Abstract

O rastreio sistemático com base na similaridade estrutural de drogas como colchicina e podofilotoxina levaram a identificação de noscapina, um agente direccionado a microtúbulos que atenua a instabilidade dinâmica dos microtúbulos sem afectar a massa total do polímero de microtúbulos. Nós relatamos uma nova geração de derivados noscapine como potencial de ligação agentes anti-câncer tubulina. experimentos de modelagem molecular destes derivados 5a, 6a-j rendeu melhor pontuação de ancoragem (-7,252 a -5,402 kcal /mol) que o composto original, noscapine (-5,505 kcal /mol) e seus derivados existentes (-5,563 a -6,412 kcal /mol). energia livre (Δ

G

ligamento

) em cálculos baseados na energia de interação linear (LIE) equação empírica utilizando Superfície Generalized Born (SGB) contínuo modelo de solvente previu as afinidades de ligação de tubulina para os derivados de 5a, 6a-J (variando de -4,923 -6.189 para kcal /mol). Composto 6f mostrou afinidade mais alta de ligação à tubulina (-6,189 kcal /mol). A avaliação experimental destes compostos corroborados com estudos teóricos. N- (3-brormobenzyl) noscapina (6f) se liga a tubulina com maior afinidade de ligação (K

D, 38 ± 4,0 ^ M), que é de aproximadamente 4,0 vezes maior do que a do composto original, noscapina (K

D , 144 ± 1,0 uM) e é também mais potente do que a da primeira geração candidato clínico EM011, 9-bromonoscapine (K

D, 54 ± 9,1 uM). Todos estes compostos exibiu citotoxicidade substancial para as células cancerosas, com IC

50 valores que variam de 6,7 mM a 72,9 mM; composto 6f mostrou eficácia anti-câncer proeminente com

50 valores IC variando de 6,7 mM para 26,9 M em células cancerosas de diferentes tecidos de origem. Estes compostos perturbado a síntese de ADN, atrasou a progressão do ciclo celular na fase G2 /M, e morte celular por apoptose induzida em células de cancro. Colectivamente, o estudo relatado aqui identificados, noscapinoids de terceira geração potente como novos agentes anti-câncer.

Citation: Manchukonda NK, Naik PK, Santoshi S, Lopus M, Joseph S, Sridhar B, et al. (2013) Rational Design, Síntese e Avaliação Biológica de Terceira Geração α-noscapine Análogos tão potente tubulina agentes anticancerosos. PLoS ONE 8 (10): e77970. doi: 10.1371 /journal.pone.0077970

editor: Chandra Verma, Bioinformatics Institute, Cingapura

Recebido: 23 de fevereiro de 2013; Aceito: 06 de setembro de 2013; Publicação: 21 de outubro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Manchukonda et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A assistência financeira através do MLP 0002 CSIR 12º cinco projectos ano (CSC0108-ORIGEM CSC0205 – DENOVA). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

ao contrário da ligação atual quimioterápicos tais como paclitaxel e alcalóides Vinca que são confundidos por complicações com efeitos colaterais indesejáveis, tais como a toxicidade sistémica, noscapine [1-3], um over-the-counter antitussígeno alcalóide [4 tubulina , 5], é dotado de melhor perfil anti-câncer [6-8] e perfil de toxicidade mais seguro [9-11]. Mecanisticamente, noscapina se liga a tubulina com uma estequiometria de um (0,95 ± 0,02) molécula noscapina por dímero de tubulina, tubulina altera a conformação após a ligação [12] Ainda permite a polimerização da tubulina em microtúbulos (STM) [13,14]. Noscapina, no entanto, induz a supressão menor da instabilidade dinâmica dos microtúbulos [13,14]. Como resultado, bloqueia a mitose noscapina prometáfase, e talvez devido aos pontos de verificação comprometidas, as células cancerosas selectivamente comprometidos na morte celular por apoptose deixando as células normais ilesas [6-14]. Do ponto de vista farmacológico, noscapina tem muitas vantagens como um agente de ligação de microtúbulos [1]. É eficaz contra linhagens de células tumorais resistentes a múltiplas drogas, afecta as células cancerígenas de forma diferente das células em divisão normais [15,16], tem melhor perfil farmacocinético [17,18] e não danificar tecidos normais (assim desprovido de efeitos secundários tóxicos) [ ,,,0],19,20]. Mesmo que noscapine foi encontrado para ser citotóxica contra uma ampla gama de células cancerosas na biblioteca pública do National Cancer Institute, EUA (tela de 60 células NCI), o IC

50 valores permanece nas gamas altas molares micro ( ~ 21,1 a 100 ^ M) [12]. Como resultado, os vários agentes alvo-tubulina noscapina-base foram desenvolvidos por modificações principalmente em A, B e C locais (Figura 1A) no andaime noscapina [21-28]. Estes compostos são referidos como noscapinoids (Figura 2). Os análogos de primeira geração sintetizados pela manipulação química no ponto de diversidade A no sistema de anel de isoquinolina de noscapina (Figura 1A) incluído nitro [21], azido [22], amino [23,24] e halogenado [25-27] ( flúor, cloro, bromo, e iodo) análogos de alfa-noscapina, e eles exibiram actividade anti-cancro superior. Com base nestes conhecimentos, o anel de lactona de benzofuranona (diversidade ponto B, Figura 1A) foi reduzido ao seu análogo éter cíclico [28] (por exemplo 4-A) e examinados para a sua potência como agentes de ligação de tubulina [29]. Além disso diversificação no ponto C (Figura 1A) sobre o sistema de anel de benzofuranona de noscapina foi reportado para dar a segunda geração O-alquilada [30] /acilado [31] noscapinoids, incluindo o derivado de hidroxi, que é mais potente do que a noscapina-mãe. Estes relatórios sugerem que a manobra química de grupos funcionais incorporados de noscapina tem um impacto significativo sobre a sua actividade biológica. Na continuação de nossos esforços na concepção de novos derivados noscapine, decidimos introduzir modificações no ponto diversidade D (Figura 1B) por funcionalização de ‘N’ em isoquinolina unidade de α-noscapine natural (nós os chamamos de terceiros análogos geração α-noscapine ) que são susceptíveis de melhorar a actividade biológica. Os relatórios descritos na funcionalização em ‘N’ são através de ligações de tipo ureia [32] e muito não foi explorada por sua eficácia biológica. Acreditamos que tipo ureia ligação pode não ser a opção correta uma vez que irá perturbar a densidade de elétrons na isoquinolina N através da deslocalização. Portanto, no presente estudo, adotamos a introdução de grupos funcionais que mantêm o ambiente eletrônico em N praticamente intacta (isto é, para manter o efeito de grupo metil intacta). Assim, o “H” na N-CH

3 é o alvo para a modificação. Todos os derivados descritos e sintetizados estão em linha com esta estratégia de design (Figura 3).

(A) Vários pontos de diversidade para derivação de α-noscapine e (B) estratégia de design de novos análogos a-noscapine (básica esqueleto e estereoquímica é igual ao da α-noscapine natural)

as condições de reacção: (i) a:.

m

CPBA, DCM; b: HCl 2N; c: FeSO

4.7H

2O; (Ii) R-Br, KI, K

2CO

3, acetona.

Aqui nós relatamos a terceira geração congéneres noscapine 6a-j que diferem no substituinte acoplado a isoquinolina ‘ N ‘de α-noscapine natural.

In silico

cálculos de modelagem molecular destes análogos com complexo tubulina foram empregadas para investigar a sua afinidade de ligação com base no modelo preditivo razoável. Os novos análogos, nornoscapine 5a e 6a-J foram sintetizados quimicamente e examinado para as suas propriedades de ligação a tubulina, e pelos seus efeitos sobre a progressão do ciclo celular e a actividade anti-proliferativa em que se dividem rapidamente células cancerosas utilizando linhas de células de cancro humanas representativas de pulmão, mieloma, mama e colo do útero.

Materiais e Métodos

A:. metodologia computacional

preparação Ligand

estruturas moleculares de novos derivados de 5a noscapine, 6a-j (Figura 3) juntamente com os noscapinoids relatados 1, 2a-f (Figura 2) foram construídos usando construtor molecular de Maestro (versão 9.2, Schrödinger). Todas estas estruturas eram de energia minimizado usando macromodel (versão 9.9, Schrödinger) e campo de força OPLS 2005, com algoritmo PRCG (1000 passos de minimização e energia gradiente de 0,001). ordem de ligação adequada para cada estrutura foi atribuído usando Ligprep (versão 2.5, Schrödinger). otimização geométrica completa dessas estruturas foi realizada utilizando a teoria densidade híbrido funcional com potencial de intercâmbio de três parâmetros de Becke ea correlação Lee-Yang-Parr funcional (B3LYP) [33,34] usando base definida 3-21G * [35-37] . Jaguar (versão 7.7, Schrödinger, LLC) foi utilizado para a optimização geométrica dos ligandos.

preparação de proteína

A estrutura complexa colchicina-tubulina co-cristalizado (PDB ID: 1SA0, resolução 3.58Å). [38] foi utilizado para acoplamento molecular e rescoring. Multi-etapa assistente preparação de proteína de Schrödinger (PPrep) foi utilizado para a preparação final de proteína. Faltando átomos de hidrogénio foram adicionados à estrutura usando a interface Maestro (versão 9.2, Schrödinger). Todas as moléculas de água foram removidos a partir do complexo e otimizado a rede de ligações de hidrogénio utilizando PPrep assistente. Os ausentes os aminoácidos de 37 a 47 (cadeia A) e 275-284 (cadeia B) na estrutura co-cristalizado foram preenchidas usando a técnica de modelagem baseada em homologia com base em diferentes modelos, tais como PDB ID: 3DU7 (-C da cadeia ) e PDB ID: 3RYC (de cadeia D), respectivamente, utilizando Prime (versão 3.0, Schrödinger). A estrutura foi obtida de energia minimizado usando OPLS 2005 campo de força com Polak-Ribiere Gradiente Conjugado (PRCG) algoritmo. A minimização foi parado, quer após 5.000 passos ou após o gradiente de energia convergente abaixo 0.001 kcal /mol. Todos átomo de dinâmica molecular (MD) de simulação de estrutura de proteína em água expresso foi realizada usando o software GROMACS 4.5.4 [39] e o campo de força GROMOS96 para uma escala de tempo de 10 ns. foram impostas tridimensionais condições de contorno periódicos, colocando a molécula em um dodecaedro solvatado com o modelo de água SPC216 fornecido no pacote GROMACS e energia minimizado utilizando 1000 passos de descida mais acentuada. O sistema foi neutralizado com 32 Na

+ contra-ião e foi localmente minimizados usando 100 passos de mais íngreme descida. O termo eletrostática foi descrito usando o Particle malha Ewald algoritmo [40]. Os LINCS [41] algoritmo foi utilizado para restringir todos os comprimentos de ligação e corte de distâncias para o cálculo dos Coulomb e de van der Waals de 1,0 nm. O sistema foi equilibrado por 100 ps de MD é executado com restrições de posição na proteína para permitir o relaxamento das moléculas de solvente a 300 K e pressão normal. O sistema foi acoplado ao banho externo pela Berendsen termostato com um tempo de acoplamento de 0,1 ps com a configuração padrão. Os cálculos MD finais foram realizados para 10,0 NS sob as mesmas condições, com um intervalo de tempo de 2 FS. A qualidade global dos valores estereoquímicas, modelo obtido e as interacções não ligadas foram testadas utilizando PROCHECK [42], ERRAT [43] e VERIFY3D [44]. Os resultados Procheck mostrou 94,8% de ângulos backbone estão em regiões permitidas com o G-fatores de – 0,12. Ramachandran trama [45] análise revelou apenas 1,6% de resíduos na região não permitida e 2,3% de resíduos nas regiões generosamente permitidas. ERRAT é um programa de calculadora “fator de qualidade global” para interações atômicas não-ligados. A gama aceite em ERRAT é de 50 e maiores pontuações indicam a precisão do modelo. No caso de tubulina, a pontuação ERRAT foi 88,402 que está dentro da gama de modelo de alta qualidade. Da mesma forma, o VERIFICAR pontuação 3D de 95,25% indica um modelo de boa qualidade.

encaixe Molecular de ligantes e cálculo da ligação energias livres.

O arquivo receptor-grade foi gerado no centróide do sítio de ligação noscapinoid [46] usando Glide (versão 5.7, Schrödinger). Uma caixa delimitadora do tamanho 12A x 12A x 12A foi definida em tubulina e centrado no centro de massa do sítio de ligação, a fim de limitar o centro de massa do ligando encaixada. A caixa de inclusão maior de tamanho 12A x 12A x 12A que ocupava todos os átomos dos poses ancorados também foi definida. O factor de escala de 0,4 para raios de van der Waals foi aplicado para átomos de proteína com cargas parciais absolutos inferiores ou iguais a 0,25. Todos os ligantes foram então ancorado no sítio de ligação usando Glide XP (precisão adicional) e avaliada usando um Glide XP

função de Avaliação [47,48]. Além disso, os complexos ancorados desses ligantes foram energia minimizado com base na simulação Monte Carlo híbrido e sua ligação de energia livre (Δ

G

ligamento

) sobre tubulina foi previsto usando energia de interação linear método (LIE) com uma superfície generalizada Nascido modelo de solvatação (SGB) continuum. O modelo LIE-SGB estima as afinidades de ligação para um conjunto de novos compostos utilizando os dados de afinidade de ligação experimentais de um conjunto de conjunto de treinamento. Neste estudo foi utilizada a formulação original do SGB-LIE (equação 1) proposto por Jorgensen [49] e implementado no pacote de Ligação (versão 5.6, Schrödinger, LLC), utilizando a força OPLS-2005 field.

Δ

G

b

i

n

d

=

α

(

〈

U

v

d

w

b

〉

−

〈

U

v

d

w

f

〉

)

+

β

(

〈

U

e

l

e

c

b

〉

−

〈

U

e

l

e

c

f

〉

)

+

γ

(

〈

U

c

a

v

b

〉

−

〈

U

c

a

v

f

〉

)

(1)

Here ⟨⟩ Representam a média conjunto,

b

representa a forma ligada do ligando,

f

representa a forma livre do ligando, e α, β e γ são os coeficientes.

U

vdw

,

U

elec

, e

U

cav Quais são van der Waals, termos eletrostática, e energia cavidade no continuum SGB modelo de solvente. O termo energia cavidade,

L

CAV

, é proporcional à área superficial exposta do ligando. Vários parâmetros de energia incluído na equação 1 foram calculados a partir do complexo ancorado correspondente a cada análogo, usando o pacote de ligação tal como descrito anteriormente [24]. Os prazos médios de energia LIE foram utilizados para a construção do modelo de afinidade de ligação e estimativa de ligação energias livres de derivados noscapine. O α

,

β, e γ ENCONTRA parâmetros de ajuste foram determinados usando pacote estatístico Minitab (versão 16.0, Minitab Inc.), ajustando as afinidades de ligação experimentais de moléculas do conjunto de treinamento. Um conjunto de dados consistindo de 7 derivados (noscapina compostos: 1, 2-A-F; Figura 2), com afinidades de ligação conhecidas experimentais foi utilizado como um conjunto de treino.

B:. metodologia experimental

A síntese química de derivados noscapina

Reagentes e todos os solventes foram analiticamente puro e foram utilizados sem purificação adicional. Todas as reacções foram realizadas em frascos secos no forno com agitação magnética. Todas as experiências foram monitorizadas por cromatografia em camada fina analítica (TLC) realizada em placas de sílica GF254 gel pré-revestida. Após eluição, as placas foram visualizadas sob iluminação de UV a 254 nm para materiais activos UV. A coloração com PMA e carbonização em uma chapa quente alcançado ainda mais a visualização. Os solventes foram removidos

in vácuo

e aqueceu-se num banho de água a 35 ° C. Sílica gel mais fino do que 200 mesh foi utilizada para cromatografia em coluna. As colunas foram embaladas como pasta de sílica gel em hexano e equilibrou-se com o solvente apropriado /mistura de solventes antes do uso. Os compostos foram carregados puro ou como uma solução concentrada usando o sistema de solventes apropriado. A aplicação de pressão com uma bomba de ar assistido a eluição. Os rendimentos referem-se a materiais e cromatograficamente homogéneas espectroscopicamente a menos que indicado de outra forma. nomes apropriados para todos os novos compostos foram administradas com a ajuda de ChemBioOffice 2010. Os pontos de fusão foram medidos com um aparelho de ponto de fusão Fischer-Johns e não estão corrigidos. A pureza de todos os compostos ( 96%) utilizados para estudos biológicos foram determinadas por HPLC analítica (SPD-M20A, fazer: Shimadzu) utilizando uma coluna ODS eluida com uma mistura gradiente de acetonitrilo-água. A espectroscopia de infravermelho (IR) foram registados espectros de líquidos como puras ou peletes de KBr e as absorções são apresentados em cm

-1. de ressonância magnética (RMN) nuclear foram registados em 300 (Bruker) e Espectrómetros de 500 MHz (Varian) em solventes apropriados utilizando tetrametil-silano (TMS) como um padrão interno ou os sinais de solventes como padrões secundários e os desvios químicos são apresentados em escalas ô. As multiplicidades dos sinais de RMN são designados como s (singuleto), d (dupleto), t (tripleto), q (quarteto), br (largo), m (multipleto, para linhas não resolvidos), etc.

13C RMN foram registada em 75 MHz espectrómetro. Os espectros de massa de alta resolução (HRMS) foram obtidos usando ESI-espectrometria de massa QTOF. As rotações ópticas foram medidas com um polarímetro Roudolph Digipol 781 a 25 ° C. Comercialmente disponível solventes hexano, CH

2Cl

2, e EtOAc foram utilizados tal qual, sem purificação adicional. Natural α-noscapina foi adquirido de Sigma-Aldrich e é usado como tal. A abordagem sintética para a preparação de derivados de noscapina, 6a-J está ilustrado na Figura 3. Todos estes derivados foram sintetizados a partir nornoscapine 5a como material de partida, que por sua vez foi sintetizado a partir de noscapine.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (5a): A uma solução de noscapina α- naturais (2,0 g, 4,84 mmol) em diclorometano (15 mL) foi adicionado mCPBA (1,66 g, 9,7 mmol) em porções a 0 ° C. A mistura de reacção foi agitada durante 1 h à temperatura ambiente, diluída com diclorometano (20 ml), o excesso de peróxido foi extinta com 1M aq. solução de NaHSO

3 (15 mL), a camada orgânica foi então separada, seca com Na anidro

2SO

4, e concentrou-se. O resíduo em bruto foi dissolvido em metanol (20 mL), acidificou-se para pH 1,0 utilizando HCl 2 N, agitada durante 5 min e filtrou-se. O filtrado foi concentrado sob pressão reduzida, re-dissolvida em diclorometano (20 mL), secou-se com Na anidro

2SO

4, filtrou-se e concentrou-se. O sólido amarelo α- noscapina sal de N-oxide.HCl pálido assim obtido foi dissolvido em metanol (20 mL), foi adicionado FeSO

4.7H

2O (2,69 g, 9,68 mmol). Depois de se agitar a mistura à temperatura ambiente durante 12 h, a mistura reaccional foi concentrada e tratada com amoníaco aquoso a 25% para obter um pH 10, extraiu-se com diclorometano (3 x 10 mL), secou-se com anidro Na

2SO

4 , e evaporou-se sob pressão reduzida. O resíduo em bruto foi submetido a cromatografia em coluna de gel de trietilo sílica tratada amina e eluída com 3: 7 acetato de etilo: hexano (2: 3) gave(S)-6,7-dimethoxy-3-((

R

)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (5a) (0,92 g, 48%) como um sólido branco. pf 170 ° C; [Α]

D

25 = -105,6 (c = 1, metanol), Rendimento: 48% ν IR

max (cm

-1): 3360, 2942, 1759, 1624, 1501 , 1280, 1119, 1074, 1042, 1023, 932, 796, 679

1.HNMR (300 MHz, CDCl

3): δ 6,94 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,33 (s, 1H), 5,99-5,89 (m, 4H), 4,85 (d, J = 4,53 Hz, 1H), 4,09 (s, 3H), 4,07 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 2,69-2,58 (m , 1H), 2,54-2,42 (m, 1H), 2,36-2,23 (m, 1H), 2,22-2,09 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) δ 168,5, 152,1 , 148.3,147.8, 141.0, 140,4, 134,1, 131,9, 119,6, 118,3, 117,5, 116,9, 103,1, 100,7, 20,6, 62,2, 59,4, 56,6, 52,7, 39,5, 29,7 MS (ESI)

m

/

z

400 [M + H]

+; HRMS (ESI) calculada para C

21H

22NO

7: 400,1396, encontrado:.. 400,1401

Procedimento geral para a preparação de 6a-j

Para o solução de (

S

)-6,7-dimethoxy-3-((

R

)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one 5a (200 mg, 0,50 mmol) em acetona (5 mL), foi adicionado carbonato de potássio (1,10 mmol), iodeto de potássio (0,5 mmol) e brometo de alquilo (0,55 mmol) e agitou-se à temperatura ambiente (TA) durante 1 h. mistura de reacção em bruto foi filtrada, o filtrado foi evaporado sob vácuo, água (5 mL) e diclorometano (2 X 10 mL) foi adicionado, a camada orgânica foi separada, lavada com H

2O, secou-se sobre Na anidro

2SO

4 e filtrou-se. O resíduo assim obtido foi cromatografado sobre trietil amina coluna de gel de sílica tratada com eluição por hexano /acetato de etilo (70:30) para se obter 6a-j como produtos sólidos

(S) -3 -. ((

R

) -6-benzil-4-metoxi-5,6,7,8-tetra-hidro- [1,3] dioxolo [4,5-

g

] isoquinolin-5-il) – 6,7-dimethoxyisobenzofuran-1 (3H) -ona (6a): Rendimento: 93%; p.f. 64 ° C; [Α]

D

25 = 1,3 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3503, 2490, 2837, 1759, 1621, 1595, 1569, 1498, 1271, 1212, 1039, 891, 785, 695

1.HNMR (300 MHz, CDCl

3) 7,33-7,15 (m, 5H), 6,98 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,33 (s, 1H), 6,17 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,94 ( s, 2H), 5,66 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,62 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,15-4,06 (m, 4H), 4,02 (s, 3H), 3,86 (s, 3H ), 3,66 (d, J = 13,21 Hz, 1H), 2,51-2,36 (m, 2H), 2,35-2,15 (m, 1H), 2,06-1,91 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) δ 168,1, 152,2, 148,4, 147,8, 141,3, 140,5, 139,0, 133,9, 131,9, 128,7, 126,9, 119,8, 118,2, 117,7, 116,9, 102,4, 100,7, 81,7, 61,5, 59,6, 56,7, 59,6 , 62,3, 45,1, 26,5. MS (ESI)

m

/

z

490 [M+H]

+

5(S)-3-((R)-6-(4-bromobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6b): Rendimento: 95%; p.f. 76 ° C; [Α]

D

25 = -146,0 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3493, 2939, 2837, 1759, 1622, 1596, 1497, 1479, 1271, 1213, 1115, 1079, 971, 789, 711, 644, 479, 811 , 746

1.HNMR (300 MHz, CDCl

3) δ 7,37 (d, J = 8,30 Hz, 2H), 7,12 (d, J = 8,30 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,28 (s, 1H), 6,04 (bs, 1H), 5,94 (s, 2H), 5,59 (bs, 1H), 4,57 (d, J = 3,77 Hz, 1H,), 4,14-3,89 ( m, 7H), 3,85 (s, 3H), 3,57 (d, 1H), 2,46-2,09 (m, 3H), 2,00-1,84 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) ô 168,1, 152,2, 148,5, 147,8, 141,0, 140,4, 138,0, 133,9, 131,8, 131,2, 130,4, 120,6, 119,8, 118,1, 117,7, 116,6, 102,4, 100,7, 81,5, 62,3, 61,0, 59,4, 59,3, 56,7 , 45,3, 26.6.MS (ESI)

m

/

z

568 [m + H]

+. HRMS (ESI) calculada para C

28H

27NO

7: 568,0970, encontrado: 568.0946.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(4-nitrobenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (6c): Rendimento: 94%; pf 154 ° C; [Α]

D

25 = 68,0 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3490, 3078, 2931, 2901, 2837, 1751, 1620, 1520, 1499, 1389, 1343, 1274, 1213, 1080, 972, 852, 733, 610

1.HNMR (300 MHz, CDCl

3) ô 8,13 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 7,40 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,93 (d, J = 8,30Hz, 1H), 6,30 (s, 1H), 6,01-5,92 (m, 3H), 5,62 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3.77Hz, 1H), 4,27 (d, J = 14,35 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,09 (s, 3H), 3,87 (s, 3H), 3,74 (d, J = 14,35 Hz, 1H), 2,44-2,28 (m, 2H), 2,23-2,13 (m, 1H), 2,00-1,85 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) δ 168,1, 152,3, 148,6, 147,8, 147,1, 147,0, 140,6, 140,3, 134,0, 131,7 , 129,0, 123,4, 119,9, 118,1, 117,7, 116,3, 102,4, 100,8, 81,4, 62,3, 61,4, 59,5, 59,4, 56,6, 46,0, 27,0. MS (ESI)

m

/

z

557 [M + H]

+; HRMS (ESI) calculada para C

28H

26N

2O

9na: 557,1536, encontrado: 557.1557.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(4-methoxybenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)isobenzofuran-1(3H)-one (6D): Rendimento: 92%; p.f. 66 ° C; [Α]

D

25 = 6,66 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3492, 2936, 2836, 1759, 1613, 1511, 1269, 1115, 1013, 970, 821, 713, 517 cm

-1 1.HNMR ( 300 MHz, CDCl

3) 7,15 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,92 (d, J = 8,12 Hz, 1H), 6,76 (d, J = 8,49 Hz, 2H), 6,28 (s, 1H ), 6,12 (d, J = 8,12 Hz, 1H), 5,93 (s, 2H), 5,58 (d, J = 3,58 Hz, 1H), 4,55 (d, J = 3,55 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H ), 4,03 (m, 4H), 3,85 (s, 3H), 3,76 (s, 3H), 3,55 (d, J = 12,84 Hz, 1H), 2,50-2,13 (m, 3H), 2,04-1,83 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) δ 168,1, 158,5, 152,1, 148,4, 147,7, 141,2, 140,5, 133,9, 131,7, 130,0, 119,7, 118,1, 117,8, 113,4, 116,6, 102,4 , 100,6, 81,5, 62,3, 60,7, 59,3, 59,2, 56,7, 55,1, 44,8, 26.2.MS (ESI)

m

/

z

520 [m + H]

+ ; HRMS (ESI) calculada para C

29H

29 NO

8NA: 542,1790, encontrado: 542.1817.

(S)-3-((R)-6-(3-chlorobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6E): Rendimento: 92%; p.f. 62 ° C; [Α]

D

25 = 36,0 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3395, 3022, 2925, 2849, 1728, 1603, 1486, 1302, 1261, 1186, 1058, 811, 747

1.HNMR (300 MHz, CDCl

3) õ 7,29-7,12 (m, 4H), 6,99 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,34 (s, 1H), 6,14 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s , 2H), 5,67 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3,77 Hz, 1H), 4,17-4,08 (m, 4H), 4,05 (s, 3H), 3,87 (s, 3H) , 3,63 (d, J = 13,59 Hz, 1H), 2,49-2,37 (m, 2H), 2,31-2,16 (m, 1H), 2,06-1,93 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) δ 168,1, 152,2, 148,5, 141,2, 140,9, 140,4, 133,9, 131,8, 129,4, 128,4, 127,0, 126,7, 119,7, 118,1, 117,7, 116,6, 102,3, 100,7, 81,7, 64,3, 62,4, 61,2, 59,5, 59,3, 56,6, 45,5, 26,8. MS (ESI)

m

/

z

524 [M+H]

+.

(S)-3-((

R

)-6-(3-bromobenzyl)-4-methoxy-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-5-yl)-6,7-dimethoxyisobenzofuran-1(3H)-one (6f): Rendimento: 97%; p.f. 65 ° C; [Α]

D

25 = 52,0 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3503, 2940, 2837, 1759, 1621, 1498, 1387, 1271, 1212, 1039, 891, 785, 695

1.HNMR: (300 MHz , CDCl

3) õ 7,40-7,30 (m, 2H), 7,24-7,09 (m, 2H), 6,99 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,34 (s, 1H), 6,15 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s, 2H), 5,66 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,60 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,17-4,06 (m, 4H), 4,04 (s , 3H) 3,87, (s, 3H), 3,63 (d, J = 13,78 Hz, 1H), 2,50-2,37 (m, 2H), 2,32-2,19 (m, 1H), 2,07-1,92 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) 168,1, 152,2, 148,5, 147,9, 141,5, 140,4, 134,0, 131,8, 131,4, 130,0, 129,7, 127,3, 122,2, 118,1, 117,7, 116,6, 102,4, 100,7 , 81,6, 81,1, 62,5, 61,1, 59,5, 59,3, 56,7, 45,4, 26,8. MS (ESI) m /z 568 [M+H]

+.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(3-methoxybenzyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g] isoquinolin-5-il) isobenzofurano-1 (3H) -ona (6 g): Rendimento: 94%; p.f. 60 ° C; [Α]

D

25 = -144,01 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3501, 2941, 2836, 1760, 1620, 1598, 1497, 1387, 1268, 1212, 1012, 933, 786, 693

1.HNMR (300 MHz, CDCl

3) õ 7,21-7,11 (t, 1H), 7,00-6,89 (m, 2H), 6,84-6,72 (m, 2H), 6,33 (s, 1H), 6,14 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (s, 2H), 5,67 (d, 4,53, 1H), 4,62 (d, J = 4,53 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,03 (s, 3H), 3,88-3,80 (m, 7H), 3,63 (d, J = 12,84 Hz, 1H), 2,51-2,33 (m, 2H), 2,33-2,16 (m, 1H), 2,03-1,87 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) δ 168,1, 159,6, 152,2, 148,4, 147,8, 141,2, 140,7, 140,5, 133,9, 131,9, 128,8, 120,9, 119,9, 118,2, 117,7, 116,8, 113,6, 113,0, 102,4, 100,7 , 81,5, 62,3, 61,6, 59,4, 59,3, 56,7, 55,2, 45,2, 26,4. MS (ESI) m /z 520 [M+H]

+.

(S)-6,7-dimethoxy-3-((R)-4-methoxy-6-(2-oxopropyl)-5,6,7,8-tetrahydro-[1,3]dioxolo[4,5-g] isoquinolin-5-il) isobenzofurano-1 (3H) -ona (6h): Rendimento: 98%; pf 179 ° C; [Α]

D

25 = -34,0 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3393, 2957, 2904, 2840, 1764, 1706, 1624, 1500, 1482, 1387, 1364, 1275, 1223, 1041, 1010, 941, 897, 828 , 710, 693, 538.cm

-1 1.HNMR (300 MHz, CDCl

3) 6,90 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,28 (s, 1H), 6,00-5,88 (m , 3H), 5,51 (d, J = 3,58 Hz, 1H), 4,61 (d, J = 3,58 Hz, 1H), 4,08 (s, 3H), 4,01 (s, 3H), 3,85 (s, 3H), 3,64 (d, J = 4,15 Hz, 2H), 2,50-2,39 (m, 2H), 2,37-2,29 (m, 1H), 2,09 (s, 3H), 1,91-1,76 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) δ 167,7, 153,2, 148,5, 140,3, 140,2, 131,8, 120,2, 118,0, 117,7, 116,8, 102,4, 100,7, 96,0, 81,8, 67,6, 62,1, 59,4, 59,0, 56,6, 47,3 , 29,6, 28,2, 27,2. MS (ESI)

m

/

z

456 [M + H]

+; HRMS (ESI) calculada para C

24h

25NO

8NA: 478,1477, encontrado: 478,1470

Metil. 2-((R)-5-((S)-4,5-dimethoxy-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)-4-methoxy-7,8-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-g]isoquinolin-6(5H)-yl)acetate (6i): Rendimento: 97%; pf 155 ° C; [Α]

D

25 = -66,6 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3488, 3006, 2947, 2919, 2851, 1755, 1627, 1590, 1484, 1387, 1265, 1214, 1085, 1017, 894, 789, 735, 696 , 546

1.HNMR (300 MHz, CDCl

3) δ 6,96 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 6,03 (d, J = 8,30 Hz, 1H), 5,95 (d, J = 3,21 Hz, 2H), 5,52 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,86 ​​(d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,10 (s, 3H), 4,04 (s, 3H), 3,86 (s, 3H), 3,80 (d, J = 15,86 Hz, 1H), 3,65 (s, 3H), 3,54 (d, J = 15,86 Hz, 1H), 2,81-2,53 (m, 2H), 2,40-2,23 (m, 1H), 1,94-1,74 (m, 1H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) δ 171,7, 167,8, 152,1, 148,3, 147,5, 140,2, 140,1, 134,2, 131,8, 120,1 , 117,9, 117,7, 117,3, 102,3, 100,7, 82,2, 62,1, 59,4, 58,2, 58,1, 56,6, 51,1, 47,3, 28.9.MS (ESI) m /z 494 [m + H]

+.

Ethyl 2-((R)-5-((S)-4,5-dimethoxy-3-oxo-1,3-dihydroisobenzofuran-1-yl)-4-methoxy-7,8-dihydro-[1,3]dioxolo[4,5-

g

]isoquinolin-6(5H)-yl)acetate (6j): Rendimento: 98%; p.f. 92 ° C; [Α]

D

25 = -174,68 (c = 1, diclorometano); IR ν

max (cm

-1): 3511, 2945, 2921, 2839, 1763, 1727, 1625, 1481, 1389, 1270, 1203, 1111, 1032, 931, 817, 790, 703, 614

1.HNMR (300 MHz, CDCl

3) δ 6,90 (d, J = 8,12 Hz, 1H), 6,27 (s, 1H), 6,01-5,82 (m, 3H), 5,44 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,84 (d, J = 3,96 Hz, 1H), 4,19-4,00 (m, 8H), 3,85 (s, 3H), 3,83 (d, 1H), 3,49 (d, J = 17,56 Hz , 1H), 2,75-2,54 (m, 2H), 2,38-2,20 (m, 1H), 1,91-1,71 (m, 1H), 1,24 (t, 3H)

13.CNMR (75 MHz, CDCl

3) ô 171,2, 167,7, 152,1, 148,3, 147,5, 140,3, 140,1, 134,2, 131,9, 120,2, 117,8, 117,7, 117,4, 102,3, 100,7, 96,0, 82,2, 62,2, 60,1, 59,4, 58,1, 56,6, 47,3, 29,0, 14,1. MS (ESI) m /z 486 [M + H]

+; HRMS (ESI) calculada para C

25H

27 NO

9na: 508,1583, encontrado:. 508,1578 dados

X-ray análise cristalográfica

raios-X para. 6h e 6i compostos foram recolhidos à temperatura ambiente utilizando um difractómetro Bruker CCD inteligente Apex com grafite monocromada radiação MoKα (λ = 0.71073Å) utilizando um método de varrimento ω [50]. parâmetros de rede preliminares e matrizes de orientação foram obtidos a partir de quatro conjuntos de quadros. Integração e dimensionamento dos dados intensidade foi realizado utilizando o programa SAINT. As estruturas de 6h e 6i foram resolvidos por métodos directos usando SHELXS97 e refinamento foi realizada por técnica de matriz completa dos mínimos quadrados utilizando a SHELXL97 [50]. Foram incluídos parâmetros de deslocamento anisotrópico para todos os átomos que não sejam hidrogénio. Todos os átomos de H ligados a C e N foram localizados em mapas Fourier diferença e foram geometricamente otimizado e permitiu que os átomos de equitação, com CH = 0,93-0,97 Å, NH = 0,86 Å, com U

iso (H) = 1.5U

EQ (C) para H ou metilo 1.2U

EQ (C, N). Os grupos metila foram autorizados a rodar, mas não a ponta de dados

Cristal por 6h:. C

24h

25NO

8,

M

= 455,45, placa incolor, 0,17 x 0,15 x 0,07 mm

3, ortorrômbico, grupo espacial

P Página 2

12

12

1 (No. 19),

a

= 8,7173 (12),

b

= 12,8144 (17),

c

= 19,436 (3) Å,

V

= 2171,2 (5)

3

Z

= 4,

D

c = 1,393 g /cm

3, F

000 = 960, CCD Área Detector, radiação MoKα, λ = 0,71073 Å,

T

= 294 (2) K, 2

θ

max = 50,0 °, 21015 reflexões recolhidas, 2200 original (R

int = 0,0227). GOOF final = 1,045,

R1

= 0,0279,

wR2

= 0,0774,

R

índices baseados em 2086 reflexões com I 2σ (I) (refinamento na F

2), 302 parâmetros, 0 apoios, μ

= 0,105 milímetros

-1. CCDC 914.991 contém dados cristalográficos suplementares para a estrutura. A elucidação detalhada da estrutura cristalina e análise serão publicados em outros lugares dados

Cristal para 6i:. C

24h

25NO

9,

M

= 471,45, agulha incolor , 0,18 0,12 0,08 milímetros

3, tetragonal, grupo espacial

P página 4

32

12 (No. 96),

a

=

b

= 11,6748 (4),

c

= 32,753 (2) um,

V

= 4464,3 (4) Å

3,

Z

= 8,

D

c = 1,403 g /cm

3, F

000 = 1984, o CCD Área Detector, radiação MoKα, λ = 0,71073 Å,

T

= 294 ( 2) K, 2

θ

max = 50,0 °, 43048 reflexões recolhidas, 2346 exclusivo (R

int = 0,0252). GOOF final = 1.051,

R1

= 0,0396,

wR2

= 0,1095,

R

índices baseados em 2198 reflexões com I 2σ (I) (refinamento na F

2), 311 parâmetros, 0 restrições,

μ

= 0,108 milímetros

-1. CCDC 914.990 contém dados cristalográficos suplementares para a estrutura. A elucidação detalhada da estrutura cristalina e análise serão publicados em outros lugares.

Tubulin purificação.

Tubulin desprovidas de proteínas associadas a microtúbulos (mapas) foi purificada a partir de cérebro de bovino por ciclos de polimerização em função da temperatura 0.072⟨

U

vdw

⟩−0.006⟨

U

elec

⟩−0.951⟨

U

cav

⟩. 0.7-5.6916a-5.997-62.8167.520.820-5.707–6b-6.918-60.2557.270.988-5.622–6c-6.087-63.6841.560.846-5.63991 ± 8.0-5.5186d-6.882-64.8535.950.865-5.708–6e-6.907-61.8579.0910.972-5.852–6f-7.252-62.6276.071.287-6.18938 ± 4.0-6.0366g-5.767-61.3464.560.445-5.227–6h-7.196-65.0855.791.033-6.003–6i-5.712-62.1241.140.723-5.40779 0.072⟨

U

vdw

⟩−0.006⟨

U

elec

⟩−0.951⟨

U

cav

⟩. hours

Sub-G

1

G

0/G

1

S

G

2/M

Sub-G

1

G

0/G

1

S

G

2/M

Sub-G

1

G

0/G

1

S

G

2/M

Noscapine0.2958.8510.2424.297.2419.484.1962.3830.6219.058.5337.365a0.2763.3712.9319.458.4613.474.0866.3741.5710.747.0839.256a1.4467.069.5320.178.1216.284.9463.1844.829.067.3937.726b0.7455.3912.1728.797.3719.424.1664.4243.1811.387.5335.846c0.8260.6611.4924.298.0820.724.8563.4936.7315.388.2738.416d0.5256.8212.2828.397.2722.734.6259.4145.388.297.8336.186e0.8762.5711.9323.158.1712.844.5768.4245.427.026.8338.526f1.0464.269.5122.479.4711.826.2967.4850.446.384.7237.296g0.6263.3212.9221.3710.8620.944.0862.2840.2912.768.0737.936h0.3561.1612.2925.0911.3712.255.9268.5848.737.196.2836.186i0.4657.4111.0827.1412.2519.574.6263.3840.1814.376.4337.156j0.3959.159.4724.358.2925.713.0966.1727.2422.168.6339.48Table

Informações de Apoio

Figura S1.