Abstract

esforços de desenvolvimento de drogas atuais sobre câncer gástrico são dirigidos contra várias molecular metas que impulsionam o crescimento desta neoplasia. Intra-tumoral heterogeneidade biomarcador no entanto, comumente observado no câncer gástrico, poderia levar a viés de seleção de pacientes. MET, ATM, FGFR2, e HER2 foram perfilado em amostras de biópsia de câncer gástrico. Uma avaliação patológica inovadora foi realizada através de pontuação de biópsias individuais contra biópsias inteiros a partir de um único paciente para permitir a avaliação da heterogeneidade. Após isso, os riscos negativos falsos para cada biomarcador foram estimados

in silico

. 166 casos de câncer gástrico com múltiplas biópsias de pacientes individuais foram coletadas a partir de Xangai Renji Hospital. Seguindo critérios pré-estabelecidos, 56 ~ 78% dos casos apresentaram baixa, 15 ~ 35% apresentaram médio e 0 ~ 11% mostraram alta heterogeneidade dentro dos biomarcadores perfilados. Se 3 biópsias foram coletados a partir de um único paciente, o risco de falso negativo para a detecção dos biomarcadores estava perto de 5% (exceção para FGFR2: 12,2%). Quando 6 biópsias foram recolhidos, o risco de falso negativo se aproximou de 0%. Nosso estudo demonstra o benefício de amostragem biópsia múltipla quando se considera a estratégia personalizada biomarcador cuidados de saúde, e fornece um exemplo para enfrentar o desafio de heterogeneidade biomarcador intra-tumoral utilizando avaliação patológica alternativas e métodos estatísticos

Citation:. Ye P, Zhang M, Fan S, Zhang T, Fu H, Su X, et al. (2015) Intra-tumoral Heterogeneidade de HER2, FGFR2, cMET e ATM no câncer gástrico: Otimizando medicina personalizada através Innovative Patológico e Análise Estatística. PLoS ONE 10 (11): e0143207. doi: 10.1371 /journal.pone.0143207

editor: Daniele Generali, instituti Ospitalieri di Cremona, Itália

Recebido: 30 de julho de 2015; Aceito: 02 de novembro de 2015; Publicação: 20 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ye et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. AstraZeneca patrocinou o estudo. O financiador forneceu apoio sob a forma de salários para os autores [PY, MZ, SF, TZ, HF, XS, PG e XY] e desde instalações e recursos para concluir este estudo. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições”

Conflito de interesses:. Os autores afiliados a AstraZeneca são empregados em tempo integral e /ou partes interessadas da AstraZeneca. Este estudo foi patrocinado pela AstraZeneca. Isto não altera a adesão dos autores para PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento. Os autores declaram que não têm outros interesses concorrentes.

Introdução

O câncer gástrico (GC) é um dos cancros mais comuns no mundo, com cerca de metade de todos os casos que ocorrem no Leste da Ásia (principalmente China), e é a terceira principal causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo [1]. Embora a incidência está diminuindo, a maioria dos casos de GC são diagnosticados em estágio avançado e prognóstico da doença continua pobre [2]. A sobrevivência média para GC metastático é inferior a um ano, enquanto a taxa de sobrevida global em 5 anos é inferior a 7% [3].

heterogeneidade intra-tumoral é comumente observada em GC. Na década de 1980, de Aretxabala

et al

avaliadas 222 amostras de 37 casos de GC e encontrou uma mistura de amostras diplóides e aneuploides ou diferentes stemlines aneuploides no mesmo caso (DNA chamado conteúdo heterogeneidade) em 33% dos primário tumores [4]. Um estudo semelhante por Yonemura

et al

mostrou uma 69% a heterogeneidade do conteúdo de DNA em 65 amostras de GC ressecados [5]. Recentemente, Yang

et al

amostras GC avaliadas de 148 pacientes e encontraram uma taxa de heterogeneidade de 79,3% no receptor do fator de crescimento epitelial humana 2 (HER2) superexpressão da proteína e 44% em

HER2

amplificação do gene [6]. Consequentemente, a elevada heterogeneidade intra-tumoral observada em GC é susceptível de contribuir para a resistência ao tratamento e mais pobre prognóstico do paciente [7, 8], e, finalmente, representa um problema sem solução consideráveis ​​enfrentados pelos clínicos, patologistas e pesquisadores.

vários alvos moleculares apresentam atualmente tanto em tratamentos com drogas aprovadas ou terapêuticas promissoras submetidos desenvolvimento clínico em GC. HER2 desempenha papéis importantes na tumorigénese do cancro da mama, cancro do ovário e cancro gástrico [9] e trastuzumab, um anticorpo monoclonal contra o receptor HER2, foi aprovado para o tratamento de GC [10]. O gene do factor de transição epitelial-mesenquimal (TEM) codifica uma proteína que é o único receptor conhecido para o factor de crescimento de hepatócitos (HGF), o ligando [11].

TEM

amplificação do gene e a sobre-expressão de proteínas têm sido mostrados para levar a activação constante da via de sinalização de TEM, que contribui para o crescimento do tumor, angiogénese e metástase [12]. Vários inibidores Met estão actualmente em fase de ensaios clínicos de GC, incluindo Savolitinib (Fase 1 (NCT02252913) [13]) e AMG337 (Fase 2 (NCT02016534)). Da mesma forma, o receptor do factor de crescimento de fibroblastos 2 (FGFR2) também está implicada na proliferação de células, a diferenciação e a motilidade, e amplificação da

gene FGFR2

desempenha um importante papel na tumorigénese do GC, minimizando desta forma a sua atracção como o desenvolvimento de drogas -alvo [14-16]. Ataxia Telangiectasia mutada (ATM) é uma proteína-quinase que pertence à fosfatidilinositol 3 ‘cinase familiar (PI3K), e sob condições normais é activado em resposta ao DNA double-strand breaks [17]. deficiência de ATM está relacionada com uma elevada incidência de neoplasias malignas dos tecidos [18-20] e tumores deficientes em ATM-células são sensíveis a poli (ADP-ribose) polimerase-1 (PARP) inibição, um alvo potencial que tem sido proposta para o tratamento de GC em vários estudos anteriores [21-24]. Lynparza, o primeiro norte-americano e europeu-aprovado inibidor PARP alvo BRCA1 /2 do cancro do ovário mutante, está atualmente passando por um ensaio clínico de Fase III em GC (NCT01924533) e está empregando uma abordagem paciente selecção biomarcador utilizando a expressão ATM por IHC (publicação na imprensa) .

na era atual de desenvolvimento da droga molecularmente alvo, os biomarcadores são esperados para prever com precisão a resposta clínica [25]. heterogeneidade tumoral elevada no entanto, pode levar a um viés de detecção biomarcador se as amostras são obtidas a partir de uma região do tumor pequeno em vez de todo o tecido do tumor (por exemplo, amostras de ressecção cirúrgica são geralmente 2 cm x 2 centímetros única). Em contraste, as amostras de biopsia são geralmente obtidos a partir de diferentes regiões de todo o tumor e são susceptíveis de ser mais representativo do estado geral expressão de biomarcadores do paciente, argumentando quanto ao seu potencial para reduzir o impacto da heterogeneidade intra-tumoral em viés selecção paciente.

em nosso estudo, a fim de avaliar melhor a heterogeneidade intra-tumoral, foram empregados biópsia cirúrgica como a nossa estratégia de amostragem tumor. Além disso, foi realizada uma avaliação patológica inovadora por meio de pontuação de biópsias individuais contra biópsias inteiras de pacientes individuais. Aqui, nós também empregar-se métodos estatísticos para estimar os falsos riscos de detecção negativos ao analisar os números finitos de biópsias, de modo a entender a relação entre o número de biópsias e o risco de selecionar um paciente falso positivo para um tratamento particular ou inclusão num ensaio clínico .

Materiais e Métodos

As informações do paciente

amostras de biópsia arquivados GC foram coletados de 166 pacientes que receberam exame gastroscopia com várias biópsias de diferentes áreas de tumor de cada paciente entre 2007 e 2014 no Hospital Renji, Shanghai, China. prévio consentimento por escrito informado foi obtido de todos os pacientes e o protocolo do estudo foi aprovado pelo Renji Hospital Institutional Review Board. Todas as amostras foram analisadas por dois patologistas treinados para o diagnóstico GC e quarenta amostras foram excluídos do estudo devido à má qualidade do tecido.

Imuno-histoquímica (IHQ)

amostras fixadas em formalina e embebidos em parafina (FFPE) foram seccionadas em espessura que 4mm. Para a coloração de TEM, foi utilizado um anticorpo monoclonal de coelho anti-total de TEM (cMET SP44, Ventana Medical Systems, AZ, EUA) e o ensaio foi realizado em um Stainer automática (Descoberta XT, Ventana Medical Systems, AZ, EUA). ATM coloração foi realizada utilizando um anticorpo monoclonal de coelho anti-anticorpo ATM (ab32420, Abcam, MA, EUA) em um Autostainer (Thermo Scientific, MA, EUA). HER2 coloração foi realizada utilizando o kit de HercepTest (DAKO, Dinamarca) de acordo com as instruções do fabricante numa Stainer automática (Descoberta XT, Ventana Medical Systems, AZ, EUA).

hibridização fluorescente in situ (FISH)

O ensaio FISH de duas cores foi realizada como previamente descrito [26].

HER2 /CEP17

sondas foram adquiridos de Vysis (IL, EUA; Cat. # 30-171060).

TEM

e

FGFR2

sondas foram preparados por rotulagem BAC (CTD-2270N20 e RP11-62L18, respectivamente) DNA com Red-dUTP (Enzo Biochem, NY, EUA; Cat. # 02N23- 050),

CEP10

-Spectrum verde e

CEP7

-Spectrum sondas verdes foram comprados de Vysis (Cat. # 32-112010 e # 32-132007, respectivamente) e usados ​​como controles internos para

FGFR2

e

MET

sondas

avaliação de Patologia em biópsias

com base em H . e coloração, cada biópsia com células tumorais adequados (mais de 50 células tumorais) foi em primeiro lugar marcado por um patologista. Em seguida, o status biomarcador incluindo IHC e coloração FISH do TEM, ATM, FGFR2 e HER2 foram avaliados em cada biópsia. pontuações individuais para cada biomarcador foram dadas a cada biópsia (Fig 1).

Este é um exemplo de caso que mostra a pontuação individual dada a cada biópsia para cada biomarcador. Além disso, a figura também mostra a heterogeneidade do estado biomarcador entre diferentes biópsias no mesmo caso.

De acordo com o julgamento MetMAb no GC (NCT01662869), para a coloração MET IHC, uma biópsia mostrando IHC 3+ é definido como positivo; para MET FISH, a biópsia mostrando

MET

número gene de cópia média ≥ 5 é definido como positivo. Uma vez que o julgamento em curso para outro inibidor da MET, AZD6094 (NCT02449551), usos

MET

número gene de cópia média ≥ 4 como cortar o braço único tratamento agente em pacientes GC, dividimos ainda mais o grupo negativo FISH MET em dois subgrupos (

MET

gene cópia número médio ≥ 4 e 5, e

MET

gene número médio cópia 4). Para a coloração ATM IHC, a biópsia mostrando IHC 0 é definido como negativo de acordo com julgamento Olaparib (NCT01063517). Para FISH FGFR2, a biópsia mostrando

FGFR2

amplificação do gene (cópia número médio ≥ 6) é definida como positiva de acordo com ensaios de AZD4547 (NCT01457846) e dovitinib (NCT01719549). Para HER2, a biópsia mostrando HER2 IHC 3+ ou HER2 IHC 2+ mais

HER2

amplificação do gene é definido como positivo de acordo com julgamento ToGA (NCT01041404).

Para MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH e HER2, casos com

qualquer

das biópsias mostrando positiva são definidos como casos positivos. Para a coloração ATM IHC, casos com todas as biópsias mostram negativo são definidos como casos negativos

Heterogeneidade grau de avaliação

Após a revisão do patologista, o grau de heterogeneidade biomarcador foi determinada de acordo com os seguintes critérios:.

High heterogeneidade: 25% das biópsias com MET IHC 3+,

MET

amplificação do gene, ATM IHC 0,

FGFR2

amplificação do gene, ou positividade HER2

heterogeneidade Médio:. 25% ~ 50% das biópsias com MET IHC 3+,

MET

amplificação do gene, ATM IHC 0,

FGFR2

amplificação do gene, ou a expressão de HER2

Baixa heterogeneidade:. ≥50% biópsias com MET IHC 3+,

MET

amplificação do gene, ATM IHC 0,

FGFR2

amplificação do gene, ou a expressão de HER2.

Para MET IHC, MET peixe, peixe FGFR2 e expressão de HER2, foram calculados os percentuais médios de biópsias positivas em casos individuais entre os casos positivos. Para ATM IHC, a percentagem média de biópsias ATM IHC negativos num caso individual entre os casos com pelo menos um ATM biópsia negativa foi calculado. Os intervalos de confiança de 95% dos valores médios acima foram avaliados por bootstrapping.

False risco de detecção negativo avaliação

Para cada biomarcador e um número predefinido de biópsias

n

(0 n número máximo de biópsias de uma amostra), todos os cenários possíveis de escolher

n

biópsias de cada amostra e fazer uma determinação do status do biomarcador para a amostra com base no

n

biópsias escolhidos foram gerados computacionalmente.

com base nos cenários acima enumerados, os riscos de detecção de falsos negativos foram avaliados. Para MET IHC, MET FISH, FGFR2 FISH, e a expressão de HER2, o risco de detecção de falsos negativos com

n

biópsias de cada amostra foi definida como o número esperado de a relação entre o número de amostras positivas que têm negativo resultados de detecção com

n

biópsias e o número total de amostras positivas. Para IHC de ATM, o risco de detecção falso negativo com

N

biópsias de cada amostra foi definido como o valor esperado da relação entre o número de amostras não-negativos com todas as biópsias negativas com

N

biópsias de cada amostra, e o número total de ATM amostras não-negativos.

Todos os cálculos foram exata exceto ATM IHC com uma biópsia de cada amostra por causa do número extremamente grande de cenários possíveis. Para ATM IHC com uma biopsia de cada amostra, o risco de detecção falso negativo foi estimada tomando um subconjunto aleatório de 30 amostras não-negativos sem substituição de cada vez, calcular o risco de detecção falso negativo no subconjunto, repetindo o processo de 22.000 tempos e tendo uma média de os riscos de detecção de falso negativo das 22.000 subconjuntos aleatórios. Além disso, a 95% intervalo de confiança deste risco estimado foi relatado.

Resultados

Visão geral dos números de biópsia GC em amostras clínicas

Nesta coorte, o número de biópsia amostras de um único paciente variou de 1 a 9, com a mediana de ambas as biópsias positivas no total e (com células tumorais) a 4. os números de biópsia positiva foram ligeiramente menos do que o total do número de biopsia. Casos com 3 ~ 4 e 5 ~ 6 biópsias positivas representaram 47% e 25%, respectivamente, de todas as amostras coletadas (Fig 2).

(A) Distribuição do número total e positiva biópsia. Nesta coorte GC chinesa, o total de número de biópsias variam de 1 a 9, com uma mediana de 4. biópsia positiva (biópsia de tumor) é ligeiramente inferior ao número total de biópsia. (B) Distribuição do número biópsia positiva. Maioria dos números de biópsia cair em 3 ~ 4 (47%) e 5 ~ 6 (25%).

grau Heterogeneidade e avaliação falso negativo

Nos 18 casos MET IHC positivos (Fig 3A), 61% dos casos apresentaram baixa heterogeneidade, enquanto 33% apresentaram médio e 5,5% mostraram alta heterogeneidade. A percentagem média de biópsias MET positivos num caso individual entre esses 18 casos positivos foi de 65,78% (IC 95%: 52,14% -79,60%). O falso taxa de detecção negativo TEM foi estimado em cerca de 3,39%, com 4 biópsias e se aproximou de 0% na amostragem de 6 biópsias (Fig 4A).

distribuição de heterogeneidade de expressão da proteína MET (A),

MET

número de cópias do gene média (B), a expressão da proteína ATM (C),

FGFR2

amplificação (D), e a expressão de HER2 (e). AMP: amplificação. AVG:. Número médio cópia

Os riscos de detecção de falso negativo, juntamente com números diferentes de biópsia em MET IHC (A), MET FISH (B), ATM IHC (C), FGFR2 FISH (D) , e HER2 (e). Nota: * estimado por resampling, IC 95%:. 7,5% -20,94%

Nos 13 MET casos positivos de peixe (Fig 3B), 77% dos casos apresentaram baixa heterogeneidade, enquanto 15% mostrou médio e 8% apresentaram elevada heterogeneidade. A percentagem média de biópsias positivas MET peixes em um caso individual entre esses 13 casos positivos foi de 74,05% (IC 95%: 57,53% -89,10%). O falso taxa de detecção negativo MET FISH foi estimado em cerca de 3,30%, com 4 biópsias e se aproximou de 0% no momento da amostragem 7 biópsias (Fig 4b). Além disso, houve correlação significativa entre o escore MET IHC e os resultados PEIXES MET (p 0,01, κ = 0,62, teste exato de Fisher)

Nos 58 casos com pelo menos um ATM biópsia negativa (Fig 3C) , 62% dos casos apresentaram baixa heterogeneidade, enquanto 35% apresentaram médio e 3,6% mostraram alta heterogeneidade. A percentagem média de biópsias ATM IHC negativos num caso individual entre esses 58 casos foi 63,07% (IC 95%: 54,93% -71,39%). O falso taxa de detecção negativo ATM IHC foi estimado em cerca de 0,19%, com 4 biópsias, e aproximou-se de 0%, 5 biópsias (Fig 4C).

Nos casos positivos 9 FGFR2 peixes, 56% dos casos apresentaram baixa heterogeneidade, enquanto 33% apresentaram médio e 11% mostraram alta heterogeneidade (Fig 3D). A percentagem média de biópsias positivas FGFR2 peixes em um caso individual entre aquelas 9 casos positivos foi de 56,30% (IC 95%: 36,85% -76,85%). O FISH FGFR2 taxa de detecção de falso negativo foi estimado em cerca de 3,70%, com 4 biópsias e se aproximou de 0% com 6 biópsias (Fig 4D)

.

Nos 32 casos HER2 positivos, 78% dos casos apresentaram baixa heterogeneidade, enquanto 22% apresentaram heterogeneidade médio e nenhum dos casos mostraram alta heterogeneidade (Fig 3E). A percentagem média de biópsias HER2 positivos em um caso individual entre esses 32 casos positivos foi de 75,16% (IC 95%: 65,88% -85,11%). A taxa de detecção de falso negativo HER2 foi estimado em cerca de 0,21%, com 4 biópsias e aproximou-se de 0%, 5 biópsias (Fig 4E).

Discussão

Intra-tumoral biomarcador heterogeneidade tem sido um problema na seleção de pacientes para ensaios clínicos e, portanto, compreender a heterogeneidade do tumor é fundamental para a implementação bem sucedida de uma estratégia personalizada de saúde biomarcador (PHB). No entanto, alguns estudos até agora têm abordado este problema e não existe uma estratégia padronizada para medir o grau de heterogeneidade tumor. Neste estudo, fizemos uma nova abordagem ao marcar cada biópsia individual e cálculo do nível de heterogeneidade dentro de cada caso. Nossos resultados mostraram que altos níveis de heterogeneidade só foram encontrados em 0 ~ 11% do positivo (ou negativo para ATM) casos, enquanto a maioria dos casos positivos (56% ~ 78%) apresentaram baixa heterogeneidade, indicando um nível relativamente baixo de heterogeneidade para nossos biomarcadores seleccionados neste coorte de casos de GC.

Além disso, nós também realizadas avaliações negativas falsas para cada biomarcador para estimar as taxas de falsos negativos associados com a coleta de vários números de biópsias. Os resultados mostraram que, quando 3 ou mais biópsias foram recolhidos, os riscos negativos falsos estavam perto de 5% para todos os biomarcadores testados (7,14%, 5,16%, 0,86% e 1,41%, respectivamente, para MET IHC, MET FISH, ATM IHC e HER2 ). Este número (3-4 biópsias) é aproximadamente equivalente à média do número de biópsias colhidas na prática clínica para esta coorte e, como tal, indica o risco de falsos negativos relativamente baixo associado a estes biomarcadores em nossa coorte. Uma exceção que FGFR2 FISH mostrou uma taxa de falso negativo mais elevado (12,2% taxa de falsos negativos para 3 biópsias), pode ser devido ao tamanho da amostra limitada FGFR2-positivo (9 amostras positivas). Quando um total de 6 biópsias foram coletados a partir de um único paciente, o risco de falso negativo para MET, ATM, FGFR2 e HER2 abordado 0% nesta coorte. Estes resultados fornecem um exemplo de como o aumento do número de biópsia poderia ser usada para enfrentar o desafio de heterogeneidade biomarcador na implantação de abordagens de seleção de pacientes clínicos.

Considerando a importância da selecção precisa do paciente em ensaios clínicos, acreditamos firmemente que o adequado atendimento biomarcador heterogeneidade é fundamental para o sucesso. Por exemplo, MetMAb mostrou uma melhoria significativa tanto na sobrevida livre de progressão (2,9 vs. 1,5 meses) ea sobrevida global (12,6 vs. 3,8 meses) [27], em um ensaio de fase 2 (NCT01590719), no entanto, esta melhoria não transferir com sucesso para a configuração de fase 3 (NCT01662869). Notavelmente, MET superexpressão da proteína (por IHC) foi selecionado como um paciente critérios de selecção [28]. Apesar de ainda ser um tema de debate, é possível que a promessa de MetMAb na fase 2, mas o seu fracasso na fase 3 foi, pelo menos em parte, uma consequência da heterogeneidade do tumor, e uma incapacidade da estratégia de seleção de pacientes (IHC) para tratar de forma robusta a desafio de heterogeneidade intra-tumoral em GC.

Finalmente, temos também comparou o (ou taxa de negatividade para ATM) taxa de positividade dos biomarcadores detectados nesta coorte de amostras de biópsia com as amostras cirúrgicas de nossos estudos anteriores ( Tabela 1). Com a exceção de ATM, tanto biópsia e amostras cirúrgicas foram coletadas a partir do mesmo hospital local. Os resultados mostraram que, embora as taxas de positividade são mais elevados (para ATM, as taxas de negatividade são mais baixos) em amostras de biópsia, os resultados globais em amostras de biópsia foram semelhantes às amostras cirúrgicas. Este aumento na taxa de positividade (ou diminuição da taxa de negatividade para ATM) é provavelmente explicada pela detecção de casos positivos usando múltiplas biópsias que foram perdidas usando estratégias de amostragem anteriores (ie. Ressecções cirúrgicas).

O positivo /negativo taxa para cada biomarcador é comparável entre as amostras de biópsia neste estudo e as amostras cirúrgicas perfiladas nos nossos estudos anteriores, incluindo ATM [29] e outros biomarcadores [26]. Um ligeiro aumento nas taxas positivas para os marcadores (ou diminuição da taxa negativa para ATM) foi observada, o que poderia possivelmente ser explicado por meio da detecção de amostras positivas que foram previamente perdida quando da análise de amostras cirúrgicas devido à heterogeneidade intra-tumoral. Ambas as amostras de biópsia e cirúrgicos foram coletadas a partir do mesmo hospital local [26], com exceção de ATM [29].

No seu conjunto, este estudo abordou o desafio da heterogeneidade do tumor de um ângulo inovador usando biópsias como a abordagem de amostragem tumor e dando notas de biomarcadores individuais para cada biópsia. Nossos resultados mostram um nível relativamente baixo de heterogeneidade entre os biomarcadores analisados ​​neste coorte. No entanto, o grau de heterogeneidade dentro de outros grupos de pacientes podem ser diferentes e devem ser analisados ​​numa base de caso-a-caso. Além disso, os nossos resultados mostraram uma diminuição na taxa de detecção falso negativo correspondente a um aumento no número de biópsia para todos os biomarcadores aqui testadas, demonstrando o benefício da amostragem biópsia múltipla e que serve como um exemplo de endereçamento heterogeneidade intra-tumoral utilizando métodos estatísticos.

Reconhecimentos

Agradecemos a AstraZeneca por patrocinar este estudo.