma ovariano normal e epitélio enquanto tumores primários de ovário tinham níveis elevados NUMA. Altos níveis de Numa foram associados com o grau do tumor, estágio da doença, e comprometimento de linfonodos e inversamente à invasão tumoral. No entanto, a expressão NuMA diferiu entre os quatro principais subtipos EOC. Considerando os níveis de NuMA diminuiu com o grau do tumor e aumentou com o estágio da doença no subtipo serosa, eles aumentaram com o grau do tumor no subtipo mucinoso e diminuiu com o estágio da doença no subtipo endometrioid. No subtipo de células claras foram observadas apenas baixos níveis de NUMA. Estas diferenças são susceptíveis de reflectir a heterogeneidade molecular de EOCs. Recentemente, EOCs foram reclassificados de acordo com suas características moleculares em tipo I (baixo grau serosa, baixa endometrioid grau, todos os carcinomas mucinosos e claras de células) e (carcinomas de alto grau serosa e endometrióides) tipo II com mutações principalmente em

KRAS

e

PTEN

em tipo I e mutações no

TP53

em [25], [26] tipo II. níveis NUMA nosso estudo foram maiores no EOCs tipo I (cânceres serosa e mucinoso de baixo grau), sugerindo NuMA superexpressão pode ser um evento precoce na carcinogênese.

As células malignas derivadas de fluidos ascítico têm sido utilizados no passado para gerar uma riqueza de informações sobre imunologia e terapêutica em EOC e foi proposto que a sua utilização pode complementar os procedimentos convencionais de diagnóstico [27]. Aqui, o estudo IF das culturas primárias permitida uma novela e exame detalhado das provas de aneuploidia através da identificação de ambos os defeitos mitóticas específicas e as consequências interfase de tais defeitos. Curiosamente, descobrimos que os níveis elevados NuMA nos pólos do fuso foram associados com altos níveis de binucleação e multinucleações. O desenvolvimento de tetraploidia como resultado da citocinese não representa um potencial evento precoce no desenvolvimento da instabilidade cromossómica (CIN) e, eventualmente, cariótipos aneuploidia em células tumorais [10]. Os defeitos de mitose que observadas nas nossas culturas primárias, tais como fusos multipolares e defeitos de citocinese, poderia explicar a ocorrência de células binucleadas e multinucleadas nestas amostras. Coerente com isso, nós também encontrou uma correlação estatisticamente significativa entre aneuploidia e altos níveis de Numa nos pólos do fuso em nossas culturas.

Tendo estabelecido que os níveis de proteína NuMA está regulada no EOC e que esta está associada a aneuploidia, o próximo passo será determinar a cumplicidade funcional de Numa no desenvolvimento deste aneuploidia. Trabalho de outros investigadores mostrou que a expressão condicional de NuMA em uma linha de células mielóides de rato resulta em aneuploidia e apoptose [28]. Sugeriu-se que a sobre-expressão de NuMA por si só não foi suficiente para dirigir a transformação maligna em células leucémicas, mas que ela pode contribuir para a instabilidade cromossomal, permitindo acontecimentos genéticos que promovem a progressão do ciclo celular ou a apoptose de protecção para ocorrer. Um tal caso poderia ser a aquisição de mutações de p53, tal como os observados em carcinoma seroso de alto grau [29]. Alternativamente, Numa interage com a proteína dineína motor durante a mitose e tem sido sugerido que a saturação de actividade dineína NuMA por sobre-expressão pode antagonizar vias de que as células cancerosas utilizadas para resolver problemas tais como fusos multipolares. Estes geralmente surgem devido à presença de centrossomas excedentários, levando a um aumento da instabilidade genómica impulsionado por defeitos na mitose [30]. Esta hipótese pode ser aplicável a EOC uma vez que as consequências biológicas de divisões celulares multipolares são consistentes com os resultados observados no nosso trabalho imunofluorescência. amplificação Centrosomal também foi anteriormente observado em células EOC e tem sido associada a aneuploidia e mau resultado paciente em EOC seroso. Este fenómeno parece ser causada pela sobre-expressão de Aurora-A, um membro da família de cinases de serina /treonina envolvida em eventos de mitose [31], [32].

O antigénio tumoral acrosina proteína de ligação (ACRBP) /OY-TES-1, tem sido mostrado para interagir com NUMA. A relação de co-dependente com um papel na resistência paclitaxel em EOC foi proposto [33]. NuMA a sobre-expressão foi sugerida para causar perturbações mitóticas necessários para a plasticidade do genoma pré-neoplásicas, com sobre-expressão de co-evolução de ACRBP como tumores progresso dirigir a aquisição de características para a normalização destes primeiros perturbações que de outro modo poderia ser desvantajosa para a proliferação de células de cancro através da promoção catástrofe mitótico. O mesmo estudo também revelou que a doença mais agressiva entre uma coorte de pacientes EOC foi associada com níveis elevados combinados de ACRBP e NUMA. A possibilidade que Numa superexpressão age sinergicamente com a Aurora-A e ACRBP superexpressão de promover a aneuploidia, a sobrevivência pobre e chemoresistance em EOC é intrigante e digno de uma investigação mais aprofundada. Como parte deste, os nossos dados preliminares que sugerem que os níveis de expressão NuMA estão associados com a sobrevivência em EOC vai ser mais explorado em uma amostra maior definido para determinar se este fenômeno é estatisticamente significativa.

Em conclusão, nossos dados demonstram para a primeira vez que é sobre-expresso de NuMA em EOC e que níveis elevados de NuMA se correlacionam com o aumento de defeitos de mitose e aneuploidia em culturas de ascites provenientes de doentes com tumores do ovário.

Materiais e Métodos

linhas celulares e primária culturas de células malignas derivadas de ovário ascítico Fluidos

As linhas celulares utilizadas neste projeto incluiu quatro linhas celulares de cancro do ovário (JAMA-2, Skov-3, TR175 e 1847), uma linha de células de neuroblastoma (SH-SY5Y) , linha de células de adenocarcinoma um dois pontos (SW480), uma linha cervical célula cancerosa (HeLa) e uma linha de células de câncer de mama (MCF7). As linhas celulares foram obtidas a partir de Cancer Research UK, o ECACC e da Colecção Cell Biology ATCC. As culturas primárias de células derivadas a partir de fluidos ascíticos de ovário (GYNA0089), tecidos de tumor de ovário tumores benignos (1153-A1) (BE4163-T1 e AQ70880-T1) ou foram estabelecidas como previamente descrito [18]. As informações do paciente e os dados clínicos para os fluidos de ascites de ovário tem sido descrito anteriormente [18].

normal do ovário e do tumor do tecido

espécimes patológicos de formalina fixos, tecidos embebidos em parafina que consistem em seções de ovariana normal tecidos e tumores primários (incluindo tumores que produziram os ascite a partir do qual culturas primárias estavam preparados) foram obtidos a partir Hospital Universitário Histopatologia Arquivo de St James, Leeds. Sete tecidos normais estavam disponíveis, 5 amostras de tumor de que também tinha associados. Obteve-se um total de 23 tecidos de tumor correspondentes culturas primárias derivadas de células malignas. An 25 tumores primários independentes adicionais do ovário com dados clínicos associados foram identificados e utilizados para criar um micro-arranjo em casa mini-tecido (TMA). A TMA composta de 9 adenocarcinomas serosos, 6, 2 carcinomas endometrióides mucinosos, 2 mista Mullerianos, 5 misto endometrióides serosa e, e um adenocarcinoma. A alta densidade TMA câncer de ovário que consiste de 280 casos de adenocarcinoma de ovário (serosa, mucinoso e endometrioid), 13 de carcinoma de células claras, um carcinoma de células transicionais, 20 tecido normal adjacente e 8 tecidos normais em duplicata, com palco e informações da categoria, foi obtido de Redes Tissue array (OV6161, Tissue matriz de rede). Dados clínicos de acompanhamento incluíram idade, comprometimento de linfonodos, invasão tumoral paciente e metástase.

Dados do Paciente

detalhes clínicos associados para pacientes para os quais culturas primárias de células malignas derivadas de fluidos ascítico ovarianos foram estabelecidos, foram descritos anteriormente [18].

Affymetrix Profiling

Os dados para linhas de células de ovário, culturas primárias e amostras de tumores associados foi recuperado a partir de uma análise de expressão gênica microarray, gerado com GeneChip HG-U133 mais 2,0 matrizes (Affymetrix) que foi normalizado utilizando MAS 5,0 como anteriormente descrito [18].

Anticorpos

O NuMA anticorpo monoclonal Ab-2 (clone 107-7, Calbiochem) foi usada ao longo deste estudo . Este anteriormente tem sido extensivamente utilizada para a Western blotting, imunofluorescência e IHC [19], [20]. Para se os estudos de rato anti-tubulina-α anticorpo (1/500, MCA77G, Serotec) foi utilizada para identificar os microtúbulos e 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI 5 ug /ml, Sigma-Aldrich) utilizado para corar o ADN .

slot de blotting

slot blotting de lisados ​​celulares foi realizada como descrito anteriormente [18]. 0,01 mg de amostra foi carregada em cada poço e o anticorpo monoclonal de NuMA Ab-2 foi utilizado a uma diluição de 1/400.

TMA Construção

Para a criação de um in-house TMA ovário um protocolo descrito por Abd El-Rehim

et al

[21] foi seguido. Manual de socos arrayer tecido com um diâmetro de 0,6 mm (Beecher Instruments, Inc) foram usadas para criar os núcleos.

Imunohistoquímica

Slides contendo seções inteiras ou núcleos TMA foram bloqueadas com 3% H

2O

2 em metanol, depois de-depilação e reidratação. A recuperação antigênica foi realizada por slides de panela de pressão durante 2 minutos em Antigen Unmasking Solution (pH baixo, Vector Laboratories). Depois de três lavagens de 5 minutos em TBS-Tween-20 (0,2%) das lâminas foram bloqueadas durante 10 minutos com 10 × caseína (Vector Laboratories) diluída 1:02 em água destilada. Depois de três lavagens de 5 minutos com TBS-Tween 20, as lâminas contendo secções inteiras foram colocados em unidades sequenzer Shandon Considerando lâminas contendo secções de TMA foram deitadas dentro de uma câmara de incubação humidif içado, durante a incubação com o anticorpo primário. anticorpo NuMA Ab-2 diluída em solução de anticorpo (Zymed) foi aplicada em 1/300 para seções inteiras e 1/100 para os slides TMA. As lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C. Depois de três lavagens de 5 minutos cada com TBS-Tween-20 as lâminas foram incubadas em 100 ul de HRP de coelho /rato real EnVision ™ ™ (DAKO) durante 30 minutos em câmara de unidades sequenzer ou incubação. Após três lavagens finais com TBS durante 5 minutos, foi adicionada solução de revelação (tampão de DAB + cromogénio /substrato, DAKO) durante 10 minutos até o desenvolvimento da cor estava completa. A coloração foi intensificada em 0,5% de CuSO4 (0,9% em solução salina) durante 5 minutos. Após contracoloração em hematoxilina durante 2 minutos, as secções foram desidratadas e montadas em DPX (Sigma). imagens TMA foram escaneados e analisados ​​utilizando software Aperio ImageScope Viewer. Slides contendo seções inteiras foram vistos com um microscópio Olympus BX61 com câmera Colourview e software CellP®. Um sistema de pontuação rotulagem, que aplicou dois critérios de pontuação, foi utilizado [22]. Em primeiro lugar, o número de núcleos corados foram contados e expressos como uma percentagem do número total de núcleos dentro da secção de tecido ou núcleo. Em segundo lugar, a intensidade de expressão nuclear predominante foi pontuado como 0 – sem coloração, 1 – trace, 2- fraco, 3- médio e 4- forte. O resultado final foi calculada como a percentagem de núcleos corados multiplicada pela intensidade expressão predominante.