Abstract

O câncer de próstata é a neoplasia maligna não-dermatológica mais comum em homens no mundo ocidental. Recentemente, um cromossômica frequente aberração fusão andrógeno regulada

TMPRSS2

promotor e o gene

ERG

(

TMPRSS2 /ERG

) foi descoberto em câncer de próstata. Vários estudos demonstraram a cooperação entre

TMPRSS2 /ERG

e outros percursos defeituosos na progressão do cancro. No entanto, a revelação das vias mais específicas em que

TMPRSS2 /ERG

participa, requer uma investigação mais aprofundada. Usando células epiteliais da próstata imortalizado fomos capazes de mostrar que

TMPRSS2 /ERG

sobre-expressando células sofrem uma epitelial para mesenquimal Transição (EMT), que se manifesta pela aquisição da morfologia e marcadores mesenquimais, bem como capacidades de migração e invasão. Estas conclusões foram corroboradas

in vivo

, onde as células de controlo deu origem a nódulos discretos enquanto o

TMPRSS2 /ERG

-expressing células formadas tumores malignos, que expressaram marcadores EMT. Para investigar o regime geral de transcrição induzida pela

TMPRSS2 /ERG

, as células foram submetidas a uma análise de microarray, que revelou um programa expressão EMT distintas, incluindo aumento da regulação dos facilitadores EMT,

ZEB1

e

ZEB2,

e para baixo-regulação do marcador epitelial

CDH1

(caderina-e). Um ensaio de cromatina imunoprecipitação revelou ligação directa de

TMPRSS2 /ERG

ao promotor de

ZEB1

mas não

ZEB2

. No entanto,

TMPRSS2 /ERG

foi capaz de vincular os promotores dos

ZEB2

moduladores,

IL1R2

e

SPINT1

. Este conjunto de experimentos ilumina ainda mais o mecanismo pelo qual o

TMPRSS2 /ERG

fusão afeta a progressão do câncer de próstata e pode ajudar na segmentação

TMPRSS2 /ERG

e seus alvos a jusante em futuros esforços de design de drogas.

Citation: Leshem O, Madar S, Kogan-Sakin I, Kamer I, Goldstein I, Brosh R, et al. (2011)

TMPRSS2 /ERG

Promove epitelial para mesenquimal Transição através do

ZEB1

/

ZEB2

Axis em um modelo de cancro da próstata. PLoS ONE 6 (7): e21650. doi: 10.1371 /journal.pone.0021650

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 26 Janeiro, 2011; Aceito: 4 de junho de 2011; Publicação: 01 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Leshem et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado por um Centro de Excelência concessão de hospedeiros de bordo Medical Research Institute (FAMRI), CT-2004-503.576 LSHC-o Abraham Centro Yad para o cancro Diagnóstico e Terapêutica e da Fundação Ridgefield, programa CE FP6 Grant, “Talpiot” para a liderança médica no Centro Médico Sheba, e da Associação Cancer israelense. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um dos cancros mais frequentes em homens. Cerca de 30.000 pacientes Espera-se que morrem da doença nos EUA anualmente. Um grande avanço neste campo de pesquisa é uma descoberta recente que freqüentam sobre-expressão de E vinte e seis (ETS) proto-oncogenes relacionados com pode ser movida por receptor de andrógeno como consequência de rearranjos genômicos comuns. A forma predominante das fusões acima mencionados com uma frequência de -85% [1], é a fusão entre o exão 1 de TMPRSS2 e os exões 4-9 do

gene ERG

, que ocorre quer por uma deleção de três região de mega bases separando estes genes [2], ou por meio de uma translocação intercromossômicas [3], [4]. Como esta fusão é já evidente em Prostática neoplasia intra-epitelial (PIN) [5], investigando esta fusão pode ser a chave para a compreensão dos mecanismos envolvidos nas fases iniciais do câncer de próstata.

Desde a sua descoberta [6], o

TMPRSS2 /ERG

fusão tem sido extensivamente estudada em vários aspectos, incluindo o diagnóstico precoce, o prognóstico, a contribuição para a progressão do câncer e até mesmo como um alvo para terapia de câncer [7]. De acordo com estudos clínicos de longo prazo realizados em um grande grupo de pacientes, parece que

TMPRSS2 /ERG

expressão está associado com uma forma mais agressiva do cancro da próstata [8], [9]. Outros estudos têm demonstrado um papel para

TMPRSS2 /ERG

fusão na tumorigênese em termos de proliferação, invasão e iniciação e progressão de cancro [10], [11], [12], [13]. Em geral, verifica-se que a proliferação de células não é necessariamente promovida através

TMPRSS2 /ERG

. Quanto à tumorigênese, os dados são inconclusivos. Enquanto bater-down endógena

TMPRSS2 /ERG

nas células cancerígenas derivadas de próstata VCaP resultou em uma redução de ambos a absorção do tumor e volume [13], [14], camundongos transgênicos abrigar

TMPRSS2 /ERG

em seu genoma seja PIN desenvolvida [10], [15] ou não revelam evidência histológica de PIN ou câncer invasivo [11], [16]; dependendo do modelo específico utilizado no estudo e a interpretação dos dados. Apesar da discordância sobre o papel da

TMPRSS2 /ERG

na iniciação do câncer, invasão celular foi sugerido para ser uma consequência da

TMPRSS2 /ERG

fusão ambos

in vitro

e

in vivo

[10], [13], [15]. Curiosamente, um

in silico

estudo revelou que

TMPRSS2 /ERG

co-expressa com histona deacetilase 1 (HDAC1) é acoplado com regulação para baixo do seu alvo conhecido [17]. Esta descoberta implica que

TMPRSS2 /ERG

está associada a reprogramação epigenética. Assim, em um estudo de acompanhamento realizado pelo mesmo grupo, HDACi e HDAC inibidores específicos, comprometida TMPRSS2

/ERG

expressão ou atividade em células positivas ERG,

in vitro

[17] , [18]. Além disso, descobertas recentes demonstraram uma cooperação entre TMPRSS2 /ERG fusão e a actividade desregulada de vias relacionadas com o cancro, tais como PTEN [19], da PI3-quinase [16], e AKT ou AR [20]. Mais recentemente, TMPRSS2 /ERG foi mostrado para mediar epiteliais para mesenquimais transição (EMT) através da indução de sinalização de Wnt componentes [21]. Tomados em conjunto, poderia se supor que o outro

TMPRSS2 /ERG

vias mediadas, pode ser convergiram ao mesmo ponto final, ou seja, EMT e invasão; e, portanto, descobrir novos caminhos através dos quais

TMPRSS2 /ERG

exercer este efeito é de grande importância. A principal motivação deste estudo é, portanto, para desvendar tais vias

TMPRSS2 /ERG

relacionados no contexto do câncer de próstata. Em um trabalho anterior, estabelecemos células epiteliais da próstata humana tumorigênicos linhas de constituição genética definida [22] (PrECs) imortalizado e. PrECs mesma forma, no estudo apresentado, geramos geneticamente modificados para servir como um fundo no qual os efeitos do

TMPRSS2 /ERG

fusão poderia ser realmente estudado. Descobrimos que TMPRSS2 /ERG executa um programa expressão EMT distinto, que é regido principalmente pela ativação direta do

ZEB1 Comprar e uma indução indirecta de

ZEB2

através de

SPINT1

e

IL1R2

modulação, levando a um fenótipo de EMT

in vitro

e

in vivo

.

Resultados

Estabelecimento de culturas PrECs imortalizadas

a fim de investigar o impacto da

TMPRSS2 /ERG

em um ambiente geneticamente modificado que procurou estabelecer uma cultura PrECs imortalizado. As células epiteliais de próstata normais foram produzidos a partir de um espécime de prostatectomia humanos e foram subsequentemente cultivadas em cultura. Para induzir a imortalização, as células foram introduzidas com a telomerase catalítica hTERT subunidade, e tanto o p53 e vias pRB foram perturbados por knockdown de p53 e a sobre-expressão de CyclinD /CDK4 quimera, respectivamente, dando origem a uma linha celular imortal designada como EP (Figura 1A e B). Em seguida, as células imortalizadas foram infectadas com retrovírus que codifica quer

TMPRSS2 /ERG

ou controlo empty-vector (Figura 1C). nível de proteína ERG foi comparável com o seu nível de expressão previamente relatada em linhagens celulares e amostras de câncer [23], [24]. Notavelmente,

TMPRSS2 /ERG

sozinho ou em combinação com hTERT e /ou knockdown p53 não foi suficiente para induzir a imortalização (dados não mostrados). Finalmente, após um relatório anterior que a combinação do receptor andrógeno (AR) e níveis elevados de ERG promove o desenvolvimento de um adenocarcinoma de mais fracamente diferenciado, invasivo do que qualquer um sozinho de genes [20]; AR foi introduzido no

TMPRSS2 /ERG

células -expressing, bem como em seus controles vazia por vetores (Figura 1C).

Para induzir a imortalização, as células foram introduzidas com a telomerase catalítica hTERT subunidade , e tanto o p53 e pRB vias foram perturbados knockdown utilizando p53 e a sobre-expressão de cyclinD /CDK4, respectivamente. (B) PrECs primária, bem como hTERT /shp53 /CyclinD-CDK4 – células que sobre-expressam (células PE), foram sequencialmente passados ​​e contadas. Duplicações da população (PDLs) foram calculados utilizando a fórmula: PDLs = log (saída da célula /cellinput) /log2. (C) células PE foram introduzidas com AR e ou

TMPRSS2 /ERG

(EP-AR TMPRSS2 /ERG) ou um vector vazio (EP-AR). Os níveis de proteína AR e ERG foram medidos por Western blot. Actina foi usado como um controle de carga.

Um papel para

TMPRSS2 /ERG

em epitelial para mesenquimal

in vitro

Comparando o morfologia da EP-AR e EP-AR

TMPRSS2 /ERG

linhas de células sob um microscópio de luz, observamos que a EP-AR

TMPRSS2 /ERG

células fibroblásticas adquiriu características semelhantes, como eles demonstraram uma morfologia mais alongada e uma densidade espalhada em comparação com os respectivos controlos isogénicas, que exibiram maior grau de adesão entre as células vizinhas (Figura 2A). As alterações observadas, que são traços característicos da EMT [25], [26], juntamente com relatórios anteriores associando

TMPRSS2 /ERG jogue com EMT e invasão [10], [21], levou-nos a examinar se, além das alterações morfológicas, as células também foram concedidos com capacidades de motilidade e invasão. Para este fim, as células foram semeadas em transwells com meio isento de soro e a sua migração para meio suplementado com soro foi avaliada. Tal como mostrado na Figura 2B,

TMPRSS2 /ERG

-expressing células exibiram uma capacidade migratória melhorada. A mesma experiência foi repetida usando poços revestidos com Matrigel, a fim de examinar a capacidade das células para invadir e penetrar uma superfície densa. Mais uma vez, a capacidade de invasão foi significativamente mais discernível nas células in

TMPRSS2 /ERG

expressam (Figura 2C). A perda de

CDH1

(E-caderina) é considerado para ser o evento mais fundamental durante EMT [27]. Por isso, mediram os níveis de

CDH1

mRNA e proteína usando QRT-PCR e imunofluorescência, respectivamente. Na verdade, o documento EP-AR

TMPRSS2 /ERG

células demonstraram uma redução acentuada nos níveis de

CDH1

ARNm (Figura 2D) e proteína (Figura 2E). Além disso,

VIM

(Vimentin), um marcador mesenquimais conhecido foi encontrado para ser elevado no

TMPRSS2 /ERG

células -expressing (Figura 2E). Em suma, nossos dados sugerem que

TMPRSS2 /ERG

superexpressão provoca uma epitelial para mesenquimal

in vitro

.

(A) Para efeito de comparação morfológica, as células foram fotografadas usando um microscópio óptico. (B) As células foram semeadas em transwells e a sua capacidade migratória para FCS foi medida por contagem das células que migram. (C) a mesma configuração como em (B) foi usada com transwells revestidos por Matrigel, a fim de comparar a invasividade de células. (D) As células foram analisadas quanto à expressão CDH1 (E-Cadhein) utilizando qRT-PCR. Os resultados são apresentados como a média ± SD de um triplicado de uma experiência representativa. * Indica uma expressão diferencial significativa do gene em comparação com o controlo. (E) As células foram plaqueadas em lâminas e coradas para CDH1 e vimentina. DAPI foi utilizado para visualizar os núcleos. (F) As células foram implantadas em glândulas da próstata de murideo. As glândulas foram removidos 68 dias após o implante, seccionadas e coradas quer com hematoxilina e eosina (H E) ou com anticorpos contra a AR humana, CDH1 e vimentina. (X400 ampliações). Note-se que as células EP-AR (controlo) formados nódulos discretos próstata (setas azuis), que são corados positivamente com o anticorpo anti-AR humano específico (α-Har). Em contraste, os tumores EP-AR TMPRSS2 /ERG-derivados, que são marcadas positivamente com o anticorpo α-Har, engolfou os nódulos murino alfa-har-negativo (setas pretas).

O efeito de

TMPRSS2 /ERG

na tumorigênese

em uma tentativa de estender a observação anterior para um em> in vivo

modelo

TMPRSS2 /ERG

células formaram tumores malignos grandes, que cercaram os nódulos da próstata murinos normais (Figura 2F, setas pretas). Além disso, nódulos EP-AR-derivadas demonstraram coloração positiva para o CDH1 marcador epitelial, e não conseguiu manchar para o VIM mesenquimais marcador (Figura 2F, setas azuis). Uma imagem de espelho era evidente em EP-AR

TMPRSS2 /ERG

tumores -derived, que expressaram níveis elevados de VIM e eram negativas para CDH1, corroborando ainda mais o

in vitro

observação de que

TMPRSS2 /ERG

induz EMT. A coloração para MKI67 (Ki-67), um marcador de proliferação conhecido, revelou uma extensa expressão na EP-AR

TMPRSS2 /ERG

tumores (37% ± 2 células positivas) em comparação com os nódulos EP-derivadas-AR (8% ± 2). Isso indica que os nódulos EP-AR-derivados são menos proliferativa e podem ser responsáveis ​​por sua natureza latente.

Os resultados descritos sugerem assim longe que

TMPRSS2 /ERG

facilita EMT e, consequentemente, a formação de tumores mais agressivos e proliferativas. Vários estudos demonstraram que em comparação com lesões de PIN,

TMPRSS2 /ERG

frequência rearranjo em cancros da próstata invasivos localizados, é o dobro [5], [28], [29], [30]. Esta observação implica que

TMPRSS2 /ERG

requer modificações adicionais, a fim de ser selecionado positivamente como a doença progride. Para testar esta hipótese, utilizou-se, uma cultura transformadas com Ras PrECs gerado anteriormente [22]. Estas células abrigar hTERT ectopicamente expressa, os oncogenes virais SV40 antígenos pequenos e grandes T, oncogénico H-RasV12 e receptor de andrógeno. Um vector vazio ou uma

TMPRSS2 /ERG

-Encoding vectores foram introduzidos nestas células, para gerar duas linhas celulares distintas e, LHSR LHSR

TMPRSS2 /ERG

, respectivamente (Figura 3A). De acordo com os resultados obtidos com as células EP-AR, CDH1 foi regulada em células LHSR expressando

TMPRSS2 /ERG

(Figura 3B). Em seguida, as células foram injectadas em ortotopicamente próstatas de ratinhos nus, assim como sub-cutânea. Como esperado, a seguir meramente 28 dias, ambas as linhas celulares deu origem a tumores com nenhuma diferença significativa no tamanho do tumor (incidência é apresentada na Tabela S1). Por conseguinte, MKI67 coloração não revelaram diferenças entre as linhas celulares no que se refere à taxa de proliferação (dados não mostrados). Curiosamente, os

TMPRSS2 /ERG

-expressing tumores demonstraram um marcado aumento da regulação do VIM e uma notável diminuição da regulação da CDH1 comparação com os tumores de controlo (Figura 3C), validando ainda mais a facilitação da EMT pela

TMPRSS2 /ERG

em um adicional, e uma,

in vivo

modelo mais agressivo. Uma vez que as linhas celulares LHSR são altamente agressiva, eles não são adequados para estudar o efeito de

TMPRSS2 /ERG

de formação de metástases, como os ratos tiveram de ser sacrificados dentro de um curto período após as injecções. No entanto, num caso,

TMPRSS2 /ERG

-expressing metástase tumoral no pulmão murino. Como mostrado na Figura S1, este metástase originado a partir do LHSR

TMPRSS2 /ERG

tumor primário, como positivo coradas com anticorpo anti-AR humano-específica. É tentador especular que a EMT induzida pelas células

TMPRSS2 /ERG

concedidos com capacidades migratórias e invasivos e, eventualmente, permitiu-lhes casa e proliferar em um local distante. Assim, dado um fundo genético altamente transformado,

TMPRSS2 /ERG

EMT induzida pode facilitar a invasão e metástase.

PrECs (A) ectopicamente expressam hTERT, bem como antigénios pequeno e grande T SV40 foram introduzida com H-RasV12 e AR. A linha resultante, LHSR (Control), foi introduzido com TMPRSS2 /ERG para formar a linha LHSR TMPRSS2 /ERG. Um Western blot mostra os níveis de proteína dos genes ectopicamente expressas. (B) As células foram analisadas quanto à expressão CDH1 utilizando qRT-PCR. Os resultados são apresentados como a média ± SD de um triplicado de uma experiência representativa. (C) As células foram implantadas ortotopicamente em ratinhos glândulas da próstata. As glândulas foram removidos de um mês após o implante, seccionadas e coradas com H E ou anticorpos contra a AR, CDH1, e vimentina. Setas pretas indicam nódulos rato com uma coloração negativa para a AR. (X400 Ampliação).

EP-AR e LHSR expressar TMPRSS2 /ERG não estão contaminados com células de linhagem mesenquimal

Para excluir a possibilidade de que a EMT relatou decorre de uma contaminação cruzada de culturas de células mesenquimais foi realizada Curto repetição em tandem (STR) fingerprinting base. loci STR são elementos de sequências repetitivas, de 3 a 7 pares de bases de comprimento, que são abundantemente distribuídas por todo o genoma humano. PCR análise STR base está cada vez mais a ser utilizado como um meio para a identificação humana para estudos forenses e de ligação [31], [33], [34] [32]. Analisou-se ambas as culturas e EP LHSR baseado em transferência de alelos para cada um dos loci STR testado. O documento EP-AR e EP-AR TMPRSS2 /ERG foram considerados idênticos no que diz respeito ao locus STR 16 (Tabela 1). LHSR e LHSR TMPRSS2 /ERG foram encontrados para ser idênticas umas às outras, no entanto, não EP-AR ou EP-AR TMPRSS2 /ERG. Para corroborar esta observação nós também realizada análise espectral Karyotying (SKY), a fim de detectar características cromossômicas recorrentes únicas, especificamente aparecendo nas duas culturas de células isogênicos. Como mostrado na Figura S2, EP-AR e EP-AR TMPRSS2 /ERG tem material adicional no cromossoma 11, enquanto o LHSR e LHSR TMPRSS2 /ERG Quadro 3 translocações cromossómicas específicas, novamente indicando que cada tipo de cultura, decorre da mesma origem . Estes resultados sugerem que a EMT aqui relatado é um genuinamente induzida por TMPRSS2 /ERG em vez de contaminação cruzada.

TMPRSS2 /ERG

EMT induzida é mediada pela

ZEB1

/

ZEB2

eixo

Várias vias são conhecidas a convergir em

CDH1

repressão durante epitelial para mesenquimal [27]. Assim, buscou-se medir os níveis de expressão de vários fatores de transcrição que foram notificados para facilitar EMT pelo direto ou uma repressão indirecta de

CDH1

[27]. Os níveis de expressão

SNAI1 (Caracol), SNAI2 (Slug), FOXC2, GSC (Goosecoid), TWIST1, TCF4 (E2.2), TCF3 (E47) e KLF8

foram medidos e verificou-se ser baixo ou igualmente expressas tanto em EP-AR e EP-AR

TMPRSS2 /ERG

linhas celulares (Figura 4A). Notavelmente, a expressão de

ZEB1

e

ZEB2

, dois repressores diretos conhecidos de

CDH1

[27], foram dramaticamente up-regulamentada no

TMPRSS2 /ERG

-expressing células (Figura 4A).

ZEB1

indução por

TMPRSS2 /ERG

foi ainda validado no nível de proteína por coloração imunológica (Figura 4B). Para testar se

ZEB1

tem um papel eficaz na promoção do processo EMT em nosso modelo, a sua expressão foi knocked-down forma estável usando curto hairpin RNA (shRNA) e ensaio de migração foi realizada. Como mostrado na Figura 4C,

ZEB1

níveis diminuiu drasticamente após

ZEB1

knockdown, resultando em uma atenuação significativa da capacidade migratória das células

TMPRSS2 /ERG

-expressing ( Figura 4C, painel inferior).

(A) associada a EMT fatores de transcrição expressão. As células foram analisadas para a expressão dos genes especificados utilizando qRT-PCR. Os resultados são apresentados como a média ± SD de um triplicado de uma experiência representativa. ND = Não detectado. * Denota uma significativa expressão diferencial (P-Value 5 × 10

-4). (B) As células foram colocadas em lâminas e corado com α-

ZEB1

anticorpo. Os núcleos foram visualizadas por DAPI. (C) glândulas da próstata foram injectados com EP-AR (Control) e EP-AR TMPRSS2 /ERG como descrito, removidos, seccionados e corados com um

ZEB1

anticorpos α-. A seta azul indica um nódulo humano. A seta preta indica nódulos rato com uma coloração negativa para a AR. (X400 Ampliação). (D)

ZEB1

foi seus níveis de mRNA knocked-down e foram medidos (painel superior). * Denota uma expressão diferencial significativa (P-value =

-4 8 × 10). As células foram submetidas a ensaio de migração, conforme descrito (painel inferior). ** Denota uma expressão diferencial significativa (P-value = 4 × 10

-3).

ambos

ZEB1

e

ZEB2

regiões promotoras consistem de putativa

TMPRSS2 /ERG

motivos de ligação (Figura S3), o que implica que

TMPRSS2 /ERG

pode ligar directamente os seus promotores e aumentar a sua expressão. Para testar essa hipótese, realizamos um ensaio de cromatina imunoprecipitação (CHIP), utilizando um anticorpo α-ERG. Curiosamente, tal como representado na figura 5A,

TMPRSS2 /ERG

parece ligar-se directamente

ZEB1

promotor, mas não

ZEB2

. Como controlo negativo utilizou-se uma região de promotor de

CDH1, que é uma parte do

ZEB1

/

ZEB2

eixo, mas não abriga um local de ligação ERG. Este resultado implica que

TMPRSS2 /ERG

pode indiretamente induzir

ZEB2

através da mediação de

ZEB2

up-stream efetores. Para investigar esta conjectura, e para melhor compreender o mecanismo pelo qual

TMPRSS2 /ERG

executa o programa EMT em geral; realizamos uma abordagem de todo o genoma e realizou uma comparação baseada em micro-array expressão entre

células TMPRSS2 /ERG

EP-AR e EP-AR. Um total de 1215 genes anotados foram diferencialmente expressos entre as duas linhas de células (813 up-regulada e 402 para baixo-regulado), do qual recuperou os que foram ambos associados com

ZEB1

ou

ZEB2

, e implicada em EMT na literatura (para o método de filtragem detalhada referem-se a legenda da figura 5B). Para verificar a autenticidade deste conjunto de genes que também validou seus padrões de expressão diferencial derivado de microarranjos utilizando qRT-PCR (dados não mostrados). Como representado na Figura 5B, sete genes corresponde aos critérios de filtragem. Dois deles,

IL1R2

e

SPINT1

(Figura 5C, validados por qRT-PCR), foram notificadas para codificar efetores montante de

ZEB2

expressão; o primeiro foi mostrado para elevar

ZEB2

níveis de expressão [35], enquanto o último atenua sua expressão [36], sugerindo que eles podem ser os mediadores da

TMPRSS2 /ERG

dependente

ZEB2

elevação. Ambos

IL1R2

e

SPINT1

regiões promotoras consistem em putativa

TMPRSS2 /ERG

motivos de ligação (Figura S2), e de fato

TMPRSS2 /ERG

exibiu uma uma ligação significativa para os seus promotores num ensaio de chip (Figura 5D). Para corroborar ainda mais SPINT1 e IL1R2 efeito sobre

expressão ZEB2

em nosso sistema, nós knocked-down sua expressão usando pequena interferência RNA (siRNA). Como mostrado na figura 5E,

SPINT1

e

IL1R2

níveis foram efetivamente reduzido mediante siRNA transfecção, resultando em

ZEB2

elevação e redução, respectivamente. Em suma,

TMPRSS2 /ERG

parece ligar-se directamente e trans-ativar

ZEB1

enquanto indiretamente induzindo

ZEB2

via trans-ativação e trans-repressão de seus efetores,

SPINT1

e

IL1R2

.

ensaio (a) cromatina-IP foi realizada em células EP-AR TMPRSS2 /ERG utilizando anticorpo α-ERG e IgG como controlo. Os resultados são apresentados como a média ± SD de um triplicado de uma experiência representativa. * Denota valor P 3 × 10

-2. (B) A lista de 1215 genes expressos diferencialmente foi cruzado com uma lista de genes associados com

ZEB1

ou

ZEB2

, a qual foi obtida a partir do software “Genomatix” [47], resultando em 37 genes compartilhados. A lista de 37 genes foi filtrado para genes associados a EMT de acordo com a literatura (n = desconhecido tamanho da amostra), deixando os 7 genes que estão listados na caixa abaixo. (C) As células foram analisadas para

SPINT1

e

IL1R2

expressão utilizando qRT-PCR. Os resultados são apresentados como a média ± SD de um triplicado de uma experiência representativa. * Denota valor P 5 × 10

-4. (D) O mesmo set-up como (A) foi usado para

IL1R2

e

SPINT1

promotores (E) Esquerda painéis: células EP-AR foram transfectadas com siRNA segmentação

SPINT1

e ARNm dos genes designados foi medida por qRT-PCR. Os resultados são apresentados como média ± DP de duas experiências utilizando dois oligonucleótidos diferentes de ARNip. * Denota P-value = 7 × 10

-4, ** denota P-value = 1 × 10

-3. painéis da direita: o mesmo set-up experimental foi utilizado com siRNA segmentação

IL1R2

na EP-AR TMPRSS2 /ERG. * Denota P-value = 2 × 10

-4, ** denota P-value = 1 × 10

-2.

Discussão

Neste estudo nós fornecemos evidência substancial para apoiar a noção de que

TMPRSS2 /ERG

assume um papel activo na epitelial para mesenquimal através da activação do ZEB /

CDH1

via, tanto

in vitro

e

in vivo

. Estes achados lançar luz sobre o mecanismo pelo qual o

TMPRSS2 /ERG

fusão exerce o seu efeito oncogénico.

EMT e invasão capacidades foram relatados para ser uma consequência da

TMPRSS2 /ERG

expressão em vários estudos [10], [13], [15], [21]. Assim, parece que a EMT e invasão são processos gerais que são executadas pelo

TMPRSS2 /ERG

no câncer de próstata, e que são alcançados por diversos mecanismos. Consistentemente, os componentes de sinalização Wnt, como Wnt7a, eram evidentes em nosso modelo também. EMT é induzida por várias vias de sinalização, todos canalizados para a regulação da

CDH1

. Estas vias são regidos por cerca de 10 fatores de transcrição principais, que reprimem

expressão CDH1

em qualquer uma participação directa ou de forma indirecta [27]. Uma tal via é a SNAI1 /2, os quais regulam

ZEB1

expressão /2 e foram implicados no cancro da próstata [37], [38], [39]. Nenhuma expressão diferencial de SNAI1 ou SNAI2 era evidente no nosso sistema. No entanto, conforme relatado anteriormente [40],

Zeb

genes podem promover EMT independentemente Snail1 expressão /2, que faz alusão ao ativador alternativa, a montante desta via particular. No nosso sistema,

TMPRSS2 /ERG

parece cumprir os critérios exigidos para este activador a montante.

AR desempenha um papel crucial na progressão do cancro da próstata e é conhecido por regular o

TMPRSS2

promotor, que constitui a parte reguladora do

TMPRSS2 /ERG

fusão. Além disso, a AR foi recentemente demonstrado sinergia com

TMPRSS2 /ERG

para promover o desenvolvimento de adenocarcinoma invasivo [20]. Assim, uma forte cooperação entre os dois era evidente em nosso sistema, já que cada gene não ativar e até mesmo ligeiramente reduzida

ZEB1 /2

expressão, enquanto co-expressão produziu uma indução de transcrição marcada destes genes (dados não mostrando). Da mesma forma, enquanto as células PE não conseguiu crescer

in vivo

seguinte células implantação ortotópica e EP-AR nódulos discretos formados, EP-AR

TMPRSS2 /ERG

células deram origem a tumores malignos grandes, sublinhando a natureza sinérgica da sua cooperação. Estudos recentes ligaram a AR EMT em modelos de cancro da próstata através da activação do eixo SNAI [41], [42]. Em nosso estudo, AR por si só não foi suficiente para induzir EMT, talvez devido ao fundo Caracol-esgotada. Assim, mais uma vez, pode-se especular que AR coopera com

TMPRSS2 /ERG

para invocar uma via EMT alternativa na ausência de caracol. O fato de que a expressão de ambos AR e

TMPRSS2 /ERG

no nosso sistema é regido pelos promotores artificiais, torná-lo inadequado para estudar AR induzida

TMPRSS2 /ERG

expressão. No entanto, este sistema pode representar o estágio hormônio refratário de câncer de próstata avançado em que AR é sobre-activada. Nossos dados implica que a cooperação entre a AR e

TMPRSS2 /ERG

não é mediada exclusivamente através da regulação da transcrição dependente de AR da ERG. Alternativamente, outros mecanismos, tais como componentes de mediação ou interações físicas, pode afectar a sua cooperação na progressão do cancro da próstata. Novos estudos devem ser focados em elucidar os mecanismos exactos pelos quais AR controles

TMPRSS2 /ERG

expressão e função.

Ambos SPINT1 e Il1R2 foram previamente implicado no cancro. Il1r2 foi relatado para ser significativamente elevados no plasma de pacientes com linfomas de Hodgkin ‘em comparação com controlos saudáveis ​​[43]. Além disso, a expressão forçada de

IL1R2

em uma linha de células uroepiteliais resultou numa alteração morfológica, rearranjo de actina e aquisição de capacidade migratória e

IL1R2

sobre-expressão foi associada com a expressão aumentada de

ZEB2 Comprar e redução da expressão de

CDH1

[35]. O nosso trabalho ainda corroborada

IL1R2

atividade pró-oncogênico que é mediado pelo

TMPRSS2 /ERG

trans-ativação direta. Recentemente, um estudo que comparou os tecidos e linhas celulares que representam diferentes fases do cancro da próstata, Spint1 foi altamente expressa em tecidos normais, em comparação com hiperplasia prostática benigna (BPH) e cancro de baixo grau, com uma perda progressiva no aumento espécimes grau do tumor [44 ]. Por conseguinte,

SPINT1

atenuação em linhas de células de cancro da próstata, resultou num fenótipo mais agressivo que inclui motilidade e invasividade aumentada [45]. Finalmente, SPINT1 knockdown na linha de células do câncer de pâncreas SUIT-2, induzida EMT e invasão que foram acompanhados por

ZEB2

elevação e

CDH1

redução [36]. Colectivamente, estes dados sugerem que SPINT1 actua como um supressor tumoral no cancro da próstata. Fomos capazes de mostrar que SPINT1 exerce parcialmente o seu efeito através da redução dos níveis de

ZEB2

e, portanto, é reprimido pela

TMPRSS2 /ERG

.

Recentemente, relatórios que incidem com a colaboração de

TMPRSS2 /ERG jogue com diferentes parceiros no processo canceroso estão emergindo [16], [19], [20]. (https://www.affymetrix.com/support/downloads/manuals/wt_sensetarget_label_manual.pdf).

Mircro-array