Abstract

Objectivo

lesão fibrosante hepática crônica é um importante fator de risco para o surgimento dessas neoplasias em humanos. Os ratos com eliminação sistemática de Mdr2 (ort�logo murino de MDR3) desenvolvem lesões fibrosante crónica do fígado. O carcinoma hepatocelular (HCC) emerge de forma espontânea em tais ratinhos por 50-60 semanas de idade, proporcionando um modelo de hepatocarcinogenese associada à fibrose. Usamos Mdr2

– /- ratos para investigar a hipótese de que a ativação do Hedgehog (Hh) via de sinalização promove o desenvolvimento de ambos fibrose hepática e carcinoma hepatocelular

Métodos

lesão hepática e fibrose. , hh ativação da via, e populações progenitoras do fígado foram comparados em Mdr2

– /- ratos e controles de tipo selvagem da mesma idade. Um experimento de determinação de dose com a Hh antagonista sinalização GDC-0449 foi realizada para otimizar a inibição da via Hh. Os ratos foram então tratados com GDC-0449 ou veículo durante 9 dias, e os efeitos sobre a fibrose hepática e carga tumoral foram avaliados por imuno-histoquímica, qRT-PCR, Western Blot, e ressonância magnética.

Resultados

Ao contrário dos controlos, Mdr2

– /- ratos expressa consistentemente ligantes hh e progressivamente acumulada HH-responsiva miofibroblastos fígado e progenitores com a idade. O tratamento de ratinhos deficientes em Mdr2 idade com GDC-0449 Hh actividade hepática significativamente inibido, diminuição do fígado miofibroblastos e células progenitoras do fígado, fibrose reduzida, promovido regressão de HCC intra-hepática, e diminuiu o número de HCC metastático sem aumentar a mortalidade.

Conclusões

Hh ativação da via promove a fibrose hepática e hepatocarcinogênese, e inibindo Hh sinalização com segurança inverte ambos os processos, mesmo quando fibrose e HCC são avançados

Citation:. Philips GM, Chan é, Swiderska M , Schroder VT, Guy C, Karaca GF, et al. (2011) Hedgehog sinalização Antagonista promove a regressão de ambos fibrose hepática e carcinoma hepatocelular em um modelo murino de cancro primário do fígado. PLoS ONE 6 (9): e23943. doi: 10.1371 /journal.pone.0023943

editor: Pranela Rameshwar, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de junho de 2011; Aceito: 27 de julho de 2011; Publicação: 02 de setembro de 2011

Direitos de autor: © 2011 Philips et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado, em parte, pela National Institutes of Health (NIH) SR1 DK077794, NIH RO1 AA010154, NIH T32 DK007568 e NIH T32 CA071341. Uma parte da imagem foi realizada no Centro de Duque de In Vivo Microscopia, suportado, em parte, pelo Centro Nacional de Pesquisa de Recursos National Biomedical Technology Research Center (P41 RR005959) e do Instituto Nacional do Câncer Programa de Recursos de Pequenos Animais Imagem (U24 CA092656). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o carcinoma hepatocelular (HCC) é um câncer insidioso que responde por até 1 milhão de mortes por ano e é a terceira principal causa de mortes por câncer em todo o mundo [1]. Cirrose, consequência de lesão hepática progressiva e fibrose, é o fator de risco maior única para HCC [2]. Uma ferida alterado resposta à lesão hepática crônica de cura, com consequente ativação desregulada de miofibroblastos e populações de células progenitoras, tem sido implicado na patogênese cirrose e eventual carcinogênese [3].

Mutações

A perda de função no canalicular do hepatócito fosfolipídios flipase MDR3 (ABCB4) tem sido associado com uma vasta gama de doenças biliares humanos, incluindo progressiva familiar tipo de colestase intra-3 (PFIC3), colestase da gravidez, drogas colestase induzida e uma cirrose biliar adulto com características semelhantes a colangite esclerosante primária (PSC) [4], [5], [6], [7]. Ratos com uma deleção alvo do Mdr2 (o ortólogo de murídeo de MDR3) falta a P-glicoproteína específica do fígado que transporta a fosfatidilcolina (PC) através da membrana canalicular. A ausência de fosfolipídios em resultados biliares em esclerosante progressiva colangite com acompanhamento de inflamação portal, proliferação ductular e fibrose portal. lesão hepática manifesta logo após o nascimento e hepatocelular carcinomas emergir espontaneamente entre 50 a 60 semanas de idade [8], [9], [10], [11], [12], [13], [14]. Ao contrário dos modelos de xenotransplante, que são amplamente utilizados para examinar os mecanismos de- e tratamentos para- HCC, Mdr2

– /- ratos fornecer um modelo que se assemelha a evolução natural do HCC em um fundo de inflamação crônica, lesão hepática e fibrose [15] .

a expressão de genes em ratinhos analisa e controla heterozigotos Mdr2 deficiente demonstraram indução robusta e sustentada de vários mecanismos adaptativos que controlam as respostas celulares relacionadas com o stress oxidativo, inflamação, metabolismo de lípidos, a proliferação e, levando a especulação de que estes processos contribuir para hepatocarcinogênese [16]. Embora não formalmente avaliada por estudos anteriores de ratos deficientes em Mdr2, outra via que pode desempenhar um papel na hepatocarcinogenese associada à fibrose é Hedgehog (Hh), porque a sinalização de Hh tem sido implicada tanto na reparação fibrogênica de lesão hepática e carcinoma hepatocelular.

a via de Hh é uma via de sinalização evolutivamente conservadas que é activado quando ligandos Hh (hedgehog sonic hedgehog indiana e) se ligam a patched (PTC), um receptor transmembranar que se expressa na superfície de células que respondem a Hh. Após a ligação ao ligando, a PTC está inactivado, aliviando a repressão de Smoothened (Smo), uma proteína trans-membrana que medeia a sinalização de Hh no interior da célula. activação Smo culmina na localização nuclear de factores de transcrição da família, Gli-Gli1, Gli2 e Gli3, que, por sua vez, regulam a expressão de genes a jusante. A via é quiescente em fígado normal, [17], [18], mas torna-se reactivada como um mecanismo de reparação de lesão crónica do fígado [19], [20], [21], [22], [23]. ligantes hh promover o crescimento e viabilidade de miofibroblastos, a acumulação de que leva a reparação anormal do fígado, fibrose e cirrose eventual [24], [25]. ligandos de Hh também servir como viabilidade e factores progenitores epiteliais proliferativas para o fígado, e a expansão deste compartimento tem sido associada à formação e manutenção de carcinomas hepatocelulares [26]. A possibilidade de que a activação de Hh via contribui para hepatocarcinogenese é apoiada pelo facto de que o Sonic hedgehog (Shh) expressão de ligando é observado em aproximadamente 60% dos HCC humana, e a expressão dos genes HH-regulados, Gli1 e Ptc, ocorre em 50% de tumores humanos [27], [28], [29], [30].

com base nestas observações, postulamos que a ativação da via Hh contribui para a patogênese de ambos fibrose hepática e carcinoma hepatocelular associada à fibrose. Para testar esta hipótese, os ratinhos tratados com Mdr2 deficientes em idade com o inibidor da via de Hh, GDC-0449, um inibidor de molécula pequena que se liga a Smoothened (SMO). Este agente foi seleccionado por causa do seu perfil de segurança humano em ensaios de fase 1, bem como a sua eficácia em tumores de órgãos sólidos, como o carcinoma de células basais (BCC) e meduloblastoma [31], [33] [32]. Nossos objetivos foram determinar se ou não camundongos com doença hepática avançada e HCCs toleraria inibição da via Hh e experiência melhorias na fibrose do fígado e /ou a carga tumoral.

Métodos

Ratos

Mdr2

– /- ratos foram uma oferta do Dr. Detlef Schuppan (Beth Israel Deaconess Medical Center, Boston, MA). correspondentes murganhos de tipo selvagem em geral FVB /NJ foram obtidos a partir de Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME). Todos os ratos foram alojados com um ciclo claro-escuro de 12 h e dado água e ração padrão

ad libitum

. Em idades, 2, 4, 12, 36 52 e 62 semanas, os ratos foram sacrificados sob anestesia geral. O peso do fígado e do peso corporal foram registados, soro e tecidos do fígado foram colhidos. Os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional animal, tal como regido pelo Instituto Nacional de Saúde do “Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório”, Duke University Animal Welfare Assurance Número A3195-01.

Serum AST /ALT determinação

aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) foram medidos usando kits disponíveis comercialmente a partir de Biotron Diagnostics (66-D e 68-D, respectivamente; Hemet, CA) de acordo com as instruções dos fabricantes .

Western Blot

a proteína total foi extraído de tecido toda fígado congelados em tampão RIPA. As amostras foram agrupados por idade (2-4 amostras por grupo etário), exceto quando indicado. A análise por Western blot foi realizada tal como anteriormente descrito. As membranas foram sondadas com os seguintes anticorpos primários: o Sonic hedgehog (SC-9024; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), hedgehog indiana (ab39634; Abcam), β-actina (SC-47778, Santa Cruz Biotechnology), Gli2 (18 -732-292462, Genway, San Diego, CA). Todos os anticorpos foram diluídos 1:1000 e foram incubadas a 4 ° C durante a noite. imagens de Western blot foram adquiridos utilizando um sistema FluorChem HD2 digital de câmara escura (Biosciences celulares, Santa Clara, Califórnia).

Imunohistoquímica

4 mm fixado em formol, amostras embebidos em parafina foram desparafinados e reidratadas. Para avaliar a arquitetura do tecido, as lâminas foram coradas com hematoxilina e eosina (H E) e vermelho Sirius por protocolo padrão. Para imuno-histoquímica, as lâminas foram incubadas em 3% de peróxido de hidrogénio /metanol. A recuperação de antígenos foi realizada por aquecimento em 10 mM de tampão de citrato de sódio ou 0,25% de pepsina (K19; Invitrogen, Carlsbad, CA) durante 10 minutos. As secções foram bloqueadas (Dako Envision, Carpinteria, CA) e incubadas com anticorpos primários durante a noite a 4 ° C: glioblastoma-2 (2-Gli; 18-732-292462; 1:2000; Genway, San Diego, CA); citoqueratina 19 (Troma-III; Hibridoma Bank, Iowa City, IA; 1:500); α-fetoproteína (AFP) (Dako, 1:1000); ouriço do Índio (Abcam; 1:750, Cambridge, MA); Polímero-HRP anti-coelho (K4003; Dako) ou anti-ratinho (K40011; Dako) ou kit de polímero MACH3 rato AP (MP530, Biocare médica, Concord, Califórnia, EUA) foram utilizados como anticorpos secundários. 3,3′-diaminobenzidina (DAB) Substrato cromogénio Sistema (K3466; Dako) e /ou Ferangi azul (Biocare) foi empregue no procedimento de detecção. Omitindo anticorpos primários das reações eliminados coloração que demonstraram especificidade coloração. As imagens foram adquiridas em um Olympus IX71 (Tóquio, Japão) microscópio invertido usando o sistema de software DP2-BSW (Olympus) de aquisição de imagem.

quantitativa em tempo real transcrição reversa PCR

RNA foi isolado a partir fígado inteiro, bem como a partir de amostras de tumores ressecados tinha extracção Trizol padrão tal como foi previamente descrito [24]. Uma tabela de primers foi incluído nos Materiais Suplementares.

morfometria

cortes de fígado e tumores fixadas em formalina foram coradas para CD44 e osteopontina como descrito acima, e foram quantificados por análise morfométrica com MetaView software (Universal Imaging, Downington, PA). Um mínimo de 5 selecionados aleatoriamente 10 × ou 20 × campos /secção foram avaliados para cada rato.

Quantitative Analysis imuno

cortes de fígado e tumores fixadas em formalina foram costained para Gli2 e CK19. Um mínimo de 5 regiões ductulares, 20 × campos por seção, foram avaliados para cada rato através da contagem do número de células co-marcado.

hidroxiprolina hepática ensaio

O teor de hidroxiprolina em amostras de fígado inteiros foi quantificada por colorimetria como descrito anteriormente [34]

tratamento de GDC-0449

na coorte inicial, de determinação da dose de animais, 16 Mdr2

-. /- ratos (idade 57- 68 semanas) foram designados para tratamento com o controlo de veículo (DMSO, n = 5), 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), ou 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6). relações homem-mulher foram equilibradas entre os grupos. GDC-0449 (Selleck Chemicals, Houston, TX) foi recentemente constituído diariamente em DMSO. Todos os ratinhos receberam uma injecção intraperitoneal diária de 9 dias. No dia 10, os animais foram sacrificados. As amostras foram recolhidas como acima. Uma segunda coorte de 20 Mdr2

– /- ratos (idade 51-59 semanas de idade) foram submetidos a todo o corpo de ressonância magnética para avaliar a carga tumoral e, em seguida, pares de ratinhos com cargas de tumor comparáveis ​​foram designados para tratamento com DMSO (controlo, n = 10) ou 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10). As drogas foram entregues como descrito acima; ressonância magnética foi repetido após a 9

º dia de tratamento; camundongos foram sacrificados para necropsia e tecido colheita

Patologia

H . E e Sirius coloração vermelha de cortes de fígado foi avaliada por um patologista credenciado. Foram examinados secções representativas do tumor e tecido não tumoral. O tecido tumoral foi definida como nódulos grosseiramente visíveis que tinham pelo menos 10 mm de tamanho e ressecável.

Abdominal ressonância magnética

Os animais foram atribuído um código de cegueira, a qual foi mantida durante a ressonância magnética (RM ) de aquisição de dados e análise. imagiologia do fígado MR rato foi realizado em 70/30 sistema de furo horizontal 7T Bruker Biospec (Billerica, MA). Os animais foram ligeiramente anestesiados sob isofluorano com monitorização contínua e manutenção de parâmetros fisiológicos durante toda a sessão de imagem (-60 min para cada animal). Axial e 2D coronal ponderada em T2 fast spin imagens de eco (TURBO-RARE, TE /TR = 11/4200 ms com 1 milímetro fatia grossa, matriz = 256 × 256 e FOV de 2,4 cm × 2,4 cm, 5 médias, 0,0 milímetros interslice GAP) imagens foram previamente obtido para fins de rastreio e informações anatômicas suplementar. Para a análise volumétrica tumor dirigido, 64 contíguos 500 mm de espessura imagens de densidade de prótons 3D FSE inclinado para T1 ponderação (TURBO-RARE, TE /TR = 9/1500 ms, matriz = 256 × 256 × 64 e FOV, 2,2 cm x 2,2 cm x 2,2 cm, a 25 minutos de duração) foram adquiridos. Todas as sequências de imagem foram realizados usando gating respiratório.

Análise volumétrica de conjuntos de dados de RM foi realizada em software Osirix, uma aplicação de processamento de imagem de código aberto desenvolvido e mantido pela Pixmeo (Genebra, SUI). tumores hepáticos foram segmentadas manualmente em cada animal por um radiologista especialista (ocultação do tratamento) de pós-tratamento. áreas selecionadas foram revistos para a consistência nas representações coronal e sagital, e cross-correlacionados com imagens axiais 2D FSE. Para volumetria, duas medições de volume separados foram obtidos para cada lesão, com o volume médio então levado. confiabilidade inter (valor de kappa) foi = 0,97. sequências de digitalização ponderadas em T1 e T2 foram realizadas.

Análise estatística

Resultados expressos em média ± SD. Significância estabelecido pelo teste t de Student. As diferenças foram consideradas significativas quando p 0,05

Resultados

acumulação progressiva de células HH-responsivos no Mdr2

– /- ratos

Várias formas de aguda e crônica. lesão hepática induzir a expressão hepática de ligandos de Hh e activação de células que respondem a Hh. Os níveis séricos de AST e ALT foram consistentemente mais elevada em Mdr2

– /- ratos do que controles pareados por idade (Figura S1), confirmando que os camundongos knockout tinha lesão hepática crónica. Assim, nós examinamos fígados de Mdr2

– /- ratos para ativação da via Hh. Em comparação com lisados ​​de proteína hepática de controles de tipo selvagem, lisados ​​de Mdr2

– /- ratos demonstraram um aumento em Sonic hedgehog (Shh) e ouriço do Índio (Ihh) por análise de Western blot. Isto era evidente no primeiro ponto de tempo examinado (2 semanas após o nascimento) e mantida durante todo o tempo de vida dos animais (até 64 semanas de idade) (Figura 1A). Imuno-histoquímica para o fator de transcrição HH-regulada, Gli2, demonstrou acúmulo progressivo, relacionada com a idade de células com coloração Gli2 nuclear em Mdr2

– /- ratos. Tais células Gli2-positiva incluídas células do estroma, bem como células hepatocíticas e ductulares (Figura 1B-C). Em conjunto, estes dados sugerem que a via de Hh é activada em fígados de ratos lesionados cronicamente Mdr2 deficiente, resultando em expansão progressiva de várias populações de células que respondem a Hh.

. análise de Western blot para Sonic Hedgehog (SHh) e Hedgehog Índio (IHH) em extractos de fígado inteiras reunidas a partir de jovens Mdr2

– /- ratos (2-16 semanas de idade), idade (36-64 semanas de idade) Mdr2

– /- ratos e controles pareados por idade (n = 3-5 ratinhos /grupo /ponto de tempo). Um Western blot representante demonstrando resultados de ratos jovens é mostrado. Significam dados ± SEM de ratos mais velhos são representados graficamente. B. cortes de fígado Representante manchado para demonstrar Gli2 de jovens (4 semanas de idade), de meia idade (36 semanas de idade) e idosos (52 semanas de idade) Mdr2

– /- ratos. expressão pouco Gli2 foi observado em camundongos tipo selvagem em qualquer idade, por isso os resultados de um representante 36 semanas de tipo selvagem do rato velho é mostrado. (10 ×) C. Quantitative Gli2 dados de imuno-histoquímica. O número de células nucleares Gli2 (+) foi contado em pelo menos 5 campos de alta potência (HPF) por secção fígado em Mdr2

– /- murganhos e controlos de tipo selvagem a 4, 36 e 64 semanas de idade (n = 3 -4 ratos /grupo /ponto de tempo) e média ± SEM são representados graficamente. * P 0,05, ** p 0,01 em Mdr2

– /- grupos vs. respectivos controles

Tratamento de Mdr2

– /- ratos com o inibidor de Smoothened, GDC-. 0449, é seguro e diminui Hedgehog via de sinalização

Para determinar a dose apropriada de GDC-0449, um estudo piloto foi feito com 16 idosos (57-68 semanas de idade) Mdr2

– /- ratos. Os animais receberam uma injecção intraperitoneal diária de 20 mg /kg GDC-0449 (n = 5), 40 mg /kg GDC-0449 (n = 6), ou controlo de veículo de DMSO (n = 5) durante 9 dias e depois sacrificados. Não houve diferença estatística na mortalidade entre o controle e dose elevada (40 mg /kg) grupos de GDC-0449. No momento do sacrifício, os rácios de peso de fígado /corpo de ratinhos nos três grupos foram também semelhantes, o que sugere que um relativamente curto período de tratamento sistémico com GDC-0449 a 40 mg /kg é bem tolerada pelos ratinhos com doença hepática avançada e HCC (Figuras S2A -B). A análise Western blot dos lisados ​​de fígado desta coorte de animais demonstraram que o tratamento GDC-0449 causou uma diminuição nos níveis de ligandos de Shh com a dose mais elevada, e Gli2 atenuação de expressão em ambas as doses (Figura S2C).

Hedgehog inibição de sinalização com GDC-0449 anula os efeitos de sinalização Hh sobre expressão do gene alvo

com base nos dados adquiridos em nosso estudo de determinação da dose, uma segunda coorte de Mdr2

– /- ratos (51-59 semanas de idade ) foram designados para tratamento com o veículo (DMSO; n = 10) ou 40 mg /kg GDC-0449 (n = 10) por meio de injecção ip diária durante 9 dias. A sobrevida global entre os dois grupos na segunda coorte foi igual, sem mortes no grupo de tratamento DMSO e 1 morte no grupo de tratamento GDC-0449 secundárias a lesão iatrogênica. Tanto o parênquima do fígado e tumores de ratos tratados mostraram diminuição da expressão do alvo via de Hh Gli2 (Figuras 2A-B). Em tempo real A análise de PCR de tumores ressecados revelou que o tratamento GDC-0449 libertado os efeitos inibidores da sinalização de Hh sobre PPARa, causando um aumento significativo na sua expressão de gene (Figura 2C). O tratamento com GDC-0449 também causou uma redução significativa da expressão de Gli1, outro gene alvo Hh (Figura 2D).

. cortes de fígado corados para Gli2 de DMSO-representativo e GDC-0449- ratinhos tratados (40 vezes). Gli2 dados imuno-histoquímicos quantitativos em fígados não tumorais de ratinhos tratados com DMSO ou GDC-0449 (n = 9-10 /grupo) são representados graficamente como a média ± EPM (

** p . 0,01

O número de ductular as células com coloração positiva Gli2 foram contados em cada trato /secção portal sob ampliação de 40 ×. secções de tumor B. dos mesmos ratinhos também foram coradas para demonstrar Gli2. os resultados de DMSO-representativo e ratinhos tratados com GDC-0449 são apresentados. Gli2 quantitativa dados de imuno-histoquímica foram gerados pela contagem ductular positivo Gli2 nuclear e células hepatocíticas em secções tumorais sob ampliação de 40 × Os resultados são representados graficamente como a média ± /40 x campo de alta potência SEM Gli2 células positivas (** p 0,01). C-D reversa quantitativa ratinhos de transcrição-PCR (qRT-PCR), análise de ARN de fígado inteiro de DMSO (barra aberta) e GDC-0449 (barra preta). C. tratada PPAR-γ, um gene que é normalmente reprimida pela sinalização de Hh. D. GLI1 ., um gene que é induzida por Hh sinalização média ± SEM são representados graficamente (** p 0,01)

inibição de sinalização Hedgehog com GDC-0449 reduz fígado fibrose

Mdr2

– /- ratos demonstraram aumentos progressivos relacionadas com a idade na expressão hepática de actina muscular liso alfa (α-SMA), um marcador de células estreladas hepáticas miofibroblásticas (Figura 3A, painel superior). Este foi acompanhado de expressão aumentada dos factores pró-fibrogênicas, tais como factor de crescimento transformante TGF-β e crescimento derivado de plaquetas fator de PDGF-β (Figuras S3A-B), e fibrose progressiva, como evidenciado por Sirius coloração vermelha (Figura 3A, inferior painel) e quantificação do teor de hidroxiprolina hepática (Figura 3B). O tratamento com GDC-0449 diminuição das células que expressam miofibroblásticas sma-a, a expressão hepática do TGF-β e PDGF-β, a coloração com vermelho Sirius, e o conteúdo de hidroxiprolina, o que demonstra que a inibição da via de Hh reduzida fibrose do fígado (Figuras 3C-D e Figuras S3C- D).

A. coloração imuno-histoquímica para a α-SMA (painel superior) e vermelho Sirius (painel inferior) em secções de fígado não-tumor de representante pareados por idade Mdr2

– /- ratos e de tipo selvagem (10 ×). B. Pooled hepática teor de hidroxiprolina de 2-

52 semanas de idade

tipo selvagem (WT) e pareados por idade Mdr2

– /- ratos (n = 3-5 /grupo). Resultados em Mdr2

– /- ratos foram normalizados ao de ratinhos WT pareados por idade e traçadas como a mudança vezes. Os dados são apresentados como média +/- SD (* p 0,05) secções de fígado C. não tumorais coradas para α-SMA (painel superior, 20 ×) e vermelho Sirius (painel inferior, × 10) em DMSO-representativo e GDC – tratada Mdr2

– /- ratos. D. Heptic teor de hidroxiprolina e de DMSO GDC- ratinhos tratados (n = 9 /grupo). Os resultados nos ratinhos tratados com GDC-0449 foram normalizados para a de ratinhos tratados com veículo de DMSO e representada graficamente como a mudança de dobragem. Os dados são apresentados como média +/- SEM (* p 0,05)

inibição de sinalização Hedgehog com GDC-0449 diminui a acumulação de células progenitoras do fígado

Em resposta à lesão, progenitor. populações no fígado proliferar. Assim, a análise imuno-histoquímica para os marcadores progenitoras, tais como citoqueratina-19 (CK-19) e α-fetoproteína (AFP), mostraram aumentos relacionados com a idade em Mdr2

– /- ratos (Figura 4A). Co-coloração para CK19 e Gli2 confirmou que a população de células progenitoras foi de Hh responsivo (Figura 4B). Após o tratamento com GDC-0449, marcadores progenitoras diminuiu (Figura 4C), indicando que a sinalização de Hh foi necessária para manter populações progenitoras durante a tumorigénese, e que a inibição de Hh seria suficiente para diminuir o tamanho das populações progenitoras mesmo em ratinhos com carcinoma hepatocelular avançado.

A. coloração imuno-histoquímica de secções de fígado de representante, pareados por idade Mdr2

– /- e de tipo selvagem camundongos para marcadores progenitoras, citoqueratina-19 (CK-19) (painéis superiores) e ácido a -fetoprote�a (AFP) (painéis inferiores) (20 ×). micrografia B. Representante de uma tríade portal no fígado de um Mdr2

– /- rato, demonstrando co-localização de CK-19 (azul) e Gli2 (marrom) no compartimento ductular (40 vezes). C. quantitativa Gli2 e CK19 imuno-histoquímica em DMSO e GDC-0449-tratada Mdr2

– /- murganhos (n = 9-10 /grupo). O número de Gli2 e CK19 células-aparecendo ductulares double-positivas foram contadas dentro dos tumores com menos de 20 × ampliação. Média ± SEM (+) células T duplo por campo de alta potência (HPF) são representados graficamente (* P 0,05) D. Análise de QRT-PCR de AFP no RNA do tumor de ratos tratados com DMSO (barra aberta) ou GDC-0449 (fechado resultados bar) nos ratinhos tratados com GDC-0449 foram normalizados ao dos ratinhos tratados com veículo de DMSO e representadas graficamente como média ± EPM (* p . 0,05)

a diminuição de sinalização Hedgehog reduz a expressão de osteopontina e evita a acumulação de células de resposta (osteopontina CD44-positivo)

caule /populações de células progenitoras de diversos tipos de cancro, incluindo carcinoma hepatocelular, são pensados ​​para ser enriquecida com células que expressam CD44, um receptor para a haste factor de crescimento da célula, a osteopontina [35], [36]. A expressão da osteopontina é regulada por Hh sinalização [37]. Portanto, foram examinados os efeitos de GDC-0449 sobre osteopontina e o seu receptor, CD44. A imuno-histoquímica e morfometria quantitativa demonstrou que a inibição da via de Hh com GDC-0449 diminuiu significativamente a coloração osteopontina dentro de tumores hepáticos primários (Figura 5A). Diminuições similares relacionadas com o tratamento de tumores em células CD44 + foram também observado (Figura 5B). A análise da expressão do gene mostraram que a expressão de ambos os ARNm de CD44 e osteopontina também tendeu a diminuir em ratinhos tratados com GDC-0449 (Figura 5C). Juntos, estes resultados sugerem que a sinalização Hh pode regular de câncer de fígado células estaminais /progenitoras putativos, modulando a disponibilidade de osteopontina.

A. secções de tumor de DMSO representativa e GDC-0449 tratada Mdr2

– /- ratos foram coradas para demonstrar osteopontina (OPN) secções representativas são exibidos (

Painel direito

). coloração de OPN foi quantificada por análise morfométrica de pelo menos 5 por HPF secção de tumor utilizando 20 x de ampliação (N = 5 ratinhos /grupo). Os resultados no grupo tratado com GDC-0449 foram normalizados para a do grupo tratado com veículo de DMSO e representada graficamente como a mudança de dobragem. Os dados são apresentados como média ± EPM (** p 0,01). coloração B. imuno-histoquímica para o receptor osteopontina, CD44, em tecidos peri-tumoral de DMSO representativa e GDC-0449- tratada Mdr2

– /- ratos. (

Painel direito

) coloração CD44 foi quantificada por análise morfométrica tal como descrito em A. Resultados em ratinhos tratados com GDC-0449 foram normalizados para os de controlos tratados com veículo e representada graficamente como média ± EPM (** p 0,01). C. Análise de QRT-PCR de RNA tumor no fígado a partir de DMSO (open bar) e GDC-0449- (barra fechada) tratados Mdr2

– /- ratos para OPN (esquerda) e CD44 (direita). Após a normalização de resultados no grupo tratado com DMSO, média ± SEM foram representados graficamente (* p 0,05)

ressonância magnética e evidência histológica de involução tumor no fígado após o tratamento GDC-0449

Para avaliar o impacto potencial das alterações nas células da matriz e progenitoras na HCC, os volumes pré e pós-tratamento de tumor foram analisados ​​utilizando a ressonância magnética (Figuras 6A-B). Uma análise de tumores em ratinhos sem metástases evidente demonstrado que os volumes de tumor diminuiu em ratinhos que receberam um curso de nove dias de GDC-0449-tratamento, enquanto que os animais tratados com veículo evidenciado o crescimento do tumor persistente (Figura 6C; -6,7% + /- 11,7% vs 22,7% +/- 9,1%, p = 0,03). Estes dados correlacionados com os resultados da autópsia: apenas 56% dos ratinhos tratados com GDC-0449 teve nódulos de tumor visíveis no fígado, em comparação com 80% dos ratinhos de DMSO (Tabela 1). Além disso, tanto MRI e necropsias mostraram uma diminuição do número de metástases em murganhos tratados com GDC-0449 em comparação com os controlos tratados com veículo (Tabela 1). A análise histológica de H E cortes de fígado corados também foi realizada em todos os animais de ambos os grupos. Se os nódulos de tumor não eram visíveis grosseiramente ou maior do que 10 mm em tamanho, as amostras foram excluídos da análise. nódulos tumorais microscópicos em animais de GDC-0449 tratados demonstrou Aumento das taxas de infarto hemorrágico (20% vs 0%; Figura 6D, painel superior), esteatose microvesicular (40% vs 0%, figura 6D, painel do meio), necrose acidophilic e citoplasmática degenerativa mudanças (70% vs 40%, a Figura 6D, painel inferior) em comparação com os tumores de animais tratados com veículo. Assim, os achados na RM, necropsia e histologia hepática foram consistentes e demonstrou que inibição da via Hh causou a regressão significativa de HCC primário e metastático.

A. imagem transversal representante do tumor intra-hepática conforme identificado por ressonância magnética com contraste após o tratamento GDC-0449. imagens B. Representante de ressonância magnética de perspectivas sagital, coronal e oblíquo utilizados para análise volumétrica. C. Alteração no volume do tumor foram quantificados por informatizar gerado medições volumétricas e traçadas como Média ± SD (* p 0,05). D. Micrografias das alterações histológicas representativas induzidas por, GDC-0449, o tratamento. painel superior mostra necrose tumoral; painel do meio demonstra degeneração gordurosa; Mostrar painel inferior vacuolizado células tumorais com núcleos picnóticos

Discussão

Foram estudados Mdr2

-. /- ratos para determinar se ou não a activação dos contributos da via Hh a hepatocarcinogênese durante a lesão fibrosante crónica do fígado. camundongos Mdr2 deficiente falta um flipase fosfolipídeo que é necessário para a formação normal bile e, consequentemente, apresentam lesões hepáticas e proliferação ductular a partir de uma idade jovem. Todos os ratinhos afectados desenvolvem eventualmente fibrose hepática significativa e HCC metastático. Os nossos resultados demonstram que esta patologia é acompanhada por activação progressiva da via de Hh. foi necessária a introdução de um inibidor específico da sinalização, Smoothened, atividade da via de Hh intermediário chave reduzida e provou que a sinalização de Hh sustentada para manter as populações expandidas de miofibroblastos do fígado e células progenitoras que se acumularam no fígado danificadas. Além disso, o tratamento de ratinhos Mdr2 deficiente envelhecido (que já tinha fibrose hepática avançada e HCC) com o inibidor da via de Hh significativamente reduzida fibrose hepática e carga tumoral, demonstrando pela primeira vez que a inibição da sinalização de Hh tem valor clinicamente relevante, terapêutico, tanto para o fígado fibrose e HCC. Ainda mais emocionante é evidência de que o efeito proibitivo no crescimento do tumor hepático

in vivo

pertence a ambos HCC intra-hepática e metástases à distância.

Além disso, nossos resultados fornecem uma visão sobre alguns do subjacente mecanismos envolvidos. produção hepática de ligandos Hh foi aumentada em ratinhos que desenvolveram fibrose hepática progressiva e HCC invasiva. Estes ratos também demonstraram níveis de transaminases séricas consistentemente mais elevados, de acordo com outras evidências de que a deficiência de Mdr2 provoca lesão crônica hepatócitos [38], [39]. Vários factores de stress que reduzem a viabilidade dos hepatócitos têm demonstrado induzir a produção e libertação de ligandos Hh por hepatócitos feridos [40], [41]. Assim, lesão do hepatócito é provavelmente um dos fatores que aumenta a geração ligando Hh em fígados mdr2 deficiente. miofibroblástica células e do tipo ductular progenitores progressivamente que se acumulam no fígado cronicamente lesadas também produzir ligandos de Hh, bem como outros factores, tais como o PDGF-β, que estimulam a síntese autócrina-parácrina de ligandos Hh [20], [42].