Abstract

Fundo

cancro do ovário

epitelial (EOC) é morfologicamente ser heterogénea classificada como serosa , endometrioid, de células claras, ou mucinoso. análise genética molecular têm sugerido um papel para os genes supressores de tumores localizados no cromossoma 3p na serosa patogénese EOC. Nosso objetivo foi avaliar a expressão de

HIAL1

, localizado no cromossomo 3p21.3, nestes subtipos EOC, e investigar a sua correlação com a expressão de receptores de hormonas esteróides.

Metodologia /Principais Apreciação

determinou-se a expressão ARNm de

HIAL1

, receptor de estrogénio (ER) -α, RpE e o receptor de progesterona (PR) em amostras de tumores e linhas celulares EOC utilizando RT-PCR quantitativo. Também examinamos a expressão destes genes em um conjunto de dados microarray publicamente disponível. HIAL-1 foi medida a actividade da enzima em linhas celulares EOC e em amostras de plasma de pacientes. Descobrimos que

HIAL1

expressão de mRNA foi elevada em células claras e amostras de tecido mucinoso EOC, mas não em amostras serosa e endometrióides, ovários normais ou tumores benignos. Resultados semelhantes foram obtidos por duas técnicas diferentes e com coortes amostra de tecido a partir de dois instituições independentes. Concordante,

níveis e enzimática HIAL1

atividade mRNA estavam elevados apenas em linhas celulares EOC derivadas de células claras e subtipos de mucina. Nós também mostrou que

HIAL1

mRNA foi inversamente correlacionada com a de ERa especificamente em células claras e EOCs mucinoso. Além disso, a expressão ectópica de ERa numa linha celular de células claras EOC (ER e PR-negativo) induziu uma redução de 50% de

HIAL1

expressão do mRNA, apoiando um papel de ERa no gene

HIAL1

regulamento. Significativamente, HIAL-1 atividade também foi elevada no plasma de pacientes com esses subtipos EOC.

Conclusões /Significado

Este é o primeiro relatório que mostra altos HIAL-1 níveis em EOC e demonstrando

HIAL1

repressão gênica por ERa. Nossos resultados identificam hialuronidase-1 como um potencial alvo /biomarcador para EOCs celulares e mucinoso claras e especialmente em tumores com baixos níveis de ERa

Citation:. Yoffou PH, Edjekouane L, Meunier L, Tremblay A, Provencher DM, mes-Masson AM, et al. (2011) Subtipo elevada expressão específica de hialuronidase-1 (HIAL-1) em células epiteliais do cancro do ovário. PLoS ONE 6 (6): e20705. doi: 10.1371 /journal.pone.0020705

editor: Nai Sum Wong, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 15 de dezembro de 2010; Aceito: 08 de maio de 2011; Publicação: 10 de junho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Yoffou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pelo Conselho de Ciências e Pesquisa de Engenharia Natural do Canadá (concessão # 262142 a CE). Tumor bancário foi apoiado pelo Banque de tecidos et de données do Réseau de recherche sur le cancer do Fonds de la recherche en santé du Québec filiada à Rede Repository tumor canadense. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução câncer de ovário

epitelial (EOC) é a principal causa de morte por câncer ginecológico na maioria dos países ocidentais [1]. Devido ao seu crescimento assintomática ea falta de métodos de rastreio eficazes, cerca de 70% de todos os casos são diagnosticados em estágio avançado, com apenas melhorias modestas na sobrevivência ao longo dos últimos 40 anos [1]. Embora a maioria dos pacientes respondem à quimioterapia inicialmente, as taxas de recorrência são muito elevadas resultando na pior prognóstico geral observada nestes pacientes [2]. Além disso, EOCs são morfologicamente heterogénea, e diferentes subtipos histopatológicos têm características moleculares distintas e resposta ao tratamento diverso [3]. EOC pode ser classificada como serosa, endometrióide, células claras ou mucinoso, que correspondem aos diferentes tipos de epitélios presentes no tracto fêmea [4] reprodutiva. As diferenças na resposta à quimioterapia e os resultados dos pacientes provavelmente resultar da heterogeneidade molecular destas EOCs morfologicamente distintas [3]. Por exemplo,

TP53

mutações são frequentemente observadas em cânceres serosa e endometrióides, mas dificilmente são detectados em células claras e EOCs mucinoso [3]. Sabe-se também que a frequência da instabilidade cromossómica é maior em EOC serosa do que nos outros subtipos de [3].

EOC serosa, análise genética molecular têm sugerido um papel para os genes supressores de tumor localizado no braço curto do cromossomo 3 (3p) na patogênese da doença [5]. A análise do transcriptoma do cromossoma 3 genes identificados vários genes diferencialmente expressos em linhas celulares de tumores ovarianos EOC e quando comparado com as células epiteliais da superfície do ovário normal (nariz) [6], [7]. aberrações cromossômicas em 3p21.3 são freqüentemente encontrados em cancros do pulmão, renal e da mama, sugerindo que eles abrigam genes supressores de tumor [8]. Localizado no cromossoma 3p21.3 é um conjunto de genes, hialuronidase nomeados (

HIAL1

,

HYAL2

e

HYAL3

), que são o alvo mais frequente das deleções na câncer de pulmão [8].

hialuronidase de mamíferos (CE 3.2.1.35) são endo

N

-acetylhexosaminidases que hidrolisam o ácido hialurônico glicosaminoglicanos. Eles compreendem uma família de genes de 6-7 com a identidade de aproximadamente 40% entre si [9], [10]. Em seres humanos, eles estão agrupados em grupos de três em cromossomos 3p21.3 (

HIAL1

,

HYAL2

e

HYAL3

) e 7q31.3 (

HYAL4

,

PH20

/

SPAM1

e

HYALP1

), com

HYALP1

ser um pseudogene e

HYAL4

que codifica para uma enzima condroitinase [9], [11]. Por conseguinte, em seres humanos, existem quatro hialuronidases, Hyal-1, -2, -3 e PH20 /Spam1, sendo esta última principalmente expressos no tracto reprodutivo masculino e que tem um papel importante na fertilização [12]. Por outro lado, hialuronidases localizados no cromossoma 3 são expressos ubiquamente. HIAL-1 e HIAL-2 são os principais responsáveis ​​pela hialuronidases somáticas rotatividade hialuronano e são conhecidos por terem várias funções fisiológicas e patológicas [9], [13], tais como a cicatrização de feridas, inflamação e osteoartrite. Em contraste, Hyal-3 tenha sido descrita como sendo desprovido de actividade enzimática hialuronano [14] e o seu papel fisiológico ainda permanece a ser determinada.

No cancro do ovário, desequilíbrio alélica destes três genes (

HIAL1

,

HYAL2

e

HYAL3

) foi demonstrada em tecidos tumorais e do estroma [15]. Em particular,

HIAL-1 | mRNA expressão foi encontrado para ser significativamente reduzida em EOC serosa quando comparado com ovários normais [16], enquanto inalterada ou uma tendência para a diminuição da HIAL-1 atividade foi relatada em extratos de tecidos EOC [ ,,,0],16], [17]. De acordo com esta observação, a acumulação extracelular de ácido hialurônico é muitas vezes observada no estroma tumor de ovário e matriz pericelular, e está associada a um mau prognóstico da doença [17], [18]. Além disso, vários relatórios demonstraram interacções entre receptores de hialuronano e de membrana, tais como CD44, que promove a associação de CD44 com certas proteínas do citoesqueleto (por exemplo, anquirina, RhoGTPases, Cdc42) geração de eventos de sinalização específicos que promovem ovário adesão de células de cancro, migração e sobrevivência [ ,,,0],19]

em contraste, os níveis de hialuronano e HIAL-1 foram relatados para ser aumentada na bexiga, da próstata e cancros da cabeça e pescoço, e por estarem implicados na progressão tumoral e metástase [20] -. [ ,,,0],22]. Curiosamente, elevado hialuronano extracelular é encontrado principalmente no estroma do tumor, enquanto níveis elevados HIAL-1 são detectadas em tecidos de tumor, sugerindo uma conversa cruzada entre estes dois tipos de tecidos. Elevados níveis de expressão HIAL-1 também são encontradas no cancro da mama e glioblastomas, e estão correlacionadas com os tumores metastáticos [22], [23]. Curiosamente, receptor de estrogénio (ER) linhas de células de câncer de mama negativos, que tendem a ser mais agressivos, têm reforçado a atividade hialuronidase quando comparado com linhas celulares ER positivo [24]. Através de um mecanismo ainda desconhecido, HIAL-1 induz a transição do ciclo da célula e se regula os níveis de reguladores positivos da G2-M de transição (por exemplo, de cdc25C, ciclina B1, cdk10) na bexiga, próstata e linhas escamosas orais celulares de cancro [25] – [27]. HIAL-1 também aumenta a angiogénese, provavelmente através da geração de fragmentos de hialuronano de tamanhos distintos que possuem a capacidade para estimular a proliferação de células endoteliais e formação capilar [28].

Portanto, os níveis de expressão de hialuronidase pode variar dependendo do tipo de tumor e no seu comportamento agressivo. No presente trabalho foi realizado um estudo detalhado sobre a expressão de HIAL-1 em amostras de tecido de cancro do ovário representando quatro diferentes subtipos histopatológicos e apresentaram níveis elevados dessa enzima em EOCs celulares e mucinoso claras, mas não em seroso ou endometrioid. Nós também demonstrou que os níveis de

HIAL1

mRNA em células claras e EOCs mucinoso foram inversamente correlacionados com os de ERa. Significativamente, mostramos que a expressão ectópica de ERa induziu um decréscimo de 50% no

HIAL1

expressão de ARNm numa linha de células de EOC células claras. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório: i) demonstrando aumento HIAL-1 expressão em subtipos específicos EOC morfológicas, ii) mostrando uma correlação inversa entre

HIAL1 Comprar e hormônios esteróides em amostras de tecido, e iii) implicando

HIAL1

gene como um alvo ERa para a repressão do gene. Finalmente, mostrou um aumento de 2,1-2,8 vezes nos níveis plasmáticos desta enzima em pacientes com células claras e EOC mucinoso, mas não em pacientes com tumores ou serosas endometrióides, quando comparado com doentes com quistos benignos. Nossos resultados apresentam identificar HIAL-1 como um potencial biomarcador para a detecção destes dois subtipos EOC distintas.

Materiais e Métodos

amostras clínicas

amostras de tumores de tecido e EDTA plasma coletado foram obtidos, com o consentimento informado, de participantes submetidos a cirurgias realizadas no Centro Hospitalar de l’Université de Montréal (CHUM) Hôpital Notre-Dame. As políticas de coleta e uso de amostras de tecidos e sangue foram aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da CHUM. Só foram utilizados tumores de doentes sem tratamento prévio de quimioterapia. Histopatologia, grau e estágio dos tumores foram distribuídos de acordo com a Federação Internacional de Ginecologia e Obstetrícia (FIGO critérios). Como ovário normal tem pouco conteúdo epiteliais, tumores do ovário benignos serosas foram usadas como controlo. As informações relativas às amostras utilizadas no presente estudo está resumido na Tabela 1.

Linhas Celulares

As culturas primárias de epitélio de superfície do ovário células normais (nariz) foram derivados, como descrito anteriormente [ ,,,0],29], a partir de ovários de três participantes sem história prévia de câncer de ovário, após ooforectomia profilática na CHUM Hôpital Notre-Dame e consentimento informado. linhas celulares de EOC foram estabelecidas como previamente descrito [29] – [31], e foram derivados a partir de tumores serosos epiteliais do ovário (TOV81D, TOV2223, TOV1946) ou fluido de ascites (OV1946, OV866), a partir de um tumor do ovário endometrióide (TOV112D), uma carcinoma clara celular (TOV21G), e um câncer epitelial de ovário mucinoso (TOV2444). As células foram cultivadas em meio OSE (Wisent Inc., St-Bruno, QC, Canadá) contendo 2,5 ug /ml de anfotericina B e 50 ug /ml de gentamicina (ambos da Invitrogen, Burlington, ON, Canadá). O meio de cultura foi suplementado com 15% de soro fetal bovino (FBS, Invitrogen) para as culturas nariz e FBS a 10% para as linhas celulares de AOE.

quantitativo em tempo real de RT-PCR (Q-PCR)

O ARN total foi extraído com o reagente de Trizol (Invitrogen) a partir de amostras de tumor congeladas ou directamente a partir de células cultivadas para 80% de confluência, como descrito anteriormente [32]. a qualidade do RNA foi rotineiramente monitorizada por electroforese em gel de agarose e com o Bioanalyzer 2100, utilizando o kit RNA 6000 Nano LabChip (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha). A síntese de ADNc foi realizada de acordo com o protocolo do kit QuantiTect Transcrição Reversa (Qiagen Inc., Mississauga, ON, Canada) utilizando 1 jig de RNA total. A solução de ADNc obtido foi diluída dez vezes e alíquotas de 5 ul foram usados ​​em cada reacção de Q-PCR. amplificações quantitativas foram obtidas usando o Platinum® SYBR® verde Q-PCR Supermix UDG (Invitrogen) e o seguinte par de iniciadores: 5′-AAGCCCTCCTCCTCCTTAACC-3 ‘e 5′-AGCCAGGGTAGCATCGAC-3’ para

HIAL1

, 5′-CGCGCTCTACCCTGCACTC-3 ‘e 5′-TGAATCCGGCCTCAGGTAGTT-3′ para ERa, 5’-TGGGCTTACTGACCAACCTG-3 ‘e 5′-CCTGATCATGGAGGGTCAAA-3′ para o RpE, 5’-AGAGTCCCTGGTGTGAAGCAA-3 ‘e 5′-3-GACAGCGCAGAAGTGAGCATC “para o receptor de progesterona (PR), 5’-GCGCTGGCTCACCCCTACCT-3 ‘e 5′-GCCCCAGGGTGCAGAGATGTC-3’ para

ERK1

. As sequências dos iniciadores ERa, RpE e PR acima mencionados foram obtidos a partir de uma publicação anterior [33].

ERK1

foi escolhido como o gene de controlo com base na sua expressão estável em amostras do ovário, que consiste em subtipos normais e diferentes EOC [34], [35], e como previamente descrito [34]. A fluorescência foi capturado utilizando o sistema de detecção em tempo real iCycler iQ (Biorad Laboratories, Hercules, CA). As amplificações foram levadas a cabo a 50 ° C durante 2 minutos (UDG de incubação), 95 ° C durante 3 minutos (desnaturação), e 50 ciclos de 95 ° C 30 s /, 58 ° C /30 seg e 72 ° C /45 seg , seguida por uma curva de fusão de 70 ciclos de aumento de 0.5 ° C /ciclo começando a 60 ° C. Os controlos positivos e negativos foram introduzidas em todas as experiências, e a pureza e a especificidade dos produtos de PCR foram esporadicamente monitorizado por electroforese em gel de agarose. As reacções de PCR foram realizadas pelo menos três vezes para cada amostra de ADNc em experiências separadas. A expressão relativa valor foi obtido pelo método

ΔCt 1/2 usando

ERK1

como o gene de controlo. Neste método, a diferença em C

T (ôc

T) entre o alvo e os genes de controlo foi utilizado para determinar a expressão do gene com a fórmula 2

ΔCT. Um valor normalizado de expressão para o gene alvo com referência ao gene de controlo, em seguida, foi obtido pelo cálculo 1/2

ΔCT. Todos os valores de expressão de ARNm foram rácios relativos ao controlo

gene ERK1

.

Para monitorar a resposta biológica de expressão ectópica ERa em células TOV21G (ver abaixo), Q-PCR foi realizada para medir ARNm níveis de ERa alvos conhecidos, por exemplo,

GREB1

(regulação do crescimento pelo estrogênio no câncer de mama 1) e

TFF1

(factor trefoil 1, também conhecido como gene PS2) [36], [37]. As reacções de PCR foram realizadas como acima descrito utilizando os seguintes pares de iniciadores: 5′-TTCCCCGAAGTGCCAACAAC-3 ‘e 5′-ATGGAGATTCTGGAGACCACCC-3’ para

GREB1

, e 5′-TGGAGAACAAGGTGATCTGCG-3 ‘e 5’- CGAAACAGCAGCCCTTATTTGC-3 ‘para

TFF1

.

GEO Análise Dataset

usando

perfis de várias amostras de tecido dos quatro cancros do ovário morfologicamente distintas e de ovários normais de expressão gênica foi realizada a matriz Affymetrix HG_U133A [35] e foi feito acessível através do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia (NCBI) (GEO dataset GSE6008). No presente estudo, nós carregado tabela raw para cada amostra de tumor e selecionou os valores normalizados [quantil-normalizado de médias aparadas, log-transformada com log (max (x + 50,0) 50] para a hibridação das sondas de interesse. no caso de

HIAL1

e PR, a matriz Affymetrix HG_U133A continha apenas uma sonda para cada um destes genes (210619_s_at e 208305_at, respectivamente). por conseguinte, estes valores foram utilizados tal qual no nosso para análise . avaliar a expressão destes genes em amostras de tecido individuais no entanto, para eRa e RpE várias sondas estavam disponíveis (205225_at, 211233_x_at, 211234_x_at, 211235_s_at, 211627_x_at, 215551_at, 215552_s_at, 217163_at, 217190_x_at para eRa e 210780_at, 211117_x_at, 211118_x_at, 211119_at , 211120_x_at para RpE), e a média dos valores normalizados para as sondas de cada gene foi usada no nosso trabalho para analisar a expressão destes genes em amostras de tecidos individuais. as informações relativas histologia, grau e estágio destas amostras foi obtido a partir da material suplementar disponível [35] e está resumida na Tabela 1.

hialuronano zimografia

Para monitorizar a actividade de hialuronidase a partir de lisados ​​celulares de linhas celulares de cancro do ovário, hialuronano zimografia foi realizada como previamente descrito [38] . As células colhidas a partir de 80% culturas confluentes foram ressuspensas em tampão de lise (10 mM de imidazole, 0,25 M de sacarose), sonicadas brevemente e o seu teor de proteína foi determinada pelo reagente de proteína da BioRad. As amostras (contendo 30 ug de proteína) foram separadas por PAGE nativa (20 mA, 4 ° C) sobre um gel de 8% contendo 0,25 mg /mL de ácido hialurónico humano cordão umbilical (Sigma-Aldrich, Oakville, Ontário, Canadá). O gel foi então brevemente, equilibrada no tampão de ensaio específico para a detecção de hialuronidase-1 (formato de sódio 100 mM, NaCl 150 mM, pH 3,7) e subsequentemente incubadas durante a noite no mesmo tampão a 37 ° C. Após incubação, os géis foram tratados com 0,01 mg /ml de pronase (Sigma-Aldrich) num tampão de Tris 20 mM (pH 8,0) durante 4 h, enxaguada com água destilada, e coradas sequencialmente com 0,5% de azul Alcian e 0,1% de azul de Coomassie R , ambas em 30% de ácido acético methanol:10%. Os géis foram corados de-até limpar bandas de hialuronano digerido foram evidentes. zimografia em gel foi repetida três vezes para cada linha celular utilizando extractos celulares a partir de culturas diferentes.

HIAL-1 actividade enzimática das amostras de plasma

Quantificação da actividade HIAL-1 na amostra de plasma foi determinada por um método colorimétrico para a estimativa da

N

-acetil-D-glucosamina (NADG), divulgado após a digestão de ácido hialurônico [39], [40]. Resumidamente, as alíquotas de plasma tratado com EDTA (cerca de 4 ul, contendo 30 ug de proteínas, conforme determinado pelo reagente de proteína BioRad) foram incubadas com 40? G de hialurano a partir de cordão umbilical humano (Sigma-Aldrich) em 200 volume final ul de tampão de reacção (formato de sódio 79 mM, NaCl 150 mM, 0,2 mg /ml de BSA, pH 3,9) a 37 ° C durante 24 h. A reacção foi terminada por adição de 40 ul de 1,2 M de potássio tetraborato de pH 9,1 e fervido durante 3 min. formação da cor é revelada pela adição de 1,2 ml de

reagente p

-dimethylaminobenzaldehyde (preparada tal como descrito anteriormente [39], [40]) e incubação a 37 ° C durante 20 min no ambiente ácido do reagente . As amostras foram imediatamente lida a 585 nm. actividade de hialuronidase foi estimada a partir de uma curva de NADG (Sigma-Aldrich) padrão (1 a 10 nmoles), e foi expressa como nmol de proteína /ug. teor de proteína do plasma foi determinada pelo ensaio de proteína BioRad. Os espaços em branco foram obtidos por omissão das amostras de plasma. Cada amostra de plasma foi medida, pelo menos, três vezes em experiências separadas.

TOV21G transfecção de células

pCDNA plasmídeo (Invitrogen) contendo a sequência de estrogénio humano receptor alfa (denominada pERα) tem sido descrita [41] , [42]. TOV21G células foram cultivadas em meio completo OSE (Wisent) como descrito acima até que as células eram cerca de 60% confluente. As células foram transf ectadas transitoriamente com 1 ug pERα em meio DMEM-F12 (Wisent) sem suplementos usando o reagente de transfecção GeneJuice (EMD Chemicals, Gibbstown, NJ), de acordo com as instruções do fabricante. Após uma transfecção durante a noite, o meio foi substituído por meio completo OSE, e as células foram cultivadas durante um adicional de 24 h para a expressão da proteína. No final da experiência, as células foram recolhidas por tratamento com tripsina-EDTA (0,25% de tripsina com EDTA 1 mM; Invitrogen), lavadas em PBS e usada para extracção de ARN e Q-PCR ou para a extracção de proteína e imunotransferência. As experiências de transfecção foram repetidas pelo menos três vezes.

imunotransferência

As células foram lisadas em solução salina tamponada com Tris (20 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, pH 7,4) (TBS) contendo 0,1% Triton X-100, ortovanadato 1 mM, NaF a 1 mM, PMSF 0,1 mM e um cocktail de inibidores de protease × (Complete-Mini, Roche Diagnostics Canadá, Laval, Quebec, Canadá). O teor de proteína foi determinada pelo reagente de proteína BioRad usando uma curva padrão de BSA. As amostras (lisados ​​de aproximadamente 30 ug de proteína) foram sujeitas a 12% de SDS-PAGE, sob condições redutoras, e electrotransferidas para membranas de nitrocelulose. A ligação não específica para a membrana foi bloqueada com 5% de leite desnatado desidratado em TBS. As membranas foram depois incubadas com anticorpos primários (4 ° C, durante a noite), lavadas em TBS contendo 0,1% de Tween, e incubou-se com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano. Os anticorpos IgG primários utilizados no nosso trabalho eram anti-ERa (H-184, 1:1000, anticorpo de coelho; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) e anti-actina (Pan Ab-5, 1:1500, anticorpo de ratinho; Visão Lab Corporation, Fremont, CA). Estes anticorpos foram testados nas nossas condições de ser específico para as suas proteínas alvo. Conjugado com peroxidase anti-IgG de ratinho (1:1000, anticorpo de cabra, Sigma) e IgG anti-coelho (1:3000, anticorpo de cabra; Bio-Rad) foram utilizados como anticorpos secundários. reconhecimento de proteína-anticorpo foi detectado por Western relâmpago Chemiluminescence Reagent Plus (PerkinElmer, Boston, MA), de acordo com as instruções do fabricante.

A análise estatística

Porque os níveis de HIAL-1 e receptores de hormonas não foram sempre normalmente distribuídos, testes não paramétricos foram utilizados para analisar a expressão do gene em amostras de tecido e actividade enzimática em amostras de plasma. Nós primeira realizada uma análise não paramétrica de Kruskal-Wallis de variância e quando foram observadas diferenças significativas, realizamos Mann Whitney comparando o grupo de amostras normais (por microarray) ou benigno (por Q-PCR e da atividade) com cada um dos subtipos de tumor separadamente . A significância estatística foi considerada em

P Art 0,05. coeficientes de correlação de Spearman foram calculados e foram considerados estatisticamente significativos quando

P Art 0,05. As diferenças na expressão gênica de transfectadas e células TOV21G não-transfectadas foram analisados ​​pelo Student

t

-test (de duas caudas, equal-variância) e foi considerado significativo quando

P Art 0,05 . Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando PRISM4 para Windows versão 4 (GraphPad Software, Inc.).

Resultados

hialuronidase-1 expressão é elevada em células claras e mucinoso mas não em serosa e endometrióides EOC

no passado, a expressão de hialuronidase-1 em cancro do ovário tem sido descrito especificamente em tumores serosos [16], [17], provavelmente porque este é o subtipo mais frequente EOC [4]. No presente estudo analisamos a expressão de ARNm desta enzima por Q-PCR em amostras de tecido de cancro do ovário obtidos a partir de pacientes com diferentes subtipos morfológicas desta doença, v.g. serosa (11 amostras), endometrioid (9 amostras), de células claras (11 amostras) e mucinosos (8 amostras). Os níveis de expressão foram então comparados com os de 15 tumores do ovário benignos. Os tumores benignos foram escolhidos para comparação devido ao seu conteúdo abundante de epitélio de superfície que é muito poucos em ovários normais. Além disso, queríamos evitar possíveis interferências de HIAL-1 expressão em outros tipos de células do ovário. Por exemplo, demonstramos que esta enzima é expresso em células da granulosa do ovário de rato [38]. Como mostrado na Figura 1A, os níveis de

HIAL1

ARNm são significativamente elevados em células claras e carcinomas mucinosos (teste U de Mann Whitney,

P

0,05). Mas não em tumores serosos e endometrióides

a) Q-PCR para

HIAL1

expressão de mRNA em tumores benignos (barra branca), e em serosa (barra pontilhada), endometrioid (barra tracejada), de células claras (barra sombreada) e mucinoso (barra preta) amostras de tecido EOC de pacientes. Barras representam a média ± EPM da relação

HIAL1

expressão normalizados para controlo do gene da

ERK1

de diferentes pacientes em cada grupo. O valor para cada amostra de ADNc individual é a média de 3-4 medições Q-PCR separadas. * Indica

P Art 0,05 em teste de Mann Whitney. B) valores normalizados do

HIAL1

hibridização da sonda da matriz Affymetrix HG_U133A (GEO dataset GSE6008) em amostras de RNA de tecidos ovarianos normais (barra branca), e da serosa (barra pontilhada), endometrioid (barra tracejada), de células claras (barra sombreada) e (barra preta) EOCs mucinoso. Barras representam a média ± SEM de valores brutos de normalizada

HIAL1

hibridação. * Indica

P Art 0,05 em teste de Mann Whitney. C) Q-PCR para

HIAL1

expressão de mRNA em linhas celulares derivadas de epitélio normal do ovário (NOV2667D, NOV2809D, NOV2206D; barras brancas), e da serosa (TOV81D, TOV2223, TOV1946, OV1946, OV866; pontilhada bares ), endometrioid (TOV112D; barra tracejada), de células claras (TOV21G; barra sombreada) e mucinoso (TOV2444; barra preta) EOCs. As barras representam a média da relação

HIAL1

expressão normalizada para controlar o gene

ERK1

para cada linha de células. medições Q-PCR foram repetidas pelo menos três vezes para cada linha celular de ADNc. As linhas celulares derivadas a partir de diferentes subtipos EOC são representadas em barras separadas, por conseguinte, não há barras de erro são representados. setas verticais indicam células claras e linhas celulares mucinoso com alta

HIAL1

expressão de mRNA. D) Ácido hialurônico zimograma de lisados ​​celulares a partir do acima mencionado serosa, endometrioid, de células claras e linhas de células de cancro do ovário mucinoso. A seta horizontal marca a banda clara de ácido hialurônico digerido. A imagem é representativa de três experiências zimograma independentes.

Por causa do tamanho do nosso coorte amostra pode ser considerado pequeno, decidimos validar os nossos resultados através da análise

HIAL1

expressão de mRNA em um publicamente disponível microarray conjunto de dados [35] (GEO dataset GSE6008) contendo 41 serosa, 37 endometrioid, 8 de células claras e 13 amostras EOC mucinoso, e 4 amostras de tecido ovariano normal. A Figura 1B mostra os valores normalizados [quantil-normalizado de médias aparadas, log-transformada com log (max (x + 50,0) 50] para a hibridação de cada amostra com o

HIAL1

sonda (210619_s_at) da matriz Affymetrix HG_U133A. consistente com os nossos resultados Q-PCR, foi observada nenhuma diferença significativa para

HIAL1

expressão de ARNm entre os tecidos ovarianos normais e que de amostras de tumor seroso ou endometrióides (Figura 1B). carcinoma de células claras tinha uma tendência a expressar níveis mais elevados de

HIAL1

mRNA do que o tecido ovariano normal, mas sem significância estatística foi alcançada. de acordo com nossos resultados, as amostras mucinoso tinham níveis mais elevados estatisticamente significativas de

HIAL1

do que o tecido normal (teste de Mann Whitney,

P

0,05). (Figura 1B)

linhas celulares de cancro do ovário a partir de amostras tumorais derivadas destes subtipos diferentes morfológicas foram anteriormente caracterizados e mostraram um comportamento semelhante ao amostra de tumor a partir do qual foram produzidos [29] – [31] eles fornecem ferramentas poderosas para investigar os eventos moleculares relacionados a cada cancro do ovário morfologicamente distintas.. Portanto, o próximo passo foi analisar o nível de expressão de

HIAL1

ARNm e proteína nestas linhas celulares. culturas de células primárias de epitélio normal do ovário superfície (nariz) [29], foram utilizados como controlos. A Figura 1C mostra que, conforme esperado, a expressão de ARNm de

HIAL1

foram particularmente elevadas em linhas de células TOV21G (derivada de um carcinoma de células claras) e TOV2444 (derivado de um EOC mucinoso). Um nível intermediário de

HIAL1

expressão de ARNm foi observada na linha celular TOV112D, que foi derivada de um tumor do ovário endometrióide. As linhas celulares derivadas de cancro epitelial do ovário seroso no sítio primário (TOV81D, TOV2223, TOV1946) ou a partir do fluido de ascites (OV1946, OV866) mostraram níveis baixos de

HIAL1

expressão, comparáveis ​​aos das linhas celulares nariz. A fim de demonstrar que os níveis de expressão de ARNm, medidos quantitativamente por nosso conjunto de iniciadores, que se reflecte a quantidade de proteína HIAL-1 nestas amostras, medimos a actividade enzimática HIAL-1 por um zimograma substrato-gel. Este é um método convencional para medir a actividade de hialuronidase e hialuronidase é específico para-um, quando ensaiados a pH ácido [38]. A Figura 1D mostra uma banda clara de substrato digerido (hialuronano) apenas nos lisados ​​de células de linhas de células e TOV21G TOV2444. A actividade enzimática HIAL-1 em amostras de serosas e endometrióides estava abaixo do nível de detecção do nosso ensaio.

Dado que os níveis elevados Hyal-1 foram previamente correlacionados com tumores maiores bexiga grau e da próstata [21], [22 ], decidimos para verificar se os níveis de

HIAL1

mRNA em células claras e tumores mucinosos do ovário se correlacionam com o grau da doença ou estágio (ver Tabela 1 para obter informações dos pacientes). No entanto, a correlação de Spearman análises não revelam uma correlação positiva entre os níveis de

HIAL1

mRNA e qualquer grau ou estágio de células claras (r = 0,262 e -0,322 por grau e estágio, respectivamente, em nosso conjunto de dados, e r = 0,055 para a fase nos dados de microarranjos, todo

P Art 0,05) ou amostras de tumor mucinoso (r = -0.655 e -0.577 para grau e estágio, respectivamente, em nosso conjunto de dados, e r = -0.094 e – 0,378 para o grau e estágio nos dados de microarranjos, todo

P Art 0,05). análise global, incluindo todos os subtipos não mostram uma correlação positiva ou (r = -0,234 e -0,251 por grau e estágio, respectivamente, em nosso conjunto de dados, e r = 0,185 e 0,042 por grau e estágio nos dados de microarranjos, todo

P

0,05). Estes resultados sugerem que a expressão HIAL-1 pode ser uma característica fenotípica intrínseca de células claras e EOCs mucinosos e que pode ser utilizado como marcador de diagnóstico /detecção para estes subtipos de cancro do ovário.

hialuronidase-1 pode ser detectada actividade no meio de cultura condicionado de linha de células TOV21G e é um biomarcador potencial de soro /plasma para células claras e mucinoso EOC

tem sido demonstrado que HIAL-1 está presente no meio de cultura de linhas celulares de cancro da próstata e bexiga bem como na urina de pacientes com cancro da bexiga [21], [26], [27]. No presente trabalho, nós quisemos verificar se HIAL-1 também foi secretado pelas linhas de células de EOC e se poderia ser utilizada como um marcador do soro /plasma para os dois subtipos morfológicas em que o seu nível de expressão é elevada, e.g. de células claras e EOC mucinoso. A Figura 2A mostra a presença de actividade HIAL-1 (banda clara de hialuronano digerida) no meio condicionado isento de soro concentrado da cultura de células TOV21G, bem como na sua lisado celular. Em contraste, nenhuma actividade enzimática pode ser detectada no lisado condicionado celular médio e concentrado a partir da linha celular TOV1946 (derivado de um EOC serosa). Tendo estabelecido que HIAL-1 é segregada por células de cancro do ovário que expressam esta enzima, nós investigamos se esta actividade enzimática pode ser diferencialmente detectado no plasma de pacientes com subtipos EOC morfológicas distintas.