Abstract

Os hormônios, incluindo estrogênio e progesterona, e seus receptores desempenham um papel importante no desenvolvimento e progressão do carcinoma de ovário . De androgénio, o seu receptor e coativadores também têm sido implicados nesses processos. p44 /Mep50 /WDR77 foi identificada como uma subunidade do complexo methylosome e ultimamente caracterizado como um coactivator do receptor de esteróides que aumenta receptor de androgénio, bem como estrogénio actividade de transcrição mediada pelo receptor de uma maneira dependente do ligando. Nós previamente descrito expressão e função do p44 em cancros da próstata, testículos, e da mama distinta. Neste relatório, nós examinamos a expressão ea função da p44 no cancro do ovário. Em contraste com os achados na próstata e câncer testicular e semelhante ao câncer de mama, p44 mostra forte localização citoplasmática na superfície do ovário morfologicamente normais e epitélios trompa de Falópio, enquanto p44 nuclear é observado no carcinoma do ovário invasivo. Observou-se que a p44 pode funcionar como um coactivador de ambos receptor de androgénio (AR) e do receptor de estrogénio (RE) nas células do ovário. Além disso, a sobre-expressão de p44-nuclear localizada estimula a proliferação e invasão de células de cancro do ovário, na presença de estrogénio ou androgénio. Estes resultados sugerem fortemente que a p44 desempenha um papel na mediação dos efeitos de hormônios durante a tumorigênese ovário

Citation:. Ligr M, Patwa RR, Daniels G, Pan L, Wu X, Li Y, et al. (2011) Expressão e Função do receptor andrógeno coativador p44 /Mep50 /WDR77 no cancro do ovário. PLoS ONE 6 (10): e26250. doi: 10.1371 /journal.pone.0026250

editor: Ilya Ulasov, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 7 de março de 2011; Aceito: 23 de setembro de 2011; Publicado: October 13, 2011 |

Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Northwestern Memorial Hospital Dixon Fundo de Investigação translacional subvenção para JJW. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de ovário é a quinta maior causa de morte por câncer em mulheres, ea segunda neoplasia ginecológica mais mortal nos Estados Unidos [1]. contas de câncer epitelial de ovário para cerca de 3% do total de casos de câncer em mulheres. Instituto Nacional do Câncer estima que, em 2010, 21,880 mulheres seriam diagnosticados e 13.850 mulheres que morrem de câncer do ovário [2].

O câncer de ovário é um grupo de doenças heterogêneas e consiste de diferentes tipos histológicos, o que pode ser facilmente diferenciado pela avaliação histológica [3]. diretrizes clínicas atuais estabelecidos pela Organização Mundial da Saúde distinguir oito subtipos de tumores histológicos: o carcinoma papilar serosa (PSC), carcinoma endometrioid (EMC), carcinoma mucinoso (MUC), carcinoma de células claras (CCC), carcinoma de células transicionais (TCC), de células escamosas , epitelial mista, e indiferenciado, carcinoma seroso com exibindo o fenótipo mais maligno [4], [5]. análise gênica global de todo o genoma define ainda perfis de expressão distintos de diferentes tipos de câncer de ovário [6]. Diferentes tipos histológicos de câncer de ovário parece ser regulado por diferentes vias patogênicas [7]. A maioria EMC e PSC presente moderados a elevados níveis de ER [8], [9], [10] e de expressão AR [11], [12].

receptores de hormônios esteróides, como ER, receptor de progesterona ( PR), e AR, estão envolvidos no desenvolvimento dos cancros de órgãos endócrinos, incluindo o cancro do ovário [12], [13], [14]. Os estrogénios são conhecidos por serem reguladores de crescimento e de diferenciação nos ovários normais, assim como no desenvolvimento de carcinoma de ovário, mas o mecanismo desta regulação hormonal permanece ambígua. O estrogénio actua através de dois receptores nucleares, alfa do receptor de estrogénio (RctE) e beta do receptor de estrogénio (RpE) que se ligam a um elemento de resposta de estrogénio (ERE) na região promotora de genes alvo, regulando a sua actividade de transcrição [15]. Da mesma forma, AR é também um factor de transcrição activados por ligandos. A ligação de androgénio para os resultados AR em localização nuclear do complexo hormona-receptor em conjunto com coactivadores e maquinaria de transcrição basal. Uma vez que o núcleo em que então se liga a um elemento de resposta ao androgénio (ARE), que regula a expressão de genes alvo [16].

AR é um receptor de esteróides sexuais prevalente expresso em cancros do ovário. Oitenta e quatro por cento de tumores expressam AR, em oposição a somente 74% dos tumores que expressam ER e 41% expressando PR [17]. Há um maior risco de cancro do ovário em pós-menopausa, em que os andrógenos tempo são os principais esteróides secretados pelo ovário [18]. Alta expressão de PR está associada com bom prognóstico em análise multivariante para câncer de ovário [19]. No entanto, os resultados são controversos para a correlação destes três receptores, com prognóstico e taxa de sobrevivência em pacientes [12], [20].

p44 é uma proteína de 44 kDa AR-interagir, o que tem sido demonstrado que o aumento actividade transcricional AR. Ele contém 342 resíduos de aminoácidos e quatro repetições WD40 putativos [21]. Além disso, a p44 existe em um complexo com methylsome transferase arginina metil 5 (PMRT5), e é também uma subunidade da sobrevivência do neurónio motor (SMN) complexo [22]. Devido a fosforilação da subunidade a, o complexo SMN é activa no citoplasma, onde promove a montagem U snRNP [23]. A expressão e função da proteína p44 foram relatados em cancros da próstata, dos testículos, e da mama. Curiosamente, foi observada padrões distintos de expressão e função nestes órgãos reprodutivos [21], [24], [25]. Encontrámos localização intracelular distinto de p44 em benigna (como proteína nuclear) e maligno (como proteína citoplasmática) tecido da próstata. expressão nuclear de p44 inibe o crescimento do cancro da próstata, sob a influência de androgénio [21]. Em contraste, a p44 foi expressa como uma proteína citoplasmática no epitélio da mama benigno e como uma proteína nuclear no cancro da mama. P44 Nuclear promoveu o crescimento das células do cancro da mama na presença de estrogénio [21], [24]. Nossas descobertas indicam que as funções de p44 como um co-fator influenciando a tumorigênese órgão-específica em sexo tumores regulada por hormônios esteróides.

Neste estudo, nós examinamos a expressão da p44 em células de ovário humanos benignos e malignos. Descobrimos que a p44 foi expresso diferencialmente em diferentes tipos de cancros do ovário. Em endometrióide e cancros do ovário serosas, P44 foi expressa como uma proteína nuclear. No entanto, P44 foi expressa como uma proteína citoplasmática em ovariano benigno (OSE), trompa de Falópio (FT), e epitélio do endométrio (EM). Nossos dados também indicaram que AR e ER desempenham um papel na regulação da translocação nuclear-citoplasmática de p44 no cancro do ovário e, posteriormente, o crescimento de células cancerosas e invasão.

Resultados

Expressão e localização celular de AR coativador p44 no cancro do ovário humano: regulação potencial da localização por andrógeno e estrógeno

Para determinar se p44 está associada com cancro do ovário, examinamos a expressão da p44 em células de ovário benignos, endometrial e tecidos trompas de falópio e diferentes histotipos de carcinomas ovarianos por imunohistoquímica. Para determinar a localização celular de p44, a expressão de p44 no citoplasma e os núcleos foram semi-quantitativamente avaliada separadamente (ver Materiais e Métodos).

p44 era imunorreactivo em ambos citoplasma e núcleo. Em tecidos normais, incluindo FT, EM, e OSE, houve um nível mais elevado de p44 imunorreactiva no citoplasma do que nos núcleos (citoplasmáticos a relação núcleo era de aproximadamente 02:01, Figura 1B). Em todos os 5 tipos de carcinomas do ovário, incluindo MUC, CCC, EMC, limítrofe serosa (SBT), e PSC, houve um aumento de imunorreactividade nuclear para p44 em comparação com citoplasma (Figura 1A, Tabela 1), embora os níveis de p44 nuclear variada entre os diferentes tipos histológicos de câncer de ovário. SBT teve a maior imunorreatividade para p44 no núcleo e MUC teve a menor (Figura 1B, S1). análise de variância múltipla revelou que houve diferenças significativas de imunorreactividade p44 em núcleos entre benigna (FT: 0,89 ± 0,17; EM: 0,55 ± 0,15; OSE: 0,54 ± 0,14) e malignas (CCC: 1,64 ± 0,13; EMC: 1,71 ± 0,16; PSC: 2,06 ± 0,14; e SBT: 2,67 ± 0,17) epitélio (p 0,01). Teste t pareado revelou que houve diferença significativa de imunorreactividade p44 no par-wise núcleos entre a FT e PSC, OSE e PSC, EM e EMC, respectivamente (p 0,05). PSC, EMC e CCC carcinomas mostrou immunointensity semelhante de p44 no núcleo por análise de variância (p 0,05, Figura 1B, S1). Em contraste, não havia diferença mínima de imunorreactividade p44 citoplasmática para cada uma entre epitélios benignos e malignos (p 0,05, Figura 1B). Em geral, EMC, PSC, e tinha SBT expressão ER relativamente abundante e estes tumores apresentaram níveis relativamente mais elevados de imunorreactividade p44 em núcleos (Figura 1a, 1b, Figura S1). As conclusões da diferença na localização celular da p44 entre os tecidos normais e de cancro do ovário pode sugerir um papel da p44 como um mediador receptor de estrogênio na tumorigênese do câncer de ovário.

A. Exemplos de expressão p44 por imuno-histoquímica em 4 tipos histológicos diferentes de câncer de ovário e tuba normal Falópio e endométrio (ampliação 200x). B. A análise semiquantitativa da immunointensity p44 e sua localização celular em quatro tipos histológicos diferentes de cancro do ovário e das trompas de Falópio normal e endométrio. barras cinzentas escuras são p44 nuclear e acender barras cinzentas são p44 citoplasmática. Pequenas t-bares representam erro padrão. análise de mancha de Western de C. AR, RctE e RpE expressão em diferentes linhas celulares, incluindo T29, SKOV-3, OVCAR-3. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. A diluição do anticorpo primário usado para p44 era 1:5000, por AR 1:1000, por ERa e RpE 1:2000 e para β-actina 1:5000.

Para avaliar a relação de p44 com AR e ER no cancro do ovário, examinamos primeiro os níveis desses receptores em linhas celulares de ovário de expressão seleccionados. A análise por Western blot revelou que a expressão de p44 foi mais elevada em linhas celulares de cancro do ovário OVCAR-3 e SKOV-3 do que a linha de células benignas epiteliais da superfície do ovário (OSE) T29. Os níveis de expressão da p44 positivamente correlacionada com ERa /β e expressão de RA (Figura 1C). Em particular, verificou-se que a expressão ERa foi maior em SKOV-3 e, inversamente, RpE isoforma apresentaram os maiores níveis em OVCAR-3 cells.To determinar p44 localização celular e regulação dos estrogênios e androgênios em células OSE benignos e malignos, examinamos a localização de p44 em três condições diferentes de mídia: meio isento de hormonas e médio com níveis definidos de ambos os andrógenos ou estrogênio por microscopia de imunofluorescência. Como mostrado na Figura 2, as células T29 benignos tinham níveis mais elevados de p44 citoplasmático e, até certo ponto, da p44 nuclear em todas as três condições de meios. Em SKOV-3, p44 foi localizada predominantemente no núcleo em isento de hormonas, de androgénio (10 nM androgénio sintético R1881) e estrogénios (10 nM 17β-estradiol) meios (Figura 2). Em células OVCAR-3, p44 foi localizada em ambos o núcleo e citoplasma em meio isento de hormonas, e localizada para o núcleo na presença de quer de androgénio ou estrogénio (Figura 2).

p44 anticorpo primário e rodamina foi usado anticorpo secundário -conjugated policlonal de coelho. DAPI foi utilizado para corar os núcleos. (Ampliação: 400x)

funções AR coativador p44 tanto como AR e ER coativador em células de ovário

p44 é um coativador de ER AR e e tem expressão distinta em células da próstata e da mama linhas [21], [24]. Para determinar se as funções de p44 como um activador de transcrição em linhas celulares de cancro do ovário, foi realizado um ensaio in vivo utilizando o sistema de transcrição repórter da luciferase dupla. Nós transientemente transfectadas células T29 com vector expressando P44 e quer um par de vectores que expressam AR e um repórter de luciferase sob o controlo de quatro elementos de androgénio de resposta (Figura 3a), ou ERa, e um repórter de luciferase sob o controlo dos elementos de resposta de estrogénio (Figura 3B). Na presença de androgénio, da p44 activada transcrição conduzida por receptor de androgénio de forma dependente da dose, conduzindo a tanto como 2,6 vezes de aumento de actividade repórter em comparação com o controlo. De modo semelhante, na presença de estrogénios, dependentes de p44 de transcrição do receptor de estrogénio activado de uma forma dependente da dose: o sinal repórter aumentada tanto quanto 4,5 vezes em comparação com o controlo. Quando P44 foi expressa sozinha, na ausência de qualquer AR ou ER, foi observado qualquer efeito na actividade repórter, ambos na presença e na ausência de hormonas no meio (dados não mostrados), confirmando a activação da p44 através dos receptores de hormonas. Estes resultados indicaram que a p44 na verdade funciona como um coativador de ambos os receptores de andrógenos e de estrogênio nas células do ovário.

A. Os vectores contendo P44 e AR foram transfectados em células T29 em conjunto com um vector repórter contendo gene da luciferase sob o promotor de controlo contendo 4 elementos de resposta ao androgénio. B. Os vectores contendo P44 e ERa foram transfectados em células T29 em conjunto com o vector repórter do ER-luc. atividade Reporter foi expressa como unidades relativas.

AR coativador p44 promove o crescimento de células de câncer de ovário e invasão

Para dissecar o efeito do p44 na proliferação de células de cancro do ovário, primeiro transfectadas vetores retrovirais expressar NLS-p44 em células SKOV-3. NLS-p44 é construído com o sinal de localização nuclear (NLS) fundida na estrutura ao terminal-N de p44. As células SKOV-3 são incapazes de responder ao estrogênio activação [26], [27]. Depois de confirmar que o p44 transfectado foi expressa, procedeu-se analisar o estado proliferativo das células (Figura 4A). Em ambos os sem hormonas e suplementado com estrogénio meios de comunicação, a sobre-expressão de p44-NLS não teve nenhum efeito sobre o crescimento de células SKOV-3 (p 0,05). No entanto, na presença de androgénio, a sobre-expressão de p44-NLS levou a uma redução de aproximadamente 33% no crescimento celular (p 0,01). Diminuindo os níveis de p44 por tratamento das células SKOV-3 com o siRNA correspondente conduziu a resultados semelhantes. Enquanto em meios contendo androgénio o knockdown de p44 levou a -25% de redução da taxa de crescimento (p 0,05), e redução de -15% do crescimento das células em meio isento de hormonas (p 0,05), não foi estatisticamente significativa efeito do tratamento com ARNsi sobre o crescimento de células em meio contendo estrogénio (Figura 4C). Uma vez que o receptor de estrogénio nas células SKOV-3 não responde ao estrogênio, os resultados validados nossos métodos de estudo

A, B:. Skov-3 células (A) e OVCAR-3 células (B) foram transfectadas quer com pBabe-NLSp44 vector de sobre-expressão ou um vector de controlo, e cultivados em meio isento de hormonas, ou na presença de androgénio ou estrogénio. A sobre-expressão de p44 foi verificada por Western blot (amostras tomadas a cada dois dias) e as células foram contadas todos os dias. C, D: células SKOV-3 (C) e células OVCAR-3 (D) foram tratadas com siRNA p44 utilizando Hiperfect e cultivados em meio isento de hormonas, ou na presença de androgénio ou estrogénio. O tratamento de siARN foi repetido em dias alternados. A sobre-expressão e knockdown de p44 foi verificada por Western blot (amostras tomadas a cada dois dias) e as células foram contadas todos os dias.

Em contraste com a linha de células SKOV-3, as células OVCAR-3 é responsivo a estimulação do estrogênio [28]. Com efeito, quando as células OVCAR-3 foram cultivadas em meio suplementado com estrogénio ou androgénio (Figura 4B e D, triângulos abertos e quadrados), ambos mostraram proliferação aumentada em comparação com células cultivadas em meio isento de hormonas (55% e 40%, respectivamente ). Ao contrário da situação em células SKOV-3, observou-se um forte efeito positivo de sobre-expressão da p44 nuclear sobre o crescimento de células OVCAR-3 em meio suplementado murchar, quer de androgénio ou estrogénio. Na presença de androgénio, a sobre-expressão de p44-NLS resultou num aumento de 1,5 vezes na taxa de crescimento, e na presença de estrogénio a indução do crescimento observado foi 1,6 vezes. Não houve influência significativa do crescimento celular por sobre-expressão da p44 em meio isento de hormona (Figura 4B).

Também observamos uma forte, mas negativo, efeito do esgotamento de p44 em OVCAR-3 células usando siRNA confirmada na o nível de proteína por análise de western blot. Enquanto superexpressão de p44 não teve influência significativa sobre o crescimento em meio isento de hormonas, knock-down dos níveis de proteína p44 levou à redução de 25% da taxa de crescimento no meio isento de hormonas. Em meio suplementado com hormonas a redução do crescimento associada à depleção p44 apareceu ainda mais forte. Em meios de estrogénio, o esgotamento da p44 causou uma redução de 40% da taxa de crescimento de células de tumor, enquanto que na presença de androgénio esta diferença foi responsável por 33% (Figura 4D).

p44 ainda testados efeitos sobre a capacidade de invasão de células usando um

in vitro

ensaio de invasão Matrigel. Observamos aumento invasividade das células em meios suplementados com androgénio, em comparação com meio isento de hormonas. O tratamento de células com estrogénio não alterou o número de células que atravessam a membrana (Figura 5A). Quando overexpressed NLS-p44 nas células SKOV-3, não houve alteração na capacidade das células para invadir através da membrana de Matrigel, quer em meio isento de hormonas, ou meio suplementado com androgénio ou estrogénio. Para bloquear a expressão da p44 endógena, introduzimos siRNA p44 em células SKOV-3. Em meios carentes de hormonas, a depleção de p44 não afectou a invasão das células do tumor através de Matrigel, uma vez que não afectou a invasão do tumor no meio contendo estrogénio. Em meio suplementado com androgénio, a falta de expressão da p44 diminuiu significativamente a invasão de células até três vezes (Figura 5C)

A, B:. SKOV-3 de células (A) e OVCAR-3 células (B) foram transfectadas quer com pBabe-NLSp44 vector superexpressão ou um vetor de controle; C, D: células SKOV-3 (C) e células OVCAR-3 (D) foram tratadas com siRNA p44 utilizando Hiperfect e cultivados no meio isento de hormonas, ou na presença de androgénio ou estrogénio. A sobre-expressão e knockdown de p44 foi verificada por Western Blot (ver Figura 4). As células foram semeadas sobre as membranas de Matrigel em meio isento de hormonas. Androgênio ou estrogênio foram usados ​​como chemoatractants na câmara inferior.

Nós também testou o efeito do p44 na invasão em células OVCAR-3. Semelhante a SKOV-3 células, aumento ou diminuição da expressão da p44 não afectou a invasão de células em meio isento de hormona (Figura 5B, D). Em androgénio ou meio suplementado com estrogénio, mais de duas vezes de aumento de Matrigel invasão foi observado (Figura 5B). Consistentemente, knockdown de p44 em OVCAR-3 células resultou em uma redução drástica da capacidade de invasão no meio suplementado com hormonas.

Discussão

Os hormônios esteróides são fatores importantes no desenvolvimento e progressão de ovário Câncer. Os receptores de hormonas e seus co-fatores são essenciais para a ação hormonal. a maioria dos carcinomas de ovário, incluindo os tipos serosa e endometrióides, apresentam níveis variados de ER, PR, e de expressão AR [12], [27]. A expressão de receptores hormonais de esteróides sexuais e seus co-fatores no câncer de ovário fornecer os alvos para tratamentos anti-hormonais. Assim, é fundamental para caracterizar o papel dos hormônios sexuais e sua tumorigênese mediada pelo cofator no câncer de ovário. Tem sido relatado que a RA é um marcador importante no cancro do ovário [29], do cancro do ovário comportamento agressivo no entanto, os mecanismos moleculares para a AR associada [30], [31], [32], são ainda pouco compreendidos.

em nossos estudos anteriores, verificou-se que p44 AR coativador desempenha um papel importante em ambos os cancros da próstata e da mama, indicando envolvimento da via AR na tumorigênese desses órgãos endócrinos. Neste estudo, aplicou-se princípios semelhantes para determinar a contribuição de p44 para funções oncogénicas na tumorigénese do cancro do ovário, em relação ao androgénio ou estrogénio. Descobrimos que p44 citoplasmática é altamente expresso no ovário benigna, do endométrio, e as células epiteliais da superfície da trompa de Falópio. No entanto, em diferentes tipos de tumor, p44 tem padrões de expressão celular diferenciais, refletida por diferentes níveis de localizações citoplasmáticos e nucleares. P44 é significativamente sobre-expresso em carcinoma seroso de alto grau, carcinomas endometrióides, carcinoma de células claras, e tumores borderline serosos (Figura 1A). Em particular, a expressão da p44 nuclear é significativamente mais elevada em tecidos de cancro do ovário do que em suas contrapartes correspondentes benignos, apoiando o papel funcional de p44 nuclear na tumorigénese do cancro do ovário. Da mesma forma, a análise de Western Blot revelou níveis comparáveis ​​de p44 entre OVCAR-3 e SKOV-3 (Figura 1C), quando as células foram cultivadas em meio completo (com vermelho de fenol e não-carvão soro despojado), no entanto, em meio suplementado-androgénio, imunofluorescência revelou que p44 é expressa ao mais alto nível no núcleo (Figura 2). Vai ser de grande interesse para determinar em estudos futuros se os níveis de ER, AR e expressão p44 estão associadas com tipos histológicos específicos de cancro do ovário, o grau do tumor, estágios, e sobrevivência.

Para definir ainda mais o funcional funções de p44, nós investigamos p44 em linhas celulares OSE benignas e malignas na presença e na ausência de androgénio ou estrogénio. Utilizou-se linha celular epitelial da superfície do ovário imortalizada benigna T29 e duas linhas de células malignas do cancro do ovário SKOV-3 e OVCAR-3 neste estudo. Foi relatado que SKOV3 não responde ao estrogênio, enquanto as células OVCAR-3 são sensíveis à estimulação de estrogênio. Em acordo, descobrimos que o estrogénio não afectou a localização da p44, proliferação celular ou invasão nas células SKOV-3, enquanto estrogénio melhorado de localização nuclear p44, proliferação celular, invasão e em células OVCAR-3. Embora ambos RctE e RpE é expresso em SKOV 3-células (Figura 1C), SKOV-3, ausência de resposta ao estrogénio pode ser devido a uma mutação em ERa [27], indicando a função de p44 pode ser mediada por ERa, em vez do RpE.

P44 aumentou significativamente a proliferação maligna de células OSE e invasão na presença de androgénio ou estrogénio, indicando que a expressão de AR ou ER são necessárias para estimular a mitogénese p44 e a invasão (Figura 1C). -P44 mediada função tumorigênico parece ser diferente entre próstata e cancro do ovário. No cancro da próstata, p44 nuclear inibe a proliferação celular de um modo dependente de androgénio. Na linha celular de cancro do ovário OVCAR-3, p44 nuclear promove o crescimento celular. Em particular, é de notar que p44 nuclear promove a invasão em ambos os andrógenos e meios de comunicação estrogênio. Os resultados de câncer de ovário são semelhantes ao que foi observado no peito. No cancro da mama, p44 nuclear promove a proliferação de células de tumor de um modo dependente de estrogénio [24]. Embora nossas experiências knockdown mediado por siRNA demonstrado que o nosso anticorpo p44 especificamente reconhecido uma única espécie de proteína na próstata, mama, ovário e, não podemos excluir completamente a possibilidade de que altamente relacionado, mas proteínas funcionalmente distintas (por exemplo, variantes de splicing de p44) atuam como cofactores do receptor da hormona distintos em cada um destes tecidos. Com este pressuposto, os nossos resultados sugerem que p44 pode também actuar por meio de uma via funcional mediada por ER no tecido do ovário. Nuclear p44

Em resumo, os nossos dados indicam está envolvida na proliferação e invasão de cancro do ovário. Estes processos são regulados por andrógeno e estrógeno. p44 pode ser um alvo potencial para o tratamento de câncer de ovário.

Materiais e Métodos

A seleção dos casos, TMA e IHC

Os casos foram coletados após a cirurgia no Northwestern Memorial Hospital e foram obtidos Universidade de Nova York de 1996 a 2009. As aprovações de Institutional Research Board (IRB) de ambas as instituições (isentos). Um total de 105 casos de câncer de ovário foram coletadas para este estudo (Tabela 1). Todos os casos PSC e EMC foram recuperados do banco NYU tecido e todos os outros tipos de câncer de ovário, assim como tecidos normais de controle, foram obtidos a partir do banco de tecidos NWU. Isto incluiu diagnóstico histológico de alto grau de carcinoma seroso papilífero (PSC, N = 32), tumor limítrofe serosa (SBT, N = 9), carcinoma do ovário endometrioid (EMC, N = 34), carcinoma do ovário mucinoso (MUC, N = 15 ) e carcinoma de células claras de ovário (CCC, N = 15). tecidos normais de controlo utilizados neste estudo foram: 30 tubos normais de falópio (FT, os controles normais mais próximos para carcinoma seroso de alto grau), 20 endométrio normais (EM, os controles normais mais próximos para carcinoma endometrioid), e 28 ovários normais (OSE, ovário epitélios de superfície, como tecido de controlo geral).

Todos os carcinomas foram primário de ovário. tissue microarray (TMA) preparação foi descrita no nosso estudo anterior [33]. Em resumo, 0,6 e 1 mm núcleos de tecidos foram coletadas de cada caso de secções de tumor bem preservadas e de alta densidade TMA foram preparados em dois blocos de recepção.

A produção, purificação por afinidade e especificidade do p44 policlonal de coelho anticorpo utilizado ter sido descrito anteriormente [34]. soro pré-imune foi usado como controlo. A especificidade do anticorpo P44 foi confirmada por um ensaio de siRNA que apresentaram expressão da p44 reduzida interferência com ARN de p44 [21]. Os níveis relativos de expressão de p44 foram marcados semi-quantitativamente por combinação de immunointensity [0 (negativo), 1+ (fraca), 2+ (fraco), 3+ (moderada), e 4+ (forte) expressão] e immunopercentage ( 1, tal como 0-10%, 10-50%, como 2, 3, tal como 50-75%, e 4, tal como 75-100%)]. As análises estatísticas foram realizadas pelo teste t.

Cultura de células e ensaio de proliferação de células

As linhas de células SKOV-3 [35] e OVCAR-3 [28] foram obtidas a partir da American Type Culture Coleção. A linha ovariana benigna imortalizada de células epiteliais da superfície T29 [36], como previamente descrito em detalhe, foi mantida em meio MCDB105 e 199 (Sigma). As duas linhas de células de cancro do ovário SKOV-3 e OVCAR-3 foram cultivadas em meio 5a de McCoy (Invitrogen) e RPMI 1640 (Gibco), respectivamente, suplementado com 10% FBS e 1 U /ml de penicilina e 1 ug /ml de estreptomicina. Para medir a taxa de proliferação, 2 × 10

4 células foram semeadas em placas de 6 poços. Nos pontos de tempo apropriados, as células foram tratadas com 0,25% de tripsina e 0,38 mg /ml de EDTA (Gibco) e contadas utilizando um hemocitómetro (Reichert).

Western blot análise

análise de Western blot foi usado para verificar p44, expressão AR, ERa e ERP em meio completo, knockdown de p44 e superexpressão de plasmídeos p44 (pBabe vector e pBabeNLSp44) em linhas de células de ovário. As células foram cultivadas quer em placas de 10 cm, de 6 poços ou placas de 24 poços. O tampão de lise contendo inibidores de protease (Sigma) em relação 1:100 foi adicionada aos peletes para a ressuspensão. A concentração de proteína foi medida utilizando o ensaio de proteína Bio-Rad e a quantidade apropriada de proteína foi carregada para a electroforese sobre a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE). A proteína foi então transferida para uma membrana de nitrocelulose para análises de Western blot. As membranas foram bloqueadas durante 1 hora em 5% de leite em pó magro em solução salina tamponada com Tris e Tween 20 (20 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 150 mM e 0,1% de Tween 20). As manchas foram então incubadas com anticorpos criados contra a AR, ERa, RpE (Santa Cruz Biotechnology), p44 e β-actina durante 2 horas à temperatura ambiente, lavada com Tween salino tamponado com Tris 20 três vezes. Após as lavagens, as membranas foram incubadas durante 2 h com anticorpo conjugado com peroxidase de rábano secundário apropriado (GE Healthcare). As bandas de proteína foram detectadas usando o kit de quimioluminescência aumentada (GE Healthcare).

microscopia imunofluorescente

T29, SKOV-3, OVCAR-3 e as células foram cultivadas em duas densities- 3 × 10

4 e 1 × 10

4 por poço por três diferentes condições de mídia (sem hormônios, andrógeno e estrógeno) em lâminas de câmaras. As células foram primeiro lavadas três vezes em PBS e fixadas durante 20 min com 4% de paraformaldeído em PBS, à temperatura ambiente. Após a fixação, as células foram permeabilizadas com metanol e acetona (01:01) e incubado a -20 ° C durante 20 minutos. As células foram lavadas 3 vezes em PBS e bloqueadas durante 1 hora com uma solução de 5% de BSA em TBS-T. As células foram então incubadas com anticorpo primário p44 (1:250) durante 2 horas à temperatura ambiente. A seguir à incubação com o anticorpo primário, as células foram coradas com rodamina conjugada com anticorpo policlonal de coelho (1:500) (Abcam) durante 1 hora no escuro à temperatura ambiente. Para contra-coloração com DAPI foi aplicado (1:1000) e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 min no escuro. A localização intracelular de p44 foi então examinada usando Nikon Digital DXM1200 F microscópio com o programa Nikon-ACT.

RNA Interferência ensaio

Três siRNAs mais eficazes na redução do nível de proteína p44 nas células ovarianas foram reunidas em quantidades equimolares e usado em experiências subsequentes, em geral, a uma concentração de 100 nM (Tabela 2). Mexidos siRNA (Ambion) foi utilizado como um controlo.

As células foram cultivadas em placas de 6 cavidades até à confluência desejada em 2 ml de meio apropriado contendo soro sem antibióticos. 100 nM de ARNsi foi diluído em 423 ul de Opti-MEM meios (Gibco) sem soro, seguido por 75 ul de reagente de HiPerfect (Qiagen) e incubadas durante 10 minutos à temperatura ambiente para permitir a formação de complexos de transfecção. As células foram então incubadas com os complexos de transfecção nas condições normais durante 48 horas

A electroporação

– três plasmídeos. Vector pBabe, pBabeNLSp44 [21], e GFP (controlo) – foram transfectados para células utilizando electroporação. As células foram cultivadas em três condições – sem hormonas, andrógenos (10 nM), e estrogénio (10 nM). As células foram cultivadas até 80% de confluência. As células sedimentadas foram então ressuspensas em 100 ul de solução Nucleofactor (82 mL de solução de 18 ul de solução de suplemento) (Lonza) para cada reacção. Quatro ng de plasmídeo foi então combinado e suspensão de células /ADN foi transferida para cuvete de electroporação. Nucleofactor programa recomendado para cada linha celular pelo fabricante foi seleccionado e aplicado. Após a electroporação a cuvete foi removido e as células imediatamente transferido para 10 ml de meio com FCS correspondente e incubou-se durante 48 horas sob condições de crescimento normais.

Luciferase Assay

ensaio de transcrição repórter in vivo foi realizada usando o de repórter duplo de luciferase Assay System (Promega) de acordo com as instruções do fabricante. A saída de luz foi medida por Lumat LB9507 luminómetro (Berthold).