Abstract

ácido ursólico (UA), um ácido triterpen�de pentac�lico naturais carboxílico distribuídos em ervas medicinais, exerce efeitos antitumorais e está a emergir como um composto promissor para a prevenção e tratamento do câncer, mas os seus mecanismos especiais de consumo de ação em células cancerígenas do cólon permanece em grande parte desconhecido. Aqui, nós identificamos os mecanismos moleculares pelos quais UA inibiu a proliferação celular e apoptose induzida em câncer de cólon humano células SW480 e LoVo. O tratamento com UA conduziu a inibições significativas na viabilidade das células e formação de clones e alterações na morfologia celular e espalhamento. UA também suprimiu a migração de células do cancro do cólon através da inibição da MMP9 e upregulating expressão CDH1. Outros estudos mostraram que UA inibiram a fosforilação de proteínas de Akt e ERK. O pré-tratamento com um inibidor da Akt ou específico de ERK revogada consideravelmente a inibição da proliferação por UA. UA também significativamente inibido de células de cancro do cólon de COX-2 de expressão e a produção de PGE2. O pré-tratamento com um inibidor de COX-2 (celecoxib) anulou a proliferação celular induzida por UA. Além disso, descobrimos que UA efetivamente promoveu NF-kB e translocação p300 de núcleos de células para o citoplasma, e atenuou a acetilação mediada pelo p300 de NF-kB e CREB2. O pré-tratamento com um inibidor de P300 (roscovitina) anulou a proliferação celular induzida por UA, que é revertido por sobre-expressão de p300. Além disso, UA tratamento induziu apoptose de células de cancro do cólon, o aumento da clivagem da PARP, caspase-3 e 9, e trigged a libertação de citocromo c a partir do espaço inter-membrana mitocondrial em citosol. Estes resultados indicam que UA inibe a proliferação celular e induz a apoptose em células cancerígenas do cólon através da modulação simultânea das múltiplas vias de sinalização, tais como MMP9 /CDH1, Akt /ERK, a COX-2 /PGE2, P300 /NF-kB /CREB2, e citocromo C /caminhos caspase

Citation:. Wang J, Liu L, Qiu H, Zhang X, Guo W, Chen W, et al. (2013) ácido ursólico Simultaneamente Alvos múltiplas vias de sinalização para suprimir a proliferação e induzir a apoptose em células cancerígenas do cólon. PLoS ONE 8 (5): e63872. doi: 10.1371 /journal.pone.0063872

editor: Chunhong Yan, Albany Medical College, Estados Unidos da América

Recebido: 04 de janeiro de 2013; Aceito: 10 de abril de 2013; Publicado em: 30 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos da National Natural Science Foundation da China (81071687, 81272195), o Estado “Programa 863” da China (SS2012AA020403), a Fundação programas de doutoramento de Ministério da Educação da China (20110171110077), eo Laboratório de Estado-chave de Oncologia no sul da China. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam a filiação (s) de Wenlin Huang de “Guangzhou Duplo bioproduto Inc “. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

cólon e reto (câncer colorretal, CRC), o terceiro tipo de câncer mais comum em todo o mundo , tornou-se uma das principais causas de morte por cânceres [1]. Cirurgia, quimioterapia e radioterapia são os tratamentos primários e comuns para o câncer colorretal. Embora a quimioterapia é adjuvante da cirurgia, a taxa de cura do câncer colorretal ainda não foi ideal, especialmente para os pacientes fase posterior. A metástase e recorrência após a cirurgia ou a resistência à quimioterapia produzida normalmente leva à morte final. Assim, a estratégia de tratamento complementar e alternativa tornou-se necessário melhorar a taxa de sobrevivência de pacientes com câncer de cólon. Fitoterapia chinesa está se tornando cada vez mais popular em tratamentos de câncer combinados com terapia convencional devido à sua origem natural, baixa toxicidade e eficácia para prevenir e tratar o cancro, incluindo o cancro do cólon [2].

ácido ursólico (UA) , um ácido triterpenóides pentacíclicos carboxílico naturais extraídos de ervas medicinais e plantas comestíveis, exerce uma vasta gama de actividades biológicas, incluindo hepatoprotectora [3], anti-bacteriana [4], [5] antiviral e anti-inflamatório [6]. Além disso, tem sido implicada na prevenção e protecção contra os tumores [7]. A sua acção anti-tumoral é atribuída à sua capacidade para prevenir a tumorigénese [8], inibir a proliferação de células cancerosas, e induzir a apoptose de células de cancro [6], [9]. As vias de sinalização envolvidos em actividade UA pode ser diferente em diferentes linhas celulares de cancro, e vias de sinalização parciais pode ser regulado simultaneamente ou sucessivamente e em sinergia para contribuir para o tratamento de UC. No entanto, os mecanismos moleculares precisos de UA envolvidos na inibição da proliferação e indução de apoptose no cancro colo-rectal ainda não foram suficientemente claro.

A enzima ciclo-oxigenase-2 (COX-2), responsável pela catálise da conversão de araquidónico ácido a prostaglandinas e tromboxano a

2, é conhecido por estar envolvido em vários processos patofisiológicos, incluindo na inflamação e tumorigénese [10], [11]. A COX-2 não é detectável na maioria dos tecidos normais, mas é geralmente sobre-expresso em muitos pré-malignas, cancros humanos malignos e metastáticos, incluindo o cancro colo-rectal, com o seu produto a jusante da prostaglandina E2 (PGE2). A evidência crescente indicou os papéis-chave de COX-2 em carcinogênese e progressão do cancro são através da participação em iniciação do tumor, promovendo a manutenção e progressão tumoral, e incentivar tumor metástase [12], [13]. A inibição selectiva da actividade de COX-2 inverte carcinogénese do cancro colorectal e tem sido demonstrado que induzem a apoptose e inibir a proliferação e a angiogénese [14], [15]. Alguns dos seus inibidores até ter sido demonstrado ser potencialmente atractivos fármacos quimioterapêuticos no tratamento do cancro colorectal combinada com outros agentes quimioterapêuticos comuns [16], [17]. COX-2 é fortemente regulada ao nível da transcrição, através da ligação de transactivadores, tais como NF-kB, CREB2 e co-activadores, tais como p300 para os sítios correspondentes situados no seu promotor [18] – [21]. No entanto, se a UA desempenha o seu efeito anti-tumoral através de regulamentos da COX-2, NF-kB e sinalização p300 é ainda pouco compreendido no cancro colorectal humano, e as vias de sinalização subjacentes relacionados são ainda imperceptíveis.

Aqui, que avaliou o efeito da UA sobre a proliferação de células do cancro do cólon, migração e apoptose em células cancerígenas do cólon e analisada a sua regulamentação sobre as principais proteínas de algumas vias de sinalização envolvidas na proliferação celular, migração e apoptose. Os resultados mostraram os efeitos anti-proliferação, anti-imigração e pró-apoptóticos da UA em células cancerígenas do cólon foram mediados através da modulação simultânea de múltiplas vias de sinalização, incluindo MMP9 /CDH1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /NF -κB /CREB2 e citocromo c /vias dependentes de caspase. Nosso estudo não só descobre os mecanismos moleculares subjacentes à acção UA em células cancerígenas do cólon humano, mas também sugere o grande potencial da UA na prevenção do cancro colorectal humana e tratamento.

Resultados

UA celular inibido a proliferação e a formação de clones e celular induzida Morfologia Mudança

o primeiro analisada quantitativamente o efeito da UA sobre a proliferação celular em 48 horas após o tratamento em células SW480 e LoVo por um ensaio MTT. Tratamento com ai na dose de 10 uM para 60 uM viabilidade celular significativamente inibida de uma maneira dependente da concentração, resultando em cerca de 20% para uma inibição de 83% nas células SW480 e uma inibição de 5% para 55% nas células LoVo, respectivamente ( Fig. 1A). Nós também determinaram os efeitos da UA sobre clonogenicidade de células tumorais. UA formação de clones também marcadamente inibida de um modo dependente da dose (Fig. 1B), resultando numa inibição significativa da razão de formação de clones em ambas as células SW480 e LoVo (Fig. 1C).

cólon humano linha celular de cancro SW480 e LoVo e linhas de células normais e LO2 CCD841 foram tratados com UA, nas doses indicadas. Às 48 horas após o tratamento, a viabilidade celular foi determinada por um ensaio de MTT (A, E), e a formação de clones induzida por células de tumor foi analisada (B, C). As alterações na morfologia celular, espalhando e formação de bolhas nas células tratadas com ou sem UA (10 uM e 20 uM) durante 48 h e foram observadas células foram fotografadas usando um microscópio equipado com câmara digital (D). A viabilidade celular por cento ou clone razão de formação em cada grupo de tratamento foi calculado em relação a células de controlo tratadas com veículo DMSO. Os dados são apresentados como média ± DP de três experiências separadas. *,

P

. 0,05, diferenças significativas entre os grupos de tratamento e grupos de controle DMSO

A seguir, analisou as mudanças UA-mediados na morfologia celular e se espalhando em células SW480 e LoVo . O tratamento de células com DMSO, um controlo de veículo, formada uma camada de células, e foi observada mais espalhamento, filopodia e formação de bolhas. Em contraste, o tratamento UA causou uma redução acentuada de contacto célula-a-célula, e tinham menor espalhamento com menos formação de filopios em ambas as células SW480 e LoVo, e vesiculação da membrana induzida em células tratadas com UA (Fig. 1D).

também avaliamos o efeito da UA sobre a proliferação celular em linhagens de células normais CCD841 humana e LO2. O tratamento com UA nas doses ≤20 uM não inibir a viabilidade celular em ambas as linhas de células normais, demonstrando a especificidade potencial de AI na inibição da proliferação de células de tumor na dose de ≤20 uM.

UA MMP9 Targeted /CDH1 Sinalização para inibir Cell Migration

a seguir, analisou o efeito da UA sobre a migração celular, empregando um ensaio de zero. Consistente com os dados de proliferação celular e inibição clonogenicidade, o tratamento com UC em 5 uM a migração de células eficazmente inibida, tanto em células LoVo (Fig. 2a) e SW480. A parte da lacuna ou ferir espaço entre as camadas de células depois de fazer um arranhão foi ocupada completamente pelas células que migram após 56 h. Por outro lado, o espaço vazio das células não foi ocupada pelas células que migram tratados com UA (Fig. 2A).

(A), a migração celular foi analisado através de um ensaio de zero. células SW480 e LoVo foram cultivadas até à confluência completa. As monocamadas de células foram feridas com uma ponta de pipeta estéril, e lavou-se com meio para remover as células destacadas das placas. As células foram deixadas não tratadas ou tratadas com doses indicadas de ácido úrico. Após 56 h, foi observada a abertura da ferida e as células foram fotografadas. (B, C), SW480 células foram tratadas com UA, nas doses indicadas. Em 56 horas após o tratamento, a expressão de MMP9 (B) CDH1 ou (C) foi quantitativamente analisada por uma análise de qPCR em tempo real. *,

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. 0,05, diferenças significativas entre os grupos tratados com UA e os grupos tratados com DMSO

MMP9 e CDH1 são duas principais moléculas envolvidas na invasão celular e via relacionada com a migração de sinalização [22], [23]. A seguir, analisados ​​quantitativamente os efeitos de UA sobre a expressão de MMP9 e CDH1 por uma análise de qPCR em tempo real em células SW480. Como esperado, UA a 20 uM e 40 uM marcadamente suprimido o nível de ARNm do gene de MMP9 (Fig. 2B), enquanto que o tratamento UA conduziu a um aumento significativo da expressão de ARNm de CDH1 (Fig. 2C). Estes resultados indicam que UA desempenha um papel importante na supressão de migração e invasão através da modulação da sinalização MMP9 e CDH1.

UA inativada Akt e ERK sinalização para inibir a proliferação celular

O PI3K /Akt e MAPK vias de sinalização desempenham papéis críticos no controlo da proliferação celular e a tumorigénese. Para avaliar se UA é capaz de modular a via PI3K /Akt e MAPK de sinalização para levar à inibição da proliferação de células, foram examinados os efeitos de UA sobre a fosforilação de moléculas sinalizadoras nestas duas vias em células SW480 por análise de Western blot. O tratamento com 20 uM de UC em inibiu consideravelmente a expressão de proteína Akt fosforilada e mTOR, mas o aumento da expressão de PTEN fosforilada (Fig. 3A). Nós também detectada uma redução acentuada nas proteínas ERK fosforilada numa forma dependente da dose (Fig. 3B). Os níveis de expressão da proteína total da Akt, mTOR, PTEN (Fig. 3A) e ERK (Fig. 3B) não foram alteradas.

(A, B), SW480 células foram tratadas com 20 � ou em UA 40 uM durante 48 h. A expressão da PI3K fosforilada ou total, Akt, mTOR, PTEN, JNK, 2 proteínas /ERK1 foi detectado por Western blot. GAPDH foi usada como um controlo para a carga da amostra. (C, D), SW480 células foram tratadas com uma PI3K /inibidor da Akt-selectiva LY294002 (LY, 5 mM) (C) ou com uma U0126 inibidor de ERK-selectivo (20 uM) (D) durante 4 horas, e, em seguida, tratada UA com a 20? M. Às 48 horas após o tratamento, a viabilidade celular foi determinada por análise de MTT. A viabilidade celular por cento em cada grupo de tratamento foi calculada em relação às células tratadas com o veículo DMSO de controlo. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências separadas. *,

P Art 0,05, diferenças significativas entre os grupos de tratamento e grupos de controle

Para confirmar ainda mais o envolvimento das vias de sinalização Akt e ERK na inibição UA-mediada. proliferação celular, o próximo analisados ​​os efeitos do inibidor da Akt ou ERK-selectivo na inibição da proliferação UA-mediada em células SW480. O pré-tratamento de células com inibidores da via PI3K /Akt LY294002 (LY) a 5 uM (Fig. 3C) ou ERK Inibidor U0126 a 20 uM (Fig. 3D) inibiu a proliferação celular, e uma combinação de UC (20 uM) com estes inibidores aumentou ligeiramente a inibição da proliferação celular (Fig. 3C e 3D). No entanto, a adição de UA não alterou significativamente a inibição da proliferação nas células SW480 pré-tratados com o inibidor da Akt LY (Fig. 3C) ou U0126 inibidor de ERK (Fig. 3D), confirmando o papel da ai na regulação da sinalização de Akt e ERK.

UA Targeted COX-2 e PGE 2 de sinalização para inibir a proliferação celular

expressão de COX-2 tem sido demonstrado que regulam positivamente o EGFR, PI3K /Akt e a sinalização ERK, desse modo, induzir a proliferação de células tumorais, e a migração invasão [24], [25]. Para determinar se a inibição UA-mediada de proliferação celular é mediado através da modulação da sinalização de COX-2 em células de cancro do cólon, foi avaliado o efeito de UA sobre a COX-2 de expressão em níveis de ARNm de proteína e por Western blot e RT-PCR. O tratamento com UA, nas doses de 20 uM e 40 uM inibiu drasticamente a expressão de COX-2 de proteína (Fig. 4A) e ARNm (Fig. 4B) em células SW480 e LoVo. A análise de densitometria quantitativa mostrou também que UA a 20 uM e 40 uM suprimiu significativamente ARNm de COX-2 em ambos os SW480 e células LoVo (Fig. 4C).

(A-D), as células SW480 e LoVo foram tratados com UA durante 48 h. A expressão da proteína COX-2 (A) e ARNm (B) foram analisadas por Western blot e RT-PCR, respectivamente. As densidades de ARNm de COX-2 e a proporção de COX-2 /GAPDH foram analisadas quantitativamente (C). A produção de PGE2 foi detectada por análise Elsia (D). GAPDH foi usada como controlo para a carga da amostra. (E), SW480 células foram tratados com celecoxib um inibidor de COX-2 selectivo (CB, 20? M) durante 4 horas, e, em seguida, tratada com UA a 20 uM. Às 48 horas após o tratamento, a viabilidade celular foi determinada por análise de MTT. Os dados são apresentados como a média ± DP de três experiências separadas. *,

P

. 0,05, diferenças significativas entre os grupos de tratamento e grupos de controle

PGE2 é um produto derivado da COX-2, e é sintetizado através da ciclooxigenase e prostaglandina vias sintase. Nós tratada células SW480 e LoVo com UA a 20 mM e determinou o efeito da UA sobre a produção de PGE2. Os resultados mostraram que o tratamento UA reduziu significativamente a produção de PGE2 em células (Fig. 4D).

Para confirmar ainda que a inibição mediada por UA de proliferação celular é através da regulação da COX-2 de sinalização em células cancerígenas do cólon, que pré-tratado com células SW480 celecoxib (CB, 10 mM), um inibidor de COX-2 selectivo, e testado o efeito da ai na inibição mediada por celecoxib de proliferação celular. Como mostrado na Fig. 4E, o pré-tratamento com celecoxib (CB) a viabilidade celular consideravelmente inibido, enquanto que a UA 20 uM não alterou significativamente a inibição mediada por celecoxib. Estes resultados mostraram que a inibição da proliferação de células do cancro do cólon por UA pode ser também parcialmente mediado através da inibição da sinalização da COX-2.

UA Induzida translocação de NF-kB e de p300 celular para o citoplasma Núcleos

a expressão da COX-2 é regulada pela interacção de translocação e transactivador de NF-kB e p300 coactivador em núcleos de células de tumor. Nós próxima realizados teste de imunofluorescência para avaliar o efeito da UA na localização nuclear e interação do NF-kB e p300 em células cancerígenas do cólon SW480 e LoVo. Detectamos a translocação constitutiva de p50 e p65 de NF-kB e p300 para núcleos celulares (Fig. 5A e 5B) e a co-localização de p65 com p50 (Fig. 5a) ou p300 (Fig. 5B) em ambos SW480 e LoVo células. O tratamento com 20 uM em UA e 40 uM induzidas a translocação de NF-kB (Fig. 5A) e p300 (Fig. 5B) de núcleos celulares para o citoplasma. Os resultados indicam que UA alvo o NF-kB e de sinalização P300, promovendo a sua translocação de núcleos celulares para o citoplasma em células cancerígenas do cólon. Células

Humano SW480 e LoVo cultivadas em lâminas de câmaras foram tratados com UC. Às 48 horas após o tratamento, a localização sub-celular de p50, p65 e p300 e a co-localização de p65 com p50 (A) ou (B) p300 foram examinados por análise de microscopia confocal com um microscópio confocal. Mais de 100 células foram inspeccionadas por experiência, e as células com morfologia típica foram apresentados.

UA alvejado Sinalização p300 para inibir NF-kB /CREB-2 acetilação e proliferação celular

A acetilação mediada pelo p300 de transactivadores e a sua ligação ao gene da COX-2 promover desempenham um papel crucial na expressão de COX-2. A seguir, determinou o efeito da UA na acetilação mediada pelo p300 de transactivadores NF-kB e CREB2 em células SW480 câncer de cólon. O tratamento com UA a 20 uM em células SW480 transfectadas com p300 inibiu marcadamente os níveis acetilada de p50 /p65 e CREB-2 proteínas (Fig. 6A), ao passo que a expressão destas proteínas não se alterou (Fig. 6B).

(a, B), SW480 células foram transfectadas com FLAG-P300 durante 24 h e depois tratou-se com ai durante 48 h. Os extractos nucleares foram preparados e p50, p65 e CREB2 foram imunoprecipitados com um anticorpo acetil-lisina. As proteínas acetilados (A) e a expressão da proteína (B) de p50, p65 ou CREB2 foram analisados ​​por Western blot. (C, D), SW480 células foram pré-tratadas com um inibidor de P300 roscovitina-selectivo (Rosc, 20 mM) (C), ou transf ectadas com um vector expressando P300 (D) durante 8 horas, e depois tratou-se com AI. Em 40 horas após o tratamento, determinou-se a viabilidade celular. vector vazio (EV) foi utilizado um controlo de transfeco. Cada barra representa a média ± DP de três experiências. *,

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. 0,05, diferenças significativas entre os grupos de tratamento e grupos de controle

Para verificar o papel da UA na regulação da sinalização p300 em células cancerígenas do cólon, nós pré-tratados com roscovitina, um inibidor de P300 (Fig. 6C), ou transf ectadas com um vector expressando P300 em células SW480 (Fig. 6D), e os efeitos da roscovitina sobre UA ou proliferação celular mediada pelo p300 foram analisados. O tratamento de células com roscovitina (Rosc, 20 uM) inibiu significativamente a viabilidade celular, enquanto que em 20 UA uM não alterou significativamente a inibição mediada por roscovitina (Fig. 6C). Por outro lado, p300 superexpressão inverteu significativamente a inibição UA-mediada em células SW480, por comparação com a transfecção com um vector vazio (VE) (Fig. 6D). Estes resultados demonstram que o P300 é um alvo importante da UC e que a inibição induzida pela UA da proliferação de células é mediado, pelo menos em parte, através da via de sinalização de p300 nas células de cancro do cólon.

UA Targeted citocromo c /caspase Sinalização para induzir apoptose celular

Nós também analisou o efeito da UA na apoptose celular em células cancerígenas do cólon por um ensaio FACS com base em coloração anexina-V às 48 h após o tratamento. O tratamento de células com AI em 20 uM e 40 uM conduziu a uma indução dependente da dose de células apoptóticas positivas (Fig. 7A), que conduz a uma indução de 6,3% a 14,2% em células SW480 e 2,8% para a indução de 53,4% em LoVo células (Fig. 7B). A activação de caspases a jusante é um acontecimento importante na via apoptótica. A seguir, determinado se a apoptose induzida por UA está relacionado com o aumento da activação da via da caspase em células SW480. Os efeitos da UA sobre a expressão das proteínas clivadas de três principais proteínas relacionadas com a apoptose: PARP, caspase-3 e caspase-9, foram detectados às 48 horas após o tratamento por análise de Western blot. Como mostrado na Fig. 7C, o tratamento com UA a 20 uM e 40 uM resultou num aumento acentuado da PARP clivada, caspase-3 e caspase-9 proteínas, sugerindo que UA pode funcionar como um importante e específica mediador para facilitar a activação da cascata de caspase.

células SW480 e LoVo foram tratados com UA (20 mM e 40 mM). Às 48 horas após o tratamento, o apoptotsis foi determinada por uma análise de coloração FACS com base nas AnnexinV-FITC (A, B). Os níveis de caspase-3, caspase-9 e PARP em células SW480 proteínas foram analisados ​​por Western blot (C). A libertação de citocromo c (cito-c) a partir do espaço inter-mitocondrial para o citosol foi determinada por análise de imagem de imunofluorescência (D). células SW480 transfectadas com ARNsi foram p300, durante 24 horas e seguido pelo tratamento com UC (20 uM). Às 48 horas após o tratamento, o apoptotsis foi determinada por análise FACS (E). A apoptose são representados por percentagens relativas de células em apoptose versus aquela em células tratadas com DMSO. *,

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. 0,05, diferenças significativas entre os grupos tratados com UA e os grupos de controlo

citocromo C (Cyto-C) é a molécula a montante da caspase via de apoptose dependente. Nós próxima realizados análise de imagem de imunofluorescência (IFI) para monitorar mudanças na localização subcelular de Cyto-c nas células SW480 e LoVo tratados com UA para determinar se UA poderia desencadear a liberação Cyto-c. O tratamento com UC (20 uM) de forma eficaz promovido a libertação de cito-C a partir do espaço inter-mitocondrial para o citosol (Fig. 7D). Estes resultados indicam que a libertação coordenada UA cito-C a partir do espaço inter-membrana mitocondrial e facilitou a activação de caspases a jusante no citosol.

Examinámos também o efeito de inibição de P300 sobre a apoptose induzida pela UA. As células SW480 foram transfectadas com um ARNsi específico P300 (Si-P300) e depois tratou-se com ai (20 uM), e o efeito de inibição de P300 sobre a apoptose mediada por UA foram analisados. Os resultados mostraram que o knockdown de expressão p300 por Si-p300 marcadamente aumentada a indução da apoptose mediada por UA (fig. 7E), confirmando o papel da sinalização P300 na regulação da apoptose induzida por UA em células cancerígenas do cólon.

Discussão

neste estudo, foi analisada a resposta das células cancerígenas do cólon humano ao tratamento UA. UA inibiu significativamente a proliferação celular, migração e apoptose induzida de uma maneira dependente da dose. Nós mostramos que UA induzida libertação de citocromo c, caspase ativação deste modo causado e apoptose. UA também regulada a expressão de genes e MMP9 CDH1 e inibiu a fosforilação de proteínas de Akt e ERK, levando a uma inactivação da migração celular e vias de sinalização relacionados com a proliferação. O nosso estudo mostrou que também UA suprimida expressão de COX-2 e a produção de PGE2. Além disso, mostrámos que a supressão UA-mediada de expressão e proliferação de células de COX-2 é mediada pela modulação simultânea dos P300, NF-kB, e a sinalização CREB2. UA inibida acetilação mediada pelo p300 de NF-kB e CREB2, e também promoveu a translocação de NF-kB p65 e p300 de núcleos celulares para o citoplasma. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que demonstrou que a UA tem como alvo simultaneamente as múltiplas vias de sinalização para inibir a proliferação de células de câncer de cólon e induzir a apoptose

UA tem sido intensamente estudada no passado.; essencialmente como um composto anti-cancro e para as suas propriedades protectoras cardiovasculares. A controvérsia de relatórios sugerem efeitos anti-angiogénicos e citotóxicos da UA de um lado e efeitos protetores cardiovasculares e endoteliais do outro lado. Atualmente, não há evidências suficientes para recomendar uma dose humana ideal. Estudos em animais sugerem o uso de benefícios entre 0,05-0,2% da dieta rato como UA. Assumindo uma gama de 10-40 mg /kg de peso corporal, os benefícios em estudos com ratos associados com UA são praticamente iguais para uma dose humana de 1,6-6,4 mg /kg de peso corporal (110-440 mg para uma pessoa de 150 libras).

Os efeitos colaterais da UA de incluem principalmente dois aspectos: a fertilidade masculina e danos ao DNA. estudo anterior revelou que UA tem o potencial de inibição da motilidade do esperma e podem servir como um contraceptivo vaginal tópica [24], [25]. Especificamente, ele faz com que quebra das pontes entre as células que estão prestes a ser esperma, e as células danificadas, em seguida, recolher para formar symplasts nos túbulos seminíferos que estão associados com a infertilidade masculina. UA como um anti-angiogese, anti-cancro e aplicadas localmente droga cardiovascular pode ser útil. No entanto, a actividade de danificação de ADN de AI, também pode constituir um problema sério. UA foi capaz de induzir a morte celular em células endoteliais, quando excedeu a concentração de 12,5 | iM [26].

A expressão de COX-2 desempenha um papel chave em cancros humanos. COX-2 e a produção de PGE2 foram mostrados para regular positivamente a via PI3K /Akt e a sinalização ERK, a angiogénese induzida deste modo, a proliferação celular, migração e invasão [27], [28]. Inibição da COX-2 pode resultar na supressão do crescimento celular e apoptose e induzir a transição epitelial-mesenquimal [29] – [32]. No entanto, o mecanismo pelo qual a COX-2 é altamente expressa na tumorigénese não é completamente compreendido. COX-2 regulação da transcrição foi extensivamente caracterizada [33] – [35]. P300 tem sido demonstrado ser essencial para a expressão de COX-2 e exerce um efeito global sobre a COX-2 estrutura da cromatina promotor para aumentar a ligação de transactivadores [20], [21]. P300 é expressa em abundância em células cancerosas e a sobre-expressão de p300 aumenta de COX-2 de activação da transcrição [36], [37]. Ele serve como um coactivador de transcrição para colmatar as transactivadores-bound promotor com factores de transcrição na maquinaria de transcrição [20], [21]. P300 HAT acetila histonas abrindo assim a estrutura da cromatina e aumentando o acesso de elementos potenciadores para transactivadores. CHAPÉU P300 é também capaz de acetilação transactivadores, tais como NF-kB, assim, aumentar a ligação transactivador [21]. Consistente com os relatórios anteriores, o nosso presente estudo também mostrou que p300 desempenha um papel crucial na regulação do NF-kB e proliferação acetilação e celular CREB2 em células cancerígenas do cólon humano. metas UA P300 sinalização para inibir a acetilação da NF-kB e CREB2, assim, inibir a proliferação celular. Demonstrou-se que p300 HAT é regulada por fosforilação p300 ou acetilação [38]. É possível que UA suprime fosforilação p300, p300 altera conformação HAT e atividade catalítica, e inibe a modificação pós-tradução de HAT p300, bloqueando assim a actividade HAT em células de câncer de cólon. Mais estudos são necessários para elucidar o mecanismo pelo qual a UA inibe a sinalização p300.

Estudos anteriores mostraram que UA induz a apoptose em cancros humanos [39]. No entanto, os mecanismos moleculares precisos e vias de sinalização, através da qual UA induz apoptose permanecem obscuros. Curiosamente, os nossos dados demonstram que a indução da apoptose por UA é principalmente através da activação mediada UA do circuito apoptótico dependente da caspase. O tratamento de células com UA provocou a liberação de citocromo c (Cyto-c) para o citosol, e depois estimulou a activação das caspases, apoptose induzida por ela.

Nós também descobrimos que UA alvo o Akt e ERK-dependente vias de sinalização para inibir a proliferação de células de câncer de cólon. A Akt fosforilada e ERK são os mediadores da proliferação celular e sobrevivência e a resposta clínica a tirosina cinase (TKI inibidores), e uma redução em Akt fosforilada e expressão de ERK é um acontecimento importante na sensibilização de células tumorais para o tratamento de TKI. UA inibiram a fosforilação de proteínas de Akt e ERK, resultando numa inactivação do crescimento celular e via de sinalização relacionados com a sobrevivência de Akt /ERK. Nossos resultados têm implicações importantes em explorar novas estratégias terapêuticas para o câncer de cólon.

Em resumo, demonstramos que UA inibiu a proliferação e migração celular e induziu apoptose em células cancerígenas do cólon através da modulação, simultaneamente, a MMP9 /CDH1, Akt /ERK , as vias de sinalização da COX-2 /PGE2, P300 /NF-kB /CREB2, e citocromo C /caspase-dependente (Fig. 8). Nossos resultados fornecem novos insights sobre os mecanismos moleculares de indução de inibição da proliferação e apoptose UA-mediada e sugerem que a UA pode ser um agente promissor para a prevenção e tratamento de câncer de cólon humano.

UA inibiu a proliferação e migração celular e induzida apoptose em células cancerígenas do cólon através da modulação, simultaneamente, a /CDH1, Akt /ERK, COX-2 /PGE2, p300 /NF-kB /CREB2 e citocromo c /vias de sinalização dependentes de caspase.

Materiais e Métodos

Cell Culture and Chemicals

cólon humano linhas celulares de cancro (SW480, LoVo) foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) e cultivadas em meio RPMI 1640 um meio suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor, 100 ug /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina, e mantidas numa incubadora com uma atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de CO

2 a 37 ° C . Em todas as experiências, as células com 60% de confluência foram testados. ácido ursólico (UA), celecoxib e roscovitina foram adquiridos a partir de (Sigma (St. Louis, MO). Uma solução de 100 mM de droga foi preparada em sulfóxido de dimetilo (DMSO), armazenado em pequenas alíquotas a -20 ° C e depois diluiu-se conforme necessárias em meio de cultura celular.

ensaio de viabilidade celular

a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT (Roche Diagnóstico, Indianapolis, IN). Resumidamente, as células semeadas em placas de 96 poços (3000 células /poço) foram tratados com UC em várias doses. a 48 horas após o tratamento, a viabilidade celular foi determinada.

Colonogenic Ensaio

células plaqueadas em placas de 6 poços foram tratadas com UC. após 24 h , as células foram lavadas com PBS e tripsinizadas. em seguida, as células foram semeadas a 100 células /poço em placas de 6 poços, e disperso uniformemente por agitação ligeiramente os pratos e incubadas a 37 ° C com 5% de CO2 durante 21 dias. O meio foi