Abstract

O câncer gástrico é um dos tumores malignos mais comuns e tem uma alta taxa de metástase. Nós supomos que

NMe2

(Nucleosídeo Difosfato Cinase 2), o que tem sido anteriormente considerado como um gene de anti-metastática, desempenha um papel na invasão de células de cancro gástrico. Usando uma tecnologia de chip de tecido e imuno-histoquímica, foi demonstrado que a expressão NMe2 foi associada com níveis de diferenciação de células de cancro gástrico e o seu metástases nos nódulos linfáticos. Quando o

NMe2

produto do gene foi sobre-expresso por;

in vitro

transfecção estável, as células de BGC823 e linhas celulares de cancro gástrico MKN45 tinha reduzido as taxas de proliferação, migração e invasão através do colágeno matriz, sugerindo uma actividade inibidora de NMe2 na propagação e invasão de cancro gástrico. NMe2 poderia, portanto, grave como um marcador de risco para invasão câncer gástrico e um potencial novo alvo para terapia genética para melhorar ou induzir a expressão NMe2

Citation:. Liu Yf, Yang A, Liu W, Wang C, Wang M, Zhang L, et ai. (2015) NMe2 reduz a proliferação, migração e invasão de células de câncer gástrico para limitar metástase. PLoS ONE 10 (2): e0115968. doi: 10.1371 /journal.pone.0115968

Editor do Academic: Jian Cao, Stony Brook University, United States |

Recebido: 18 Abril de 2014; Aceito: 03 de dezembro de 2014; Publicação: 20 de fevereiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Este estudo foi apoiado pelo programa suporta para Chang-Jiang Scholars e Team Pesquisa inovativa em University (PCSIRT: IRT1137) e os Fundos pesquisa básica para as Universidades Central (lzujbky-2013-ct06). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação deste manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

Cancro permanece como a principal causa de morte, sendo responsável por 14,1 milhões de novos casos e 8,2 milhões de mortes em 2012 [1]. O número de novos casos são esperados para aumentar de 70% a nível mundial para 22 milhões nos próximos dois [2] décadas. Cancros do pulmão, estômago, fígado, cólon e seios têm a maior mortalidade [3]. células de cancro gástrico pode espalhar directamente aos órgãos adjacentes (invasão local), tais como o pâncreas, cólon transverso, o fígado e o baço, bem como para nodos linfáticos remotos, os pulmões, e tecido ósseo. Apesar de ser dois processos patológicos diferentes, invasão local e metástases à distância são interligadas onde o ex frequentemente promove e propaga o último. As mutações genéticas e seus produtos aberrantes são características-chave e facilitadores de células cancerosas para a proliferação, resistência à apoptose, invasão local, metástase, a evasão imunológica, angiogênese e resposta a danos no DNA.

NME

(Nucleosídeo Difosfato Quinase 2 ou células não-metastáticos) representa um grupo de genes de regulação de câncer e /ou associados ao câncer.

NME

consiste de uma família de 10 genes que também são conhecidos como o

nM23

genes [4] e tem sido associada com a supressão de metástase e invasão de câncer de tecido local [5]. Entre os membros desta família de genes,

NME1

e

NMe2

têm sido extensivamente estudadas por suas atividades de supressão de câncer.

NMe2

, o qual é mapeado no [6,7] cromossoma 17q21, codifica a subunidade B da quinase difosfato de nucleósido (PDN) [4]. O seu produto foi relatado como inibindo a metástase do cancro de mama e células de melanoma; e uma diminuição da sua expressão foi correlacionada com um maior potencial metastático destes cancros [8,9]. No entanto,

NMe2

superexpressão foi também associada a mau prognóstico para o neuroblastoma e osteossarcoma [10,11]. Além disso, o gene da

NMe2

não se correlacionou com a metástase do hepatocelular endometrial e carcinoma da tiróide [12-14]. Estes dados aparentemente conflitantes sugerem que NMe2 pode ter efeitos diferenciais em diferentes tipos de células cancerosas e sua capacidade de invadir tecidos circundantes localmente ou metástases para órgãos distantes.

Devido a estas diversas atividades NMe2 em diferentes tipos de câncer, analisamos tecidos removidos cirurgicamente a partir de doentes com cancro gástrico e associado a expressão NMe2 nestes tecidos com as suas características patológicas. Este estudo foi complementado por patologia

in vitro

experiências, nós examinamos onde as taxas de proliferação, migração e invasão de células gástricas cancerosas que foram transfectadas de forma estável com um

NMe2

ADNc humano para sobre-expressar o seu produto . Estes

in vitro

experimentos são projetados para compreender a capacidade de invasão das células cancerosas que expressam diferentes níveis de NMe2.

Materiais e Métodos

Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em a realização de pesquisas com seres humanos da Universidade de Lanzhou, School of Medicine. Os pacientes ou seus responsáveis ​​desde que o seu consentimento informado por escrito antes de serem recrutados para o estudo.

Tissue imunohistoquímica

Foram analisados ​​expressão NMe2 em câncer e adjacentes tecidos gástricos normais cirurgicamente removidos de 139 pacientes admitidos no Exército Hospital Regional na cidade de Lanzhou a partir de 2011 a 2012. Nenhum paciente recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. Estes tecidos de cancro removidos cirurgicamente foram processadas por coloração com hematoxilina e eosina (HE). Resumidamente, um módulo de cera foi perfurado 42 buracos abertura (6 × 7 furos /Chip) de 2 mm cada. blocos de tecido foram embebidas em esses buracos (uma amostra /orifício). Este módulo de cera foi então seccionado de modo que os tecidos de 40 pacientes puderam ser examinados simultaneamente em um único slide para garantir mancha uniformidade. Para o controlo, primeiro e último buracos foram embebidos com tecido do fígado não-cancerosas e rim, respectivamente. NMe2 expressão foi detectada utilizando um kit comercial imuno-histoquímica (Pequim ZSGB Biotecnologia Co, Ltd.) com um anticorpo anti-NMe2 humana de coelho (diluição 1: 300, Pequim Biossíntese Biotecnologia Co, Ltd.) de acordo com as instruções do fabricante. Níveis de expressão NMe2 foram numericamente marcou como mostra a Tabela 1 por um patologista que desconhecia as informações clínicas desses pacientes.

cultura de células e cDNA transfecção

Células da BGC823 e MKN45 linhas celulares de cancro gástrico foram adquiridos a partir da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). As células na linha BGC823 eram originalmente de um homem de 62 anos de idade com adenocarcinoma pouco diferenciado do estômago e aqueles na linha MKN45 derivada de uma massa metastática do fígado de uma mulher japonesa de 62 anos de idade com um adenocarcinoma indiferenciado o estômago. As células de ambas as linhas tinham níveis residuais de expressão NMe2 e são, por conseguinte, ideais para estudar o impacto do que sobre-expressam este produto de gene em células de cancro gástrico in

in vitro

.

As células foram cultivadas numa meio DMEM (Sigma, St. Louis, MO, EUA) contendo 10% de soro fetal de vitelo (Hangzhou Sijiqing Biological Engineering Materials Co., Ltd., Hangzhou, China), a 37 ° C com 5% de CO

2 e 95 % de ar. A 70-80% de confluência, as células foram transfectadas com um ADNc para o gene humano

NMe2

que foi clonado num vector pcDNA3.1 (Xangai GenePharma Co., Ltd. Xangai, China) utilizando lipofectamina 2000 como o transportador de ADN (Invitrogen, Grand Island, NY, EUA). As células que expressam de forma estável NMe2 (designado como NMe2) foram seleccionados por crescimento das células transfectadas em meio de DMEM contendo 1 mg /ml de G418. As células de controlo foram transfectadas com o vector pcDNA sem cDNA do

NMe2

inserção (designado como simulada) e foram submetidos à mesma seleção. células parentais Un-transfectadas foram também analisados ​​como controlos basais. Uma sobre-expressão de NMe2 foi determinada por RT-PCR para quantificar o nível de

NMe2

ARNm e por imunoblots de lisados ​​de células transfectadas, utilizando um anticorpo policlonal NMe2 (1:. Diluição cem, Pequim Biossíntese Biotecnologia Co, Ltd)

isolamento de ARN e RT-PCR

o ARN total foi isolado a partir de células transfectadas e não transfectadas utilizando um kit de isolamento de ARN comerciais (Takara Biotechnology, Dalian, China) de acordo com as instruções do fabricante. ARN (2 ug) de cada amostra foi sujeitos a transcrição reversa usando um Kit de PrimeScript RT seguindo o protocolo do fabricante. O ADN complementar reversamente transcrito a partir de RNA extraído a partir destas células foi amplificado por uma polimerase Taq usando os seguintes iniciadores para a

NMe2

ADNc: 5′-AAGCAGCACTACATTGACCTGAAA-3 ‘(directo) e 5’-3-GGTCTCCCCAAGCATCACTC ‘ (reverso). Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi também amplificado como controlo usando os seguintes iniciadores: 5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3 ‘(directo) e 5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’ (inverso). A reacção de amplificação foi iniciada por desnaturação de ADN a 95 ° C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturação do molde a 94 ° C durante 1 minuto, hibridação do iniciador a 60 ° C durante 1 min, e extensão do iniciador a 72 ° C durante 1 min. A superexpressão NMe2 foi quantitativamente definida como um aumento no

NMe2

mRNA por duas vezes ou mais a partir da linha de base definida por células sham transfectadas.

Imunofluorescência coloração do

NMe2

produto

células estavelmente transfectadas com o

NMe2

ADNc e um vector de veículo foram plaqueadas em lamelas de vidro e deixadas a crescer até confluência. Elas foram lavadas duas vezes com solução salina tamponada com fosfato gelada (PBS), fixadas em 4% de paraformaldeído em PBS durante 15 min, permeabilizadas com 0,5% de Triton X-100, e incubadas com 1% de albumina de soro bovino (BSA) durante 30 minutos para bloquear a ligação não específica. As células foram então incubadas com um anticorpo de coelho contra NMe2 humana (1: 100, Pequim Biossíntese Biotechnology) durante 24 h a 4 ° C, seguido por incubação com um anticorpo secundário conjugado com FITC (1: 100, Pequim Biossíntese Biotechnology) durante 1 hora . Todos os anticorpos foram diluídos em PBS contendo BSA a 1%. Os núcleos foram contrastadas com DAPI (1: 100 em PBS, 10 min à temperatura ambiente). As células

ciclo celular análise

expressam estavelmente células NMe2 e de controlo em cultura foram recolhidas e fixadas com 70% de etanol arrefecido em gelo a 4 ° C durante 24 h, lavadas duas vezes com PBS arrefecido em gelo, e, em seguida, tratou-se com RNase a (20 ug /ml) durante 30 min a 37 ° C. Elas foram incubadas com iodeto de propídio (10 ug /ml de concentração final) no escuro durante 30 min à temperatura ambiente antes da análise por citometria de fluxo para ploidia de DNA.

Colony-formação ensaio

transfectadas e as células de controlo foram cultivadas a uma densidade inicial de 1.000 células por prato de cultura de 100 mm num meio de DMEM completo para até quatro semanas. Eles foram, em seguida, coradas com violeta de metilo. Todas as colónias de células que eram maiores do que 2 mm de diâmetro (≥50 continha células) foram contadas em três pratos separados e expressos como média ± SEM. Para efeitos de validação de dados, que também contadas as células viáveis ​​que tinham sido cultivadas durante até 96 horas. Resumidamente, as células parentais BCG823 e MKN45 e células que foram transfectadas estavelmente com ou um

NMe2

ADNc humano ou o vector de veículo (PC-ADN 3.1) foram colocadas em placas a uma densidade de 2 x 10

4 células /ml. Eles foram destacadas 48-96 horas após a sementeira inicial com 1% de tripsina e centrifugadas a 1.600 x g. Os pellets celulares foram re-suspensas em PBS e incubadas com 0,04% de azul de tripano durante 3 min. células sobreviventes foram contadas num hemocitómetro.

Os ensaios para a migração de células

Dois ensaios complementares foram realizados para medir o impacto da superexpressão NMe2 sobre a taxa de migração celular. Primeiro foi um ensaio de cicatrização da ferida, em que as células foram plaqueadas em placas de 6 poços e deixou-se crescer a ≥ 95% confluentes. Depois de células lavando duas vezes com PBS, uma ponta de pipeta estéril foi usado para arranhar a monocamada de células (4-5 arranhões paralelos /placa). As células foram novamente lavadas com PBS, fotografado para marcar faixas riscados, e incubou-se com 2,5 ml de meio DMEM isento de soro. A uma taxa de migração celular basal, uma área riscada foi parcialmente coberta por células que migraram para a área lesionada de 24-48 h após a lesão, resultando em uma área livre de células menor. Uma vez que este ensaio de cicatrização da ferida é semi-quantitativa, os resultados foram ainda validado por um ensaio de migração de células Transwell. Resumidamente, 6 × 10

5 células em suspensão em 500 ul de meio isento de soro contendo 0,1% de BSA foram plaqueadas numa Transwell (BD Biosciences), que foi colocada numa placa de 24 poços. A câmara inferior continha 500 mL de meio DMEM completo. As células foram deixadas a crescer na câmara de topo, durante 24 horas para facilitar a migração de células a partir da câmara superior para a câmara inferior. No final deste período de incubação, a membrana na câmara superior foi fixado com 4% de paraformaldeído durante 30 min, lavou-se com água destilam, e seco ao ar. As células no lado oposto da câmara (transmigrou) foram coradas com 0,1% de violeta de metilo (Dade Behring-, Newark, DE) durante 30 min, lavou-se e visualizaram-se sob um microscópio-direita (x 400, Nikon). A migração celular foi definido como número de células na membrana em 5 campos de revisão aleatórios.

Ensaio para a invasão de células

Transwell câmaras foram revestidas com o tipo cauda de rato I fibrilar de colágeno [15] por 30 min a 37 ° C. O fluido em excesso foi removido e as câmaras revestidas foram secas ao ar durante 1 hora num ambiente estéril. As células foram suspensas em 500 ul de meio DMEM isento de soro contendo 0,1% de BSA a uma densidade final de 6 × 10

5 e plaqueadas sobre a matriz de colagénio em um transwell que foi colocada numa placa de 24 poços. A câmara inferior continha 500 mL de meio DMEM completo. As células permaneceram na superfície da membrana foram suavemente removidas 24 horas depois as células foram semeadas e a membrana foi fixada e corada para as células que tinham transmigrou através da matriz de colagénio para o lado oposto da membrana Transwell.

Análise estatística

Todos os dados foram analisados ​​utilizando o programa estatístico SPSS 20.0. valores quantitativos foram expressos como média e SEM. As seguintes análises estatísticas foram utilizados no estudo: teste exato ou o teste do qui-quadrado para definir a relação entre a expressão NMe2 e as características patológicas do tecido de câncer de Fisher; one way ANOVA para comparação dos grupos entre as células progenitoras e células transfectadas com um vector de veículo ou um ser humano

cDNA NMe2

; e Pearson análise de correlação entre a expressão NMe2 e diferenciação e metástase das células cancerosas.

Resultados

Associação de expressão NMe2 com características histológicas de câncer gástrico

Foram coletadas amostras cirúrgicas de 139 pacientes com adenocarcinoma gástrico. A Tabela 2 lista as informações demográficas desses pacientes e as características histológicas de tecido de câncer desses pacientes. NMe2 expressão foi fraca ou não foi detectada em tecido fracamente diferenciado, mas foi intensiva no tecido bem diferenciadas a um nível comparável ao tecido normal adjacente (Fig. 1). Um elevado nível de expressão NMe2 foi associada a uma taxa significativamente reduzido de metástases para os nódulos linfáticos (

P

= 0,038), mas não com o tamanho do tumor primário e a profundidade de invasão do cancro. A análise de correlação de Pearson mostraram que a expressão NMe2 foi independentemente associada com taxas de diferenciação celular (r = 0,436,

p

= 0,000) e se espalhou para os gânglios linfáticos locais (r = -0,281,

p

= 0,001, Tabela 1).

Uma detecção imunohistoquímica da expressão em tecidos de NMe2 mal (a), moderadamente (C), bem como (e) cancro gástrico diferenciada e tecido normal adjacente (G). A intensidade de expressão em tecido NMe2 bem diferenciado é semelhante à do tecido normal. O painel B, D, F, H são de que ele mancha de tecidos a partir dos mesmos blocos de amostras (barra = 100 uM). Estas imagens são representativas de lâminas de tecido de 139 pacientes incluídos neste estudo.

Efeito da NMe2 sobre a proliferação de células cancerosas gástricas na cultura

Para examinar ainda mais a associação de expressão NMe2 com características patológicas das células de cancro gástrico, estudámos células do BGC823 e MKN45 linhas de cancro gástrico, o que expresso fracamente NMe2 a um nível comparado com tecido de cancro fracamente diferenciado (Fig. 1). Estas células foram transf ectadas com um

NMe2

ADNc humano para sobre-expressar NMe2 quantitativamente como medido por um aumento na

NMe2

mRNA produto de proteína (RT-PCR quantitativa) e NMe2 (imunofluorescência, a Fig. 2 )

A B: perfis de RT-PCR de

NMe2

mRNA em simulação e

NMe2

-transfected BGC823 e células MKN45 câncer gástrico (BGC823 parental e células MKN45 como linhas de base [BL]). Níveis da

NMe2

mRNA a partir de 3 conjuntos separados de transfecções foram quantificados por densitometria (ANOVA, n = 3, *

p Art 0,05, em comparação à linha de base). coloração por imunofluorescência de NMe2 em não transfectadas (C M), simulada (D G) e NMe2 (E H) transfectadas BGC823 e células MKN45 (barra = 200 uM). A maioria das células NMe2-transfectadas são coradas positivas para a quinase, que é intensamente corada como dispersiva e /ou granular fluorescência verde principalmente no citoplasma, mas também detectáveis ​​no núcleo. Os padrões e níveis de expressão NMe2 diferem ligeiramente em que NMe2 em BGC823 células foi mais uniformemente distribuída no citoplasma, com coloração núcleo mais intensiva (E insert), enquanto NMe2 em células MKN45 era mais granular na distribuição, com a coloração relativamente menos núcleo (H inserir, n:. núcleo)

Em seguida, investigou como superexpressão do crescimento celular regulamentada NMe2 medindo a ploidia de DNA e formação de colônias destas células. Não se observaram diferenças no ploidia de DNA entre as células que sobre-expressam NMe2 e as células não-transfectadas e transfectadas por simulação de ambas as linhas (Tabela 3 e Fig S1.), O que sugere que um aumento na expressão NMe2 não teve efeito sobre os ciclos celulares. No entanto, as células que sobre-expressam-NMe2 tinha uma capacidade significativamente reduzida para formar colónias em cultura, em comparação com sham transfectadas e células não transf ectadas (Fig. 3). Esta observação foi validada pelos resultados de um método de contagem celular (Fig. 3C)

MKN45 (A) e BGC823 (B) células transfectadas com um

NMe2

ADNc humano ou um vector de veículo ( simulados), e não transfectadas células (BL) foram cultivadas durante 14 dias e, em seguida, analisadas quantitativamente para os números de colónias formadas (ANOVA, n = 3, *

P

0,05 comparado com as células parentais [BL]). (C) do número de células viáveis ​​em cultura BCG823 destes três tipos de células para até 96 horas (ANOVA, n = 3 /tipo de célula em cada ponto de tempo, *

P

0,05 comparado com as células parentais ).

Efeito da NMe2 sobre a migração e invasão celular

a seguir, avaliou a capacidade das células NMe2-superexpressão a migrar por causa de uma migração direcional é um pré-requisito importante para o invasão de células cancerosas para os tecidos circundantes. Esta migração direccional foi examinada utilizando um ensaio de cicatrização da ferida, que mede a taxa de migração de células para a área de lesão criada por um objecto pontiagudo. Como mostrado na Fig. 4A e 4B, a largura de uma área lesada após 48 horas em culturas foi maior para

NMe2

células -transfected do que para as células não-transfectadas e transfectadas por simulação. A migração lenta foi encontrado em células de ambas as linhas celulares, sugerindo que as células que sobre-expressam NMe2 migrado muito mais lento. Uma vez que este ensaio de cura da ferida é semi-quantitativo, que também quantitativamente medir a taxa de migração de células usando um ensaio Transwell. Consistente com o ensaio de cicatrização de feridas, as células que sobre-expressam NMe2 migrou a ~ 50% de células não transf ectadas ou transfectadas por simulação (Fig. 4).

BGC823 parental (A) e células MKN45 (B) e células que foram estavelmente transfectadas com um vector de veículo (simulada) ou um ser humano

NMe2

cDNA migram para as áreas de raspadinhas (definida por linhas de pontos) 48 horas após a lesão (painéis são imagens representativas de 3 conjuntos separados de experiências). Acampamento; D, a migração destas células foram também medida quantitativamente num ensaio Transwell (ANOVA, n = 3 /grupo, *

P

0,05 comparado com as células parentais [BL]).

Uma redução na migração de células poderia reduzir potencialmente a capacidade destas células para invadir tecido circundante. Para investigar esta possibilidade, medimos a invasão das células cancerosas à matriz de colágeno em um ensaio de câmara transpoço bem estabelecida. BGC823 células que sobre-expressos NMe2 reduziu significativamente a sua capacidade para invadir uma matriz de colagénio de 60% de células não-transfectadas e transfectadas por simulação (Fig. 5). A taxa de invasão foi igualmente reduzidas em MKN45 células transfectadas com o

NMe2

ADNc, em comparação com as células parentais e as transfectadas com um vector de veículo (Fig. 5).

parental, e mock-

NMe2

cDNA transfectadas BCG823 (a) e as células MKN45 (B) foram medidos para a invasão local, através da matriz de colágeno num ensaio transpoço. Painéis A (BCM823) e C (MKN45) são imagens instantâneas de células que invadiram através do colágeno-matriz para o outro lado da membrana em transpo� câmaras. Painéis B (BGC823) e D (MKN45) são resumos quantitativos de vários experimentos (ANOVA, n = 3, *

p Art 0,05 em comparação com células parentais [BL])

Discussão

Nós investigamos a relação entre a expressão e as características do câncer gástrico em tecidos removidos cirurgicamente de pacientes NMe2 e em células cultivadas a partir de duas linhas com câncer gástrico conhecidos. O estudo é necessário porque

NMe2

foi inicialmente identificado como o primeiro gene supressor de metástases, mas a sua capacidade para bloquear a invasão local do cancro e a metástase remota parece ser do tipo específico de célula entre os cancros que têm sido até agora estudados [8- 14]. Por exemplo, uma análise de 35 pacientes com carcinoma papilar da tireóide e 11 de linfonodos metastáticos mostraram um nível significativamente reduzido do

NME1

mRNA em gânglios linfáticos metastáticos, enquanto que

NMe2

mRNA não foi alterado nos nódulos linfáticos do tumor e original [14], sugerindo diferentes papéis de NME1 NMe2 e na invasão e metástase do cancro. Uma meta-análise de 278 pacientes com câncer de cólon, 177 com câncer de mama, 137 com câncer de ovário e 77 com câncer de pulmão também encontraram um nível reduzido de expressão NMe2 em câncer metastático em comparação com câncer não metastático [17]. No entanto, apesar de uma associação negativa entre a expressão NME1 /NMe2 e invasão de câncer para os linfonodos e infiltração endometrial local, expressão NME não foi associada com a pontuação TNM e a diferenciação de carcinoma membrana intra-uterino e câncer cervical [16]. Aqui, nós fornecemos várias linhas de evidência de que NMe2 limita a proliferação, migração e invasão da matriz extracelular das células de cancro gástrico.

em tecido bem diferenciado e menos invasiva Primeira, um maior nível de expressão NMe2 é encontrado de câncer gástrico removido cirurgicamente antes da quimioterapia e radioterapia em um grande grupo de pacientes (Tabela 1 a Fig. 1). A metástase do câncer para os linfonodos locais foi mais encontrada no tecido câncer que tinha um baixo nível de expressão NMe2 e essa correlação entre a expressão NMe2 e diferenciação /metástases nestes tecidos do paciente permanece depois que os dados foram estratificados por idade, sexo, a tamanho do tumor primário e profundidade da invasão (Tabela 1 2). Estes resultados são consistentes com um relatório recente que NMe2 liga o telômero fator 2 de ligação no núcleo para reduzir a atividade da telomerase [37], sugerindo uma ligação mecânica entre a expressão NMe2 e sobrevivência das células cancerosas de repetição.

Em segundo lugar, examinados os efeitos da sobre-expressão NMe2 sobre as taxas de proliferação, migração e invasão da matriz extracelular

in vitro

de células a partir de duas linhas celulares de cancro gástrico bem estudadas BGC823 e MKN45 [18-21]. A transfecção com um humano

NMe2

cDNA resultou em uma-duas vezes ou mais do nível de expressão NMe2 nestas células em comparação com células transfectadas zombar (Fig. 2). Esta sobre-expressão NMe2 não alterou ploidia de DNA (Tabela 3), mas retardou significativamente a formação de colónias destas células (Fig. 3), o que sugere que a sobre-expressam NMe2 atrasa uma transição de replicação do ADN para a mitose. Este resultado é consistente com relatórios anteriores que NMe2 não afecta o crescimento de células cancerosas em cultura e não está associada com o tamanho do cancro primário implantados em animais [22-27]. No entanto, é inconsistente com os relatórios que promove NMe2 [28,29] ou reduz [30], a proliferação de outros tipos de células cancerosas. razões exatas para a discrepância continua a ser investigado, mas estes dados sugerem efeitos específicos de um tipo de célula da

gene NMe2

sobre a patogênese da cânceres.

Em terceiro lugar, em contraste com um efeito mínimo sobre a proliferação de células de cancro gástrico, a sobre-expressão de NMe2 resulta uma redução significativa na migração celular e invasão por meio da matriz de colagénio, como demonstrado em três ensaios diferentes, mas complementares (Figs 4 . 5). Nossos dados confirmam descobertas anteriores de efeitos inibidores semelhantes sobre o cancro da mama [8], câncer de células escamosas oral [28] e células de melanoma [9], embora as exceções foram observadas novamente em hepatocelular [13,29] e células carcinomas colo-rectal [31]. Resta ser determinado como se a migração e a invasão de células que sobre-expressam-NMe2 reduzida são resultado de uma diminuição da capacidade destas células para a proliferação.

Os resultados identificaram células gástricas cancerosas como sensíveis a sobre-expresso NMe2, mas um questão crítica permanece como o que regula estas actividades diversas NMe2 entre os diferentes tipos de células cancerosas. Um potencial mecanismo que é uma actividade NMe2 depende de moléculas montante e a jusante que interagem com NMe2 num dado tipo de célula. Várias moléculas tenham sido previamente identificados para interagir ou regular NMe2, tais como EGFR,

c-erbB-2

,

c-erbB-3

e receptor de esteróides sexuais em carcinomas do ovário [32]. Placoglobina foi relatado para interagir com NMe2 para promover a sua expressão em células de carcinoma de células escamosas de língua humana [33]. NMe2 também foi encontrada para interagir com MDM2 (Rato dupla homólogo 2 minutos) para reduzir a motilidade das células de carcinoma renal [34]. MDM2 é uma ligase de ubiquitina-proteína E3 e serve como um regulador negativo do supressor de tumores p53. A relação entre o

NMe2

gene e genes de

myc

família parece ser mais complicada. Produtos da

NME1

e

NMe2

genes têm sido sugeridos para ser a jusante do c-

myc

via regulamentar [7] e envolvido na regulação negativa dos função Cdc42 em neuroblastoma [35]. NMe2 também é relatado para interagir com o ADN L-quadruplex no elemento de hipersensibilidade nuclease do

promotor de c-myc para induzir a expressão de c-myc [36]. Uma abordagem biologia de sistemas para examinar estas vias específicas em vez de moléculas individuais podem ser obrigados a dissecar funções do

NMe2

gene e seus produtos em diferentes tipos de cânceres.

Em resumo, demonstramos que uma superexpressão de NMe2 reduz a migração e invasão das células cancerosas gástricas à matriz celular

in vitro

. Como um resultado, a expressão NMe2 está associada com a histologia e bem diferenciada menos invasitve de cancro gástrico. Estes resultados sugerem que o

NMe2

gene e o seu produto pode servir como um marcador potencial para a previsão da capacidade de invasão do cancro gástrico e também como um alvo terapêutico, que pode ser regulada para cima por meio de terapia genética.

Informações de Apoio

S1 Fig. Efeito de sobreexpressão NMe2 no ciclo celular de células de cancro gástrico.

A ploidia de DNA de células transfectadas com

ADNc NMe2

foi analisada por citometria de fluxo, utilizando um kit comercial de acordo com as instruções do fabricante. Os painéis A-C foram para as células BCG823 parentais e as transfectadas com o

NMe2

cDNA ou vector. Os painéis D-F foram para MKN45 células com os mesmos tratamentos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0115968.s001

(DOC)