Abstract

Fundo

As células tumorais são caracterizados por crescimento acelerado geralmente acompanhada de vias de up-regulamentados, que em última análise, aumentar a taxa de produção de ATP. Estas células podem sofrer reprogramação metabólica, resultando em fenótipos bioenergéticos distintas, geralmente aumentando a glicólise canalizada para a produção de lactato. No presente trabalho nós mostramos reprogramação metabólica por meio de inibidores de histona deacetilase (HDACis), butirato de sódio e tricostatina. Este tratamento foi capaz de mudar o metabolismo de energia, ativando sistemas mitocondriais, tais como a fosforilação da cadeia e oxidativa respiratória que foram amplamente reprimidas nos controles não tratados.

Metodologia principais conclusões

Vários parâmetros /celulares e bioquímicos foram avaliados no cancro do pulmão H460 células tratadas com os inibidores da histona-desacetilase (HDACIs), butirato de sódio (NaB) e a tricostatina a (TSA). NAB e TSA reduzida fluxo glicolítico, testada por libertação de lactato por H460 células de uma forma dependente da concentração. NaB inibiu a expressão de glucose tipo transportador 1 (GLUT 1), mas a actividade da hexoquinase mitocôndrias ligado (HK) aumentou substancialmente. Nab aumento induzido na actividade HK foi associada a isoforma HK I e foi acompanhado por aumento de 1,5 vezes na expressão de ARNm e HK I biossíntese proteína cognata. lactato desidrogenase (LDH) e actividades de piruvato-cinase (PYK) mantiveram-se inalterados pela HDACis sugerindo que o aumento na actividade HK não foi acoplado ao fluxo glicolítico. ventilometria alta resolução de células H460 revelou NAB dependentes aumento das taxas de consumo de oxigênio acoplado a síntese de ATP. A análise mostrou que metabolômico NaB alterou o perfil metabolito glicolítica de células H460 intactas. Concomitantemente que detectada uma activação da via da pentose fosfato (PPP). foi mostrado a elevada O

2 consumo em células tratadas com NaB não estar relacionado com biogênese mitocondrial desde citrato sintase actividade (CS) e da quantidade de DNA mitocondrial permaneceu inalterada.

Conclusão

NAB e TSA induziu um aumento na função mitocondrial e metabolismo oxidativo nas células tumorais de pulmão H460 concomitante com um fenótipo celular menos proliferativa

Citation:. Amoêdo ND, Rodrigues MF, Pezzuto P, Galina a, da Costa RM, de Almeida FCL, et ai. (2011) metabolismo energético em H460 células de câncer de pulmão: Efeitos da histona Deacetilase. PLoS ONE 6 (7): e22264. doi: 10.1371 /journal.pone.0022264

editor: Alicia J. Kowaltowski, Instituto de Química – Universidade de São Paulo, Brasil

Recebidas: 1 de fevereiro de 2011; Aceito: 20 de junho de 2011; Publicação: 18 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Amoêdo et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por doações do Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), a Fundação do Câncer, Instituto brasileiro de Neurociências – IBNnet FINEP, INCT – excitotoxicidade e neuroproteção # 01.06 0,0842 e INCT – Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a proliferação desmarcada e invasão típica das células cancerosas são processos que só podem ser sustentadas quando há fornecimento de energia suficiente, uma característica que indica a ocorrência em células transformadas de fenótipos distintos que, necessariamente, envolvem elementos do metabolismo intermediário. Em tumores sólidos, tem sido demonstrado por Otto Warburg que as células adaptaram-se a contar da glicólise anaeróbia como uma estratégia para manter o seu estado anabólico prevalecente [1]. No entanto, a regulação positiva da glicólise exibido por células cancerosas não implica necessariamente um fenótipo anaeróbio estrito, nem um sistema de fosforilação oxidativa disfuncional (OXPHOS). Em vez disso, acredita-se que a interacção normal entre o glicólise no citosol e nas mitocôndrias OXPHOS se torna perturbado ou reprogramado em células tumorais. O efeito Crabtree observado em células cancerosas, ou em células de proliferação rápida exemplifica a conexão íntima entre a glicólise eo metabolismo oxidativo [2].

Curiosamente, o fenótipo anaeróbio exibido por células cancerosas podem de fato representar a causa, em vez de a consequência da pressão adaptativa. Ao considerar que o interruptor glycolytic típica das células cancerosas é adquirido no próprio início da carcinogênese, surgiu a ideia de que as alterações na via glicolítica pode predispor à transformação maligna de células [3], [4]. vantagens seletivas para as células transformadas pode resultar de vários recursos. Por exemplo, sabe-se que a hipoxia-inducible factor-1 (HIF-1α) estimula significativamente a expressão de glicose e monocarboxilatos transportadores, enzimas glicolíticas e induz uma regulação para baixo em piruvato desidrogenase complexo de [5]. Além disso, as células tumorais apresentam a isoforma de HK que se liga à proteína formadora de canal anião poro mitocondrial dependente de voltagem (VDAC). Ao impedir a interacção de proteínas pró-apoptóticas com mitocôndrias enzima ligada actua essencialmente como um agente anti-apoptótica. De facto, tem sido mostrado que a libertação de proteínas apoptóticas tais como o citocromo

C

depende da integridade da porção N-terminal de VDAC [6]. Uma vez que foi demonstrado que HK e Bcl-2 foram capazes de conferir protecção contra a apoptose através da interacção com VDAC região de um N-terminal, a participação de HK II, tal como um promotor de diferenciação celular foi reforçado.

de Enzimas das vias glicolíticas e oxidantes são, como as proteínas em geral, susceptíveis a regulação da expressão do gene ao nível da cromatina. estruturas de cromatina alternam entre conformações compactadas e relaxado que por sua vez dependem da acetilação e desacetilação do núcleo da proteína histona. Os sistemas enzimáticos envolvidos nestes processos são histonas acetil transferases (chapéus) que acrescentam grupos acetilo para os resíduos de lisina e histona desacetilases (HDACs) que lhes remover. cromatinas compactada e relaxado ter sido ligado ao gene da repressão e activação de expressão, respectivamente. Embora histonas constituem os substratos principais para chapéus e HDCAs, outras proteínas não histonas, tais como transcrição fatores-p53, a proteína do retinoblastoma pRb e HIF-1α; chaperonas (HSP90), enzimas metabólicas (piruvato cinase; acetil-CoA-sintase) e receptores de esteróides também são acetiladas /desacetilado por estas enzimas. Portanto, chapéus e HDACs pode afetar um amplo espectro de processos biológicos que incluem a paragem do crescimento, reparo do DNA, bioenergética celular, vias de morte celular (apoptose e autofagia), a mitose, a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS), senescência e angiogênese [7 ], [8]. Devido às suas acções repressivas, HDAC tornaram-se alvos interessantes para o desenvolvimento de drogas que foi possível recuperar a capacidade das células transformadas para sofrer apoptose. Actualmente, vários inibidores de HDAC (HDACIs) obtidos a partir de fontes naturais ou sintéticas, têm sido caracterizados. Eles são agrupados em classes químicas de cinco, que incluem o ácido hidroxâmico e compostos derivados, benzamidas, péptidos cíclicos, ácidos gordos de cadeia curta e cetonas.

Como acima mencionado, os HDACis alterar várias funções em células normais e transformadas que torna difícil identificar um mecanismo de acção destas drogas. Vários relatórios existem mostrando a acção do HDACi sobre o ciclo celular e apoptose. O presente trabalho tem dissecados essas ações amplas, concentrando-se sobre o metabolismo energético e demonstrando que HDACis pode afetar a proliferação, agindo sobre as enzimas individuais das vias glicolíticas e oxidativa. A informação disponível mitocôndrias medida estudando a partir de fígado de rato tratada com o ácido gordo de cadeia curta valproato derivado (APV) têm mostrado que inibe de ácidos gordos β-oxidação e, em geral, deprime o metabolismo oxidativo celular que conduz a uma diminuição em ambos, a taxa de O

2 consumo acoplado a actividade da síntese de ATP e citocromo-oxidase [9], [10], [11]. células de adenocarcinomas colorrectais (HT29) tratadas com butirato, outra classe de cadeia curta de ácidos gordos HDACi, inibiu a absorção de glucose e oxidação, bem como a síntese de ribose e o aumento

síntese de novo de ácidos gordos, juntamente com a activação do PPP. No entanto células MIA, adenocarcinoma do pâncreas butirato-resistente, não exibir quaisquer alterações em seu perfil metabólico após o tratamento. Estas alterações metabólicas foram correlacionados com a indução de processos de diferenciação mediada por butirato e, consequentemente, com os seus efeitos inibitórios sobre o crescimento. Resultados semelhantes foram obtidos com células expostas a TSA [12], [13]. Em células de mieloma, o VPA e HDACis suberoilanilida do ácido hidroxâmico (SAHA) induziu um decréscimo na absorção de glucose, GLUT uma expressão e actividade HK, que conduz a apoptose em células tumorais. Além disso, estes inibidores do catabolismo aumentado de amino ácido [14].

O presente estudo examinou os papéis de NaB e TSA de vários parâmetros, bioquímicos e morfológicos, da linhagem de células H460 do cancro do pulmão de células, a fim de clarificar a forma como estes HDACis interfere com a homeostase de células tumorais. Os dados mostraram conclusivamente que o tratamento com NaB por 24 h levam a um metabolismo oxidativo geralmente reforçada sugerindo claramente que HDACis pode transcender seu papel canônica ao nível da cromatina.

Métodos

Cultura de Células

H460, uma célula de cancro do pulmão humano (ATCC, depositado por AF Gazdar, 1982), foi mantida em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), pH 7,4 a 37 ° C numa câmara de incubação humidificada com 5% de CO

2. As células foram sub-cultivadas a cada 2 dias e usado em experiências quando atingiram 85% de confluência. As células H460 foram genotipados em nosso laboratório usando 8 loci mais amelogenina. Todos os loci combinava com o perfil ATCC DNA STR.

viabilidade celular e citotoxicidade Ensaio

Para os ensaios, as células foram cultivadas em 24 e placas de 96 poços. 24 h após o plaqueamento, as células foram incubadas com três diferentes concentrações de NaB (1, 3 e 10 mM) e o TSA (0,02, 0,2 e 1 uM) durante até 48 h. Após cada tratamento, a viabilidade celular foi acedida utilizando o ensaio de MTT, tal como descrito anteriormente [15], e ensaio de exclusão de tripano de corante azul. Citotoxicidade foi testada por libertação de lactato desidrogenase (LDH) após o tratamento NaB utilizando o kit de Ensaio de citotoxicidade CytoTox96 não radioactivos (Promega).

análise do ciclo celular

Para as células H460 coloração DNA foram cultivadas em 6 bem placas e tratados com 3 ou 10 NaB mM e 0,2 uM de TSA durante 24 h. As células foram sedimentadas (1000

xg

durante 5 min. A 4 ° C) e ressuspendido em 500 uL de solução de coloração de PI, composto por 50? G de iodeto /mL de propídio (PI), 1 mg /ml de RNAse e 0,2% de Triton X-100. As amostras foram incubadas em gelo durante 15 min. no software CellQuest escuro e, em seguida, analisados ​​em citômetro de fluxo FACSCalibur (Becton Dickinson) utilizando (Becton Dickinson), respectivamente, para aquisição de dados e análise de distribuição do ciclo celular.

Cinética de Lactato de lançamento na cultura de mídia

Após o tratamento com diferentes concentrações de TSA e NaB durante 24 h, o meio de cultura foi substituído por meio RPMI 1640 fresco sem vermelho de fenol e de FBS. Nos tempos indicados (0, 15, 30, 40, 50 e 60 min.), Alíquotas de meio de cultura foram recolhidos para avaliar a libertação de lactato através deste ensaio enzimático: medição do lactato foi realizada num tampão de hidrazina /glicina (pH 9,2), contendo 5 mg /mL de NAD-β

+ e 15 unidades /ml de lactato-desidrogenase. A absorvância devida à formação de NADH foi monitorizada num leitor de microplacas (SpectraMax M5, Molecular Devices) a 340 nm e foi correlacionado com a presença de lactato de amostras a partir de uma curva padrão [16].

Preparação de mitocondrial e as fracções proteína citosólica

sedimento celular H460 foi misturado com um tampão de lise contendo Tris-HCl 10 mM pH 7,4, 0,25 M de sacarose, 20 mM de NaF, 1 mM de DTT, 5 mM de EDTA, PMSF a 1 mM e inibidores de protease cocktail (quimostatina, leupeptina, antipaína, pepstatina A – Sigma-Aldrich). A suspensão de células foi transferida para homogeneizadores (Wheaton Potter-Elvehjem) para a lise celular. A suspensão foi centrifugada a 100

x g durante 5 min

. a 4 ° C, o sedimento com detritos foi descartado e o sobrenadante resultante foi centrifugado a 10.000

x g durante 15 min

. a 4 ° C. Em seguida, o sobrenadante (fracção citosólica) foi utilizado para a medição das actividades recuperadas de HK, PYK, LDH e desidrogenase de glicose-6-fosfato (G6PDH) e o sedimento (fracção mitocondrial) foi utilizado para a medição das actividades recuperadas de mt-HK e CS. Estes extractos foram utilizados para a transferência de Western e ensaios de actividade enzimática. A concentração de proteínas foi realizada utilizando o método Bradford

atividade enzimática Ensaios

actividades enzimáticas foram medidas usando os seguintes meios de reacção:. (a) para HK, Tris-HCl 20 mM pH 7,4, 10 mM MgCl

2, 1 mM de NAD-β

+, 1 unidade /mL de G6PDH (

Leuconostoc mesenteroides

), 0,1% de Triton X-100, ATP 2 mM e 5 mM de glucose. (B) Para PYK, Tris-HCl 50 mM pH 7,4, MgCl 5 mM de

2, 50 mM de KCl, 0,2 β de NADH, ADP 2,5 mM, 0,1% de Triton X-100, fosfoenolpiruvato 5 mM, 0,5 unidades /ml de lactato-desidrogenase. (C) Para a LDH, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 1 mM de EDTA, 0,2 β de NADH, 0,1% de Triton X-100, 1 mM de piruvato mm. (D) Para G6PDH, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, MgCl 5 mM de

2, 0,1% de Triton X-100, 2 mM de glicose-6-fosfato 0,2 mM e β de NADH. As reacções foram iniciadas pela adição de 20-140 ug de proteína para HK e 10 ug de proteína para PYK, LDH e G6PDH e foram realizadas a 37 ° C durante 5 min. Após a incubação, as amostras foram imediatamente fervida e colocada em gelo. A absorvância foi medida a 340 nm e o valor utilizado para calcular a actividade específica das enzimas definida como a quantidade de substrato formado por miligrama de proteína por minuto. (E) Para CS, 50 mM Tris-HCl pH 8,1, 0,3 mM de acetil-CoA, 0,1% de Triton X-100, 0,1 mM de DTNB, oxaloacetato 0,5 mM. A reacção foi iniciada pela adição de 10 ug de proteína e levada a cabo a 30 ° C durante 5 min. A absorvância foi medida a 412 nm. (F) Para a succinato desidrogenase (SDH), tampão de fosfato 50 mM (pH 7,4), 0,1% de Triton X-100, 0,8 mM de KCN, 0,06 mM de 2,6-diclorofenolindofenol (DCIPIP), 1,1 mM de fenazina (PMS) e 100 ug proteína A reacção foi realizada a 25 ° C durante 7 min e foi parada com 10 mM de malonato. A redução de DCPIP foi monitorizada a 600 nm.

Western Blotting

25 ug de extractos proteicos foram separados por SDS-PAGE padrão e transferido para nitrocelulose por electrotransferência membranas em tampão constituído por glicina 39 mM , Tris-base 48 mM, 0,037% de SDS e 20% de metanol. Western blot foi efectuada utilizando anticorpos primários diluídos em TBS, 0,1% Tween 20 e 5% de BSA. Foram utilizados anticorpos primários contra HK I, HKII e VDAC 2 (Abcam).

Consumo de Oxigênio de células intactas e Digitonin-permeabilizadas H460

O

2 taxas de consumo foram medidos polarograficamente usando alta ventilometria -Resolução (Oroboros Oxygraph-O2K). Após o período de tratamento, o meio foi removido e as células foram quer suspensos em meio RPMI (glucose e 2 mM de glutamina 11,1 mM) ou DMEM isento de glucose para medições de O

2 consumo de células intactas, ou no meio de respiração pH 7,0 (0,25 H manitol, 10 mM de MgCl

2, KH 10 mM

2 PO?

4, HEPES 10 mM, EDTA 0,08 mM, EGTA 1 mM e 0,1% de ácido gordo livre de BSA) para a avaliação de complexos respiratórios de células permeabilizadas . O consumo rotineiro, oligomicina-respiração independente (vazamento de protões) e FCCP respiração estimulada por (máximo de respiração) foram medidas em células intactas H460 como descrito anteriormente [17]. Nab efeitos sobre complexos respiratórios de 0,003% de células H460 permeabilizadas-digitonina foram realizados após a adição de diferentes substratos /moduladores piruvato, tal como 10 mM + malato 10 mM (substratos complexo I-ligada), succinato 10 mM (substrato complexo II-ligada) , 0,5 uM rotenona, 100 uM de ADP. Quando se examina o estado 3 induzida por 2-deoxiglicose (2-DOG), 10 mM de 2-DOG foi adicionado. DatLab software (Oroboros Instruments, Innsbruck, Áustria) foi utilizado para a aquisição e análise de dados.

Extração de RNA e Síntese de cDNA

O ARN total foi isolado a partir de células H460, utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O ARN total foi quantificado espectrofotometricamente e 1 ug foram tratados com 1 U de DNase isenta de RNase durante 30 min. a 37 ° C. As reacções foram interrompidas por adição de 1 ul de EDTA a 20 mM e aquecimento durante 10 min. a 65 ° C. síntese de cDNA foi realizada usando o RNA tratada DNAse acordo com High Capacity cDNA Transcrição Reversa Kit da Applied Biosystems.

PCR em tempo real

Análise de expressão gênica foi realizada utilizando-7500 PCR em Tempo Real (Applied Biosystems) e poder SYBR-GREEN PCR master mix (Applied Biosystems). Para este teste, os pares de iniciadores foram sintetizados com base nas sequências do GenBank de ARNm. As sequências dos iniciadores são apresentadas na Tabela S1. O método Ct comparativa foi utilizado para comparar as alterações dos níveis de expressão de genes [18]. Actina foi utilizado como um controle endógeno.

Electron Microscopy

As células foram lavadas uma vez com PBS morno e fixadas numa solução de pH 7,2 contendo 2,5% de glutaraldeído, tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, pós-fixadas com 1% de OsO

4 (tetróxido de ósmio) em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M. Em seguida, as células foram lavadas com PBS, desidratados com acetona e embebidas em Epon. seções ultra-finas (70 nm) foram coradas com acetato de uranilo e citrato de chumbo, e observadas em microscópio eletrônico Zeiss 900. Para a morfometria mitocôndrias, vinte micrografias eletrônicas foram colhidas de cada amostra e analisados ​​para a morfologia. As medições de cada mitocôndria perfis área em secções ultrafinas foram feitas usando J software de imagem (NIH).

Ressonância Magnética Nuclear (RMN) para análise metabolômica

metabolômica triagem de células H460 foi realizada como descrito em [19] com algumas modificações. Resumidamente, o meio de cultura de células não-tratados e tratados com NaB H460 foram substituídos por DMEM isento de glucose suplementado com glucose e células mM de D- [U-

13C] 5 foram incubadas durante 1 h. A seguir à incubação, o meio foi removido e cerca de 3 × 10

7 células foram suspensas em DMEM isento de glucose, contendo óxido de deutério a 10%. Unidimensional

espectros de 13C de células H460 metabolitos intactas foram obtidos a 25 ° C. Espectros de H460 células metabólitos foram adquiridos com um 400 MHz Brucker DRX, utilizando uma sonda de ressonância tripla (TXI). processamento e análise de espectros foram realizados utilizando Topspin 2.0 e atribuição metabólito foi feita por comparação alteração química de metabólitos conhecidos depositados na Metaboloma Humano banco de dados v 1.0.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada utilizando Graph pad Prism 5. Os resultados foram expressos em média ± SEM para

n

experimentos independentes. A significância estatística foi determinada pelo aluno de

t

teste,

one-way

ANOVA e

dois sentidos

ANOVA.

Resultados

butirato de sódio e tricostatina a inibiu a proliferação de células H460 e induziu alterações morfológicas compatível com um processo de diferenciação

Inicialmente, foram realizados ensaios para avaliar os efeitos NAB e TSA sobre a viabilidade celular para determinar as melhores condições experimentais para estudar os efeitos HDACIs sobre o metabolismo energético, sem interferências causadas por citotoxicidade. Tal como observado por microscopia de contraste de fase, as células tratadas com H460 NaB exibiu diferenças discretas, em comparação com células de controlo. A morfologia observada era compatível com a de células diferenciadas, sugerindo que podem ter contrariado NaB vias reguladoras que em células de tumor possa conduzir a desdiferenciação. Os resultados apresentados na Figura 1 mostram ainda que o tratamento com NaB 10 mM produziu células que eram confluentes e menos são ligeiramente mais alongados do que os não tratados (Figura 1C e D). Curiosamente, a morfologia das células tratadas H460 NAB se assemelhava a células A549, uma célula de cancro do pulmão mais diferenciada que não mostra alterações morfológicas após tratamento NaB (Figura 1A e B). Estas alterações na forma da célula eram possivelmente relacionados com a reorganização do citoesqueleto, desde que o tratamento de células com NaB produziu um acentuado redistribuição de F-actina como revelado pela coloração com rhodamine- phaloidin rotulado (Figura S1; S2 Método). Com base nesta observação a questão de saber se NaB 10 mM poderia ter tido efeitos citotóxicos sobre as culturas foi levantada. As experiências que envolvem contagem de células simples levada a cabo a 24 e 48 h, mostrou um efeito dependente da dose na proliferação (Figura S2A). Ao fim de 24 h, o tratamento com NaB 10 mM induziu uma redução de 50% em relação a células que não foram expostas ao HDACi. A 48 h de incubação o número de células vivas na NAB 10 mM foi cerca de 10%. As células incubadas com H460 NaB em concentrações de 1, 3 e 10 mM, em seguida, foram testados quanto à viabilidade usando o ensaio de MTT. Os resultados (Figura S2B) mostrou um efeito moderado em 24 h obtendo-se cerca de 80% de viabilidade em NAB 10 mM e cerca de 30% de viabilidade após 48 h de incubação com a mesma concentração. Essencialmente, os mesmos resultados foram obtidos quando estas experiências foram repetidas com TSA, usando concentrações abrangendo 0,02-1 uM, excepto que na concentração mais elevada, TSA parecia ser mais tóxico do que o NaB (Figura S2D-E). Estes resultados mostraram que o TSA e NaB, embora pertencentes a diferentes classes químicas, partilhada efeitos semelhantes. Embora o número de células foi claramente reduzida, como resultado da acção NaB e TSA, os principais efeitos dos dois inibidores poderiam ser melhor interpretado como a inibição da proliferação, em vez de um efeito tóxico directo. A fim de testar se as células tratadas foram danificadas pelas HDACis, a libertação de lactato desidrogenase foi ensaiada após o tratamento durante 24 e 48 h com NaB e TSA (Figura S2F) em várias concentrações. liberação de lactato desidrogenase não foi significativamente afetada pela NaB às 24 h (Figura S2C). Às 48 h e apenas a uma concentração de 10 mM fez tratamento NaB induziu significativamente a libertação de lactato desidrogenase. Além disso, a inspecção das células tratadas por microscopia de fluorescência após coloração com DAPI (Figura S1) revelou núcleos intactos e cromatina, um resultado que argumentam contra os danos celulares. Devido ao seu largo espectro de actividades de NaB, experimentos foram realizados para verificar se o tratamento de células H460 com este inibidor pode influenciar a distribuição de célula ao longo das principais fases do ciclo celular. Estas experiências foram realizadas por quantificação de células tratadas e não tratadas, por meio de separação de células activadas por fluorescência. Os resultados na Figura S3A mostram que, após um tratamento de 24 h, a maioria das células, aproximadamente 80%, foram encontrados na fase G0 /G1 do ciclo celular com uma redução concomitante da fase S. A incubação de células com 0,2 uM de TSA durante 24 h produziu um perfil semelhante (Figura S3B). Tendo em conta estes resultados, o tratamento de NaB 10 mM durante 24 h a diferenciação e a inibição do crescimento celular induzida, mas não era tóxico para células H460. Assim, as experiências envolvendo a incubação de longo prazo de células com as HDACis não foram estendidas para além de 24 h.

As células foram incubadas a 37 ° C incubadora humidificada contendo 5% de CO

2 e fotografado sob condições de campo brilhante utilizando a sistema de documentação de microscópio invertido Nikon TS100. (A) células A549 não tratadas. células (B) A549 tratadas com NaB 10 mM durante 24 h. (C) H460 células. (D) as células tratadas com H460 NaB 10 mM durante 24 h.

butirato de sódio diminuiu libertação de lactato de células H460, reduziu a expressão de GLUT 1 e GLUT aumentou 3 expressão

Quanto o metabolismo de energia, uma das principais características de células altamente proliferativas, incluindo as células tumorais, é a sua passagem para a glicólise anaeróbia [3], [20], [21]. A pressão selectiva, se for o caso, a produção de um fenótipo alterado, tais devem ser resultado de mecanismos de regulação que de algum modo são capazes de detectar o estado de energia das células. Portanto, como um primeiro passo no sentido de detectar vias metabólicas afectadas por NaB e TSA, indagado se esses HDACis poderia afetar diretamente o fluxo glicolítico de células H460. Esta série de experiências começaram por medição da quantidade de lactato no meio de cultura de células após incubação com e NaB 3 10 mM, durante 24 h. A quantidade de lactato libertado foi, em seguida, monitorizada em intervalos regulares durante um período de 60 min. Os resultados são mostrados na Figura 2A. Os valores observados na libertação de lactato foram semelhantes aos observados por Pereira da Silva [19]. Pode ser visto que a libertação de lactato NaB reduzida de um modo dependente da dose. Um padrão semelhante de inibição da libertação de lactato foi obtido após incubação das células com 0,2 uM de TSA durante 24 h (Figura S4A). Após 60 min. incubação, as células tratadas com TSA libertado cerca de 60% da quantidade de lactato libertado pelos controlos. flutuações de lactato pode ocorrer como uma consequência de perturbações em qualquer fase da via glicolítica. Levando em consideração que, no presente trabalho, os experimentos foram realizados com células em cultura, a reciclagem de lactato através da gluconeogénese foi descartada. Uma possível destino para o lactato pode ser metabolismo oxidativo da célula, assumindo, evidentemente, que as mitocôndrias das células tumorais eram funcionais. Portanto, a libertação de lactato foi testada após incubação de células H460 com NaB durante 24 h seguida por adição de antimicina A. Os resultados foram expressos como a razão entre a libertação de lactato na presença e ausência de antimicina A, são apresentadas na Figura 2B. Após 60 min. com NaB e antimicina A, liberação de lactato estabilizou fora exibindo um aumento de duas vezes sobre as células não tratadas. 0,2 uM de TSA produziu uma resposta semelhante a antimicina A, após 60 min. de incubação (Figura S4B). Além de mostrar que o metabolismo oxidativo está operacional em H460 células, e supostamente aumentado em HDACi células tratadas, estes resultados também apoiou a interpretação de que NaB e TSA, de fato, afetar o fluxo glicolítico. No entanto, a captação de glucose pelas células tumorais ele próprio constituir o pacemaker para toda a via glicolítica. Portanto, as experiências foram concebidas para testar se NaB teve qualquer efeito sobre a expressão de GLUT 1 e GLUT 3 utilizando qRT-PCR. Os resultados na Figura 2C mostra que NaB incubadas a 3 e 10 mm durante 24 h reduziu a expressão de GLUT 1 (1,6 e 4, respectivamente) e aumentou a expressão de GLUT 3 (2,9 vezes) em células H460.

Após 24 h de tratamento com 3 mM ou 10 mM de NaB, H460 células foram incubadas com meio suplementado com glucose. As aliquotas de sobrenadantes foram recolhidos a cada 10 minutos e incubou-se em tampão de hidrazina pH 9,2, com um excesso de NAD

+ e lactato desidrogenase (LDH), para a medição de lactato libertado. Cinética (A) da liberação de lactato e representação de liberação de lactato após 60 minutos (no detalhe). (B) Depois de 30 minutos de incubação com glicose, 2 ug /ml antimicina A foi adicionada à cultura. As aliquotas do sobrenadante foram tomadas em intervalos de 10 minutos e lactato libertado foi medido. A razão de produção de lactato H460 células na presença e ausência de antimicina A evidencia a estimulação da produção de lactato durante a fosforilação oxidativa foi inibida pela adição de esta droga (indicado pela seta preta). Os valores representam a média ± SEM; N = 4, * P 0,05. (C) As células foram tratadas com 3 mM ou 10 mM de NaB durante 24 h e GLUT 1 e (D) 3 GLUT expressão foi determinada por PCR em Tempo Real. Actina foi utilizada para normalizar as quantidades de ADNc. Os valores representam a média ± SEM; N = 3, * P 0,05; ** P . 0,01

butirato de sódio aumentou mitocôndrias actividade da hexoquinase ligado

A redução observada na GLUT 1 e aumento da expressão de GLUT 3 (Fig 2C) sugeriu que um mecanismo compensatório para captação de glicose foi operativo nas células. Assim, pedimos se a atividade HK, um elemento importante na cinética da captação de glicose e fluxo glicolítico, poderia desempenhar um papel. Para investigar isto, a actividade HK foi realizada e a expressão de isoformas HK foi avaliada por qRT-PCR. A Figura 3A mostra que, como resultado da incubação de células H460 com NaB 10 mM, durante 24 h, a actividade das mitocôndrias ligado HK aumentou duas vezes, tanto quanto a dos controlos não tratados. Em contraste, NaB não afectou a actividade de HK citosólica. A localização intracelular de HK I também foi confirmada por imunofluorescência. Os resultados são apresentados na (Figura S5; Método S2). Nestas experiências, a detecção de mitofusin (MFN) I e II, as proteínas que estão ancoradas a mitocôndria e participam na manutenção da sua morfologia e da fusão, foi realizada na mesma preparação, de modo a proporcionar marcadores para os organelos. Comparação das placas NMF (manchado de vermelho) para HK (manchado de verde), mostrou que ambas as proteínas co-localizada nas mitocôndrias. A actividade enzimática mais elevada observada na Figura 3A poderia ter reflectiu um aumento da expressão de HK induzida após uma incubação de longo prazo de células com NaB. Esta possibilidade foi investigada por ensaio de expressão HK HK I e II utilizando qRT-PCR em células H460 expostas a 3 e 10 NaB mM durante 24 h. Os resultados são apresentados na Figura 3B. Ambas as concentrações de NaB aumentou significativamente a expressão de HK I. Por outro lado, NaB induziu um decréscimo na expressão de HK II. Nas experiências de medição HK expressão II (Figura 3B), os valores obtidos após a incubação de células com 3 e NaB 10 mM não foram significativamente diferentes. A confirmação de que NaB induziu um aumento da expressão de HK I foi obtida a partir de experiências que determinam a quantidade real de HK traduzido por meio de Western blot. Os resultados são mostrados na Figura 3C. Pode ser visto que o tratamento de células H460 com NaB 10 mM durante 24 h aumentou claramente a intensidade e a área da banda correspondente a HK I associado às mitocôndrias. No entanto, não foi observada alteração no valor de HKII. Em contraste, citosólica HK I e II eram apenas detectável em controlos e as células tratadas. A maior quantidade de HK mostrado na Figura 3C não podia ser explicada por um aumento da disponibilidade do aceitador hexoquinase mitocondrial, o VDAC, uma vez que as quantidades de esta proteína não se alterou significativamente após tratamento com NaB. Embora o efeito de NaB na expressão de isoformas HK foi claramente demonstrado, que o inibidor não afectou a actividade de qualquer PYK ou LDH. Os resultados são mostrados na Tabela 1. O facto de NaB 10 mM não afecta estas enzimas glicolíticas reforça a ideia de que o HDACi é parcialmente selectivos no seu efeito de modular a actividade das isoformas HK.