Abstract

O câncer de próstata é um líder de causa de morte relacionada com cancro nos homens. Apesar dos investimentos intensivos em melhorar o diagnóstico precoce, que muitas vezes escapa detecção oportuna. Mortalidade permanece alta no câncer de próstata em estágio avançado, onde os cuidados paliativos continua a ser a única opção. As estratégias eficazes são, por conseguinte, necessário para prevenir a ocorrência e a progressão da doença. compostos derivados de plantas têm sido uma importante fonte de vários agentes anti-câncer clinicamente úteis e oferecem uma abordagem atraente contra o câncer de próstata. Nós já mostrou que o extrato de Maytenus royleanus (MEM) deixa e respectivas fracções possuem atividade antioxidante significativa com potencial terapêutico contra danos associados de radicais livres. O presente estudo avaliou a actividade anti-proliferativa de MEM no sistema modelo de cancro da próstata. Análise de MEM e as suas várias fracções revelou a presença de triterpenóides, flavonóides e taninos, conjugado com um ou mais grupos polares e porções hidrato de carbono. Estudos adicionais em relação aos padrões conhecidos estabeleceu a existência de ácido caféico e quercetina 3-ramnosídeo em diferentes concentrações em diferentes frações do MAM. Tempo de análise decorrer do MEM trataram células de câncer de próstata indicaram diminuição significativa na viabilidade celular, avaliada por MTT e ensaios de sobrevivência clonog�icas. Isto foi acompanhado por prisão fase G2 do ciclo celular, regulação negativa da rede de ciclina /CDK e aumento em inibidores de CDK. MEM células tratadas exibiram clivagem de caspase-3 e PARP, e modulação de proteínas apoptóticos, que estabelece a apoptose como o principal mecanismo de morte celular. Notavelmente MEM suprimida AR /PSA de sinalização tanto em culturas de células de cancro da próstata e no modelo in vivo. A injecção intraperitoneal de MEM (1,25 e 2,5 mg /animal) a ratinhos atímicos nus implantados com células sensíveis CWR22Rν1 de androgénio mostrou uma inibição significativa no crescimento do tumor e a diminuição dos níveis de PSA no soro alternativos achados in vitro. Tomados em conjunto, nossos dados sugerem que MEM pode ser mais explorada por seus potenciais efeitos terapêuticos contra cancro da próstata progressão em humanos

Citation:. Shabbir M, Syed DN, Lall RK, Khan MR, Mukhtar H (2015) Potent anti-proliferativa, pró-apoptóticos Atividade da Maytenus Royleanus Extrato contra células cancerosas da próstata: Evidência em

In-Vitro

e

In-Vivo

Models. PLoS ONE 10 (3): e0119859. doi: 10.1371 /journal.pone.0119859

Editor do Academic: Ying-Jan Wang, da Universidade Nacional Cheng Kung, TAIWAN

Recebido: 12 de setembro de 2014; Aceito: 17 de janeiro de 2015; Publicação: 23 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Shabbir et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o apoio foi fornecido pelo Instituto Nacional de saúde /Instituto Nacional do Câncer RO1CA160867. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

apesar dos progressos no diagnóstico e tratamento, o câncer de próstata continua a ser um dos problemas de saúde mais comuns que afetam os homens durante a sua vida. Com efeito o cancro da próstata é a segunda principal causa de morte entre os homens nos Estados Unidos e em muitos países Ocidentais [1]. projeto de dados recentes que próstata, pulmão e cólon serão responsáveis ​​por cerca de metade de todos os cânceres recém-diagnosticados em homens em 2014, com câncer de próstata sozinha respondendo por cerca de 1 em cada 4 casos [2].

O receptor de andrógeno (AR) que pertence à super família de receptores nucleares desempenha um papel essencial no desenvolvimento, função e homeostase da próstata [3]. A presença de um ligando, tal como di-hidrotestosterona (DHT) e induz a fosforilação da mudança conformacional na AR, o que resulta na sua translocação nuclear, onde se liga a elementos de resposta em genes alvo de androgénio e regula a transcrição. A sobre-expressão de AR e sobre-regulação da sua actividade de transcrição são frequentemente observada no cancro da próstata avançado [4, 5]. terapia de privação de androgénio continua a ser o tratamento padrão para o tratamento da doença avançada. Apesar de uma resposta inicial favorável, quase todos os pacientes, invariavelmente, progredir para um fenótipo mais agressivo, resistente à castração. Os estudos sobre amostras de doentes mostram que a AR é expresso em quase todos os cancros da próstata, tanto antes como depois da terapia de ablação de androgénio [6]. Na verdade, antigénio específico da próstata (PSA), que é codificada por um gene de androgénio-responsivo, foi detectada na maioria dos cancros refractário a hormonas, indicando que a via de sinalização AR ainda é funcional nestes cancros [7].

Rastreio de PSA, em combinação com exame de toque retal e biópsia de agulha, têm melhorado a sobrevida dos pacientes, facilitando a detecção precoce da doença e localizadas. No entanto, a cura para a doença avançada e metastático é ainda ilusória [8]. Current abordagens de tratamento médico incluem cirurgia, terapia de radiação e quimioterapia, quer como monoterapia ou em abordagem multimodal [8]. O papel da dieta no cancro humano ganhou atenção considerável nas últimas décadas e resultou em uma mudança de paradigma na nossa compreensão da prevenção e tratamento do câncer. Há evidências emergentes de que a dieta, atividade física e peso corporal frequentemente denominado fatores balanço de energia são fatores importantes para modificar a progressão do câncer, e pode estar ligada ao aumento do risco de recorrência do câncer [9]. No momento, estão sendo realizados estudos para aumentar a nossa compreensão da relação entre dieta e câncer de próstata. nutrição óptima pode reduzir a incidência de cancro da próstata e pode ajudar a reduzir o risco da sua progressão. Incluindo alimentos coloridos, à base de plantas e manter um peso saudável têm sido apontados como importantes estratégias de nutrição para sobreviventes de câncer de próstata [10]. Um estudo recente mostrou que a baixa concentração de licopeno da próstata está associado ao desenvolvimento de cancro da próstata em pacientes com neoplasia intra-epitelial da próstata de alto grau [11]. A adesão à dieta mediterrânea composto de abundantes frutos, vegetais, legumes, nozes, cereais não refinados, azeite e quantidades moderadas de peixe foi associada à baixa mortalidade global após o diagnóstico de câncer de próstata não metastático [12].

Maytenus royleanus pertence à família Celastraceae, uma grande família que compreende de aproximadamente 100 géneros e 1300 espécies, amplamente distribuídos em todo o mundo. Várias espécies de Maytenus têm sido utilizados na medicina tradicional, para o tratamento de distúrbios gastrointestinais, febre, artrite, etc. [13, 14]. As actividades biológicas das espécies Maytenus são atribuídos à presença de diferentes classes de metabolitos secundários, tais como glicosidos fenólicos, flavonóides e triterpenos [15]. Em nossos estudos anteriores, que mostraram que o extrato de Maytenus royleanus (MEM) sai e suas frações derivadas possuía atividade antioxidante significativa com potencial terapêutico contra danos associados de radicais livres [15]. Aqui, estudou-se o efeito de MEM sobre a proliferação de células de cancro da próstata e demonstram que MEM inibe o crescimento e a viabilidade de ambas as células sensíveis e de cancro da próstata independente de androgénio andrógenos e exerce um efeito inibitório potente sobre a AR /PSA sinalização ambas as culturas de células in vitro e em vivo xenotransplantes tumorais.

Materiais e Métodos

Materiais

Os anticorpos contra cdk2, cdk4, cdk6, ciclina B1, ciclina D1, ciclina D2, ciclina e, p27, p21, PSA, Poly (ADP-ribose) polimerase (PARP), Bcl-2, Bax, Bak, Bcl-XL e AR foram obtidas a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Anti-rato e anti-coelho anticorpo secundário rábano conjugado per-oxidase foi obtida a partir de Amersham Pharmacia Ciências da Vida. O kit de ensaio de proteína Bio-Rad DC foi adquirido a Bio-Rad, CA. Novex pré-moldados de géis de Tris-Glicina foram obtidos a partir de Invitrogen. A anexina-V-FLUOS coloração Kit foi comprado da Roche.

Preparação de extrato vegetal

Folhas secas de MEM foram primeiramente pulverizado seguido de duas extracções com 95% de metanol. Filtrou-MEM foi seca por pulverização e suspenso em 50 ml de água destilada e as fracções foram preparadas em 200 ml de solventes com polaridade crescente isto é, n-hexano, acetato de etilo e n-butanol. Cada camada foi separada com agitação vigorosa e a sobra solúvel foi usada como fracção aquosa residual.

fitoquímica triagem

[A] análise de massa por espectrometria de cromatografia líquida.

MEM foi analisada por LC-MS para gerar uma impressão digital de fitoquímicos presentes na planta. amostra seca de MEM e as suas várias fracções foram dissolvidos em 15 mg /ml de metanol. partículas não dissolvidas foram removidas e 10 ul da amostra foi submetido a cromatografia em HILIC ionização negativa e de fase reversa (RP) em ambos os modos de ionização positivo e negativo para segmentar flavonóides e ácidos fenólicos. Para a separação HILIC, as amostras foram cromatograf icamente resolvido com Phenomenex Luna HILIC, 3 um, coluna 2x150mm em Agilent 1200 HPLC (Agilent, CA) com um auto-amostrador mantida a 5 ° C, utilizando o gradiente linear de 10 mM de formato de amónio (pH = 4,5) em água e 1 mM de formiato de amónio (pH = 4,5) em 99% de acetonitrilo ao longo de 45 minutos. Para a separação RP positivo, as amostras foram cromatograf icamente resolvido com Agilent ZORBAX 300SB-C18, 1.8μm, coluna 2.1x50mm num Agilent 1200 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA) com um auto-amostrador mantida a 5 ° C, utilizando o gradiente linear de ácido fórmico a 0,1% em água e 0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo ao longo de 60 min. Para a separação RP negativo, semelhante configuração do instrumento para o modo positivo foi usada como acima durante a mudança de fase móvel a um gradiente linear de 10 mM formato de amónio (pH 6,5) em água e 1 mM de formato de amónio (pH 6,5) em 99% de acetonitrilo ao longo de 45 minutos. A taxa de fluxo para ambos os modos de separação foi de 250 � /min.

[B] cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) de extracto de planta.

250 mg de pó de planta foi extraída com 10 ml de HCl a 25% e 25 ml de clorofórmio. O extracto foi filtrado e diluiu-se para 100 ml. 10 uL das amostras filtradas foram injectados no sistema de HPLC Agilent 1200. A separação foi efectuada através de uma coluna C18 equipado com um detector de UV-VIS Spectra-Focus, e injector automático de amostras). ácido trifluoroacético e acetonitrilo foram utilizadas como fases móveis com taxa de fluxo de 1 ml /min. ácido caféico e quercetina 3-ramnosídeo foram utilizadas como padrões internos para a detecção comparativa dentro das frações do MAM. As curvas de calibração foram gerados para ambos os compostos-padrão no intervalo de quantidade de amostra (0,02-0,5 ug). Todas as corridas foram realizadas em triplicado.

O tratamento de células

C

4-2 e células de carcinoma de próstata humana CWR22Rν1 foram adquiridos da ATCC (tipo americano Culture Collection). Ambas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Life Technologies, NI) suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina /estreptomicina, com 5% de CO

2, a 37 ° C. MEM dissolvido em DMSO foi usado para o tratamento de células. Células a uma confluência de aproximadamente 70% foram tratados com MEM em 10-100μg /ml durante 24 horas em meio completo de células em que a concentração final de DMSO utilizado para cada tratamento foi de menos de 0,1% (v /v).

viabilidade celular ensaio

3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazoliumbromide (MTT) foi utilizado para estudar o efeito de MEM sobre a viabilidade de C

4-2, PC3, DU145 e CWR22Rν1cell linhas. As células foram plaqueadas (1 × 10

4 células por poço) em 1 mL de meio de cultura completo contendo concentrações 10-200μg /ml de MEM em placas de microtitulação de 24 poços. Após a incubação num incubador humidificado durante 24 horas a 37 ° C, 200 ul de MTT (5 mg /ml: 1XPBS) foi adicionado a cada poço e incubou-se durante duas horas, após o que se adicionou 200 ul de DMSO. As placas foram então centrifugadas (1800 x g durante 5 min a 4 ° C). A absorvância a 540 nm foi registada num leitor de microplacas. O efeito de inibição do crescimento em MEM foi calculada como% da viabilidade celular em que as células tratadas com DMSO foram tomados como controlo a 100%.

ensaio clonogénico

O efeito do tratamento sobre a sobrevivência clonogénica de células de cancro da próstata foi determinada utilizando o ensaio de formação de colónias. Ambos CWR22Rν1 e C

4-2 células foram tratadas com concentrações crescentes (20, 40 60 � /ml) de MEM em meio RPMI-1640 completo. Após o tratamento, as células foram re-plaqueadas em triplicado numa placa de cultura de tecidos de 6 poços com 5000 células /poço e cultivadas em 5% de CO2 a 37 ° C durante 8 dias com meio de crescimento ser substituído com /sem MEM a cada 2 dias. As células foram depois coradas com 0,5% de violeta de cristal (em metanol: H

2O; 1: 1) e as imagens foram tiradas com uma câmara digital. As imagens foram aprimoradas usando o Adobe Photoshop para o brilho, contraste e afiada para a uniformidade da aparência.

ciclo celular análise /apoptose por citometria de fluxo

CWR22Rν1 e C

4-2 células tratadas com MEM (20-60μM: 24h) em meio completo foram tripsinizadas e fixados em paraformaldeído a 1%: 1XPBS durante uma hora e lavou-se duas vezes com PBS frio e centrifugadas. O sedimento foi suspenso em etanol a 70% arrefecido e armazenado durante a noite. Em seguida, as células foram centrifugadas durante 5 min a 1000 rpm, e o sedimento obtido foi lavado duas vezes com PBS frio para remover o etanol. As células foram marcadas com FITC e iodeto de propídio utilizando o kit Apo-directo (BD Pharmagen, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. A análise foi realizada com um FACScan (Becton Dickinson, NJ). Cerca de 10.000 células por amostra foram recolhidas e os histogramas de ADN foram analisadas com o software ModFitLT (verdade Software House, ME).

extracção de proteína e a análise por Western blot

Após o tratamento com MEM de lise gelado tampão foi adicionada às células (50 nmol /litro de Tris-HCl, 150 mmol /l de NaCl, 1 mmol /l de EGTA, 1 mmole /litro de EDTA, 20 mmol /l de NaF, 100 mmol /litro de Na3VO4, 0,5% de Nonidet P-40, 1% de Triton X-100, 1 mmol /l de PMSF, pH 7,4) com inibidores de protease (Calbiochem, Alemanha) incubados sobre gelo durante 20 min. Para os geles de Western blotting poli acrilamida a 8-12% foram usadas para resolver 40 � de proteínas, transferidas para uma membrana de nitrocelulose, sondado com anticorpos monoclonais primários apropriados, e detectados por autorradiografia quimioluminescência após incubação com anticorpos secundários específicos.

a análise da expressão do gene

o ARN total foi isolado a partir de células utilizando um kit RNeasy comercial concentração de RNA (Qiagen, CA) foi medida espectrofotometricamente a 260 nm e o ADNc foi feita, seguindo o protocolo do fabricante. A mistura de reacção foi preparada contendo 10 � FastStart Universal SYBR verde mestre (Roche, Alemanha), iniciadores reversos 6μM, e 10 ng de ADNc, com ARNase livre de água adicionada para um volume total de 20 uL. A análise amplificação e em tempo real foi feito por 40 ciclos com seguintes fatores; 95 ° C (10 min), a fim de ativar da polimerase Fast Start Taq DNA; 60 ° C (1 min) para a amplificação e análise em tempo real. Os níveis de expressão de genes foram determinadas usando 2

-ΔΔCT. sequência de iniciador utilizadas foram; AR Senso 5′-CTGGACACGACAACAACCAG-3 ‘; AR anti-sentido 5’-CAGATCAGGGGCGAAGTAGA-3 ‘; GAPDH Sense 5′-AAGGTCGGAGTCAACGGATTTGGT-3; GAPDH Antisense 5’-ACAAAGTGGTCGTTGAGGGCAATG-3 ‘.

imunofluorescência microscopia

C

4-2 e células CWR22Rν1 foram semeadas em um com duas câmaras lâminas de cultura de tecidos de vidro e tratadas com 40 � /ml de MEM a 70% de confluência, durante 24 h. Após lavagem com PBS as células foram fixadas com paraformaldeído a 2% seguido de permeabilização com metanol e bloqueio com 2% de soro. A incubação durante a noite com anticorpos primários foi seguido de incubação com o fluoróforo adequado etiquetado anticorpos secundários. Antifade DAPI (Invitrogen, EUA) foi usada como meio de montagem e contracoloração. Para análise, foi usada Bio-Rad radiante 2100 MP sistema de arco-íris para imagiologia biológica. Para detectar células apoptóticas e necróticas a Anexina-V-Fluos Staining Kit (Roche, Suíça) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante. Zeiss LSM 410 microscopia confocal foi utilizada para medir a fluorescência. As células coradas com anexina-V e as células não coradas em um campo selecionado foram contadas para determinar a extensão da apoptose e necrose.

PSA ELISA

Para a determinação quantitativa dos níveis de PSA no C

4-2 e CWR22Rν1 células PSA humano ELISA kit (Anogen, Ontário, Canadá) foi utilizado de acordo com o protocolo do fabricante.

Declaração de ética para estudos com animais

foram realizados estudos atímicos camundongos nus de acordo com as diretrizes institucionais para o cuidado e uso de animais e foram aprovados pelo animal Care e do Comitê Use, Escola de Medicina e Saúde Pública da Universidade de Wisconsin-Madison.

In vivo tumor modelo de xenotransplante

atímicos (nu /nu) ratos nus masculinos obtidos a partir NxGen Biosciences (San Diego, CA) foram alojados em condições livres de patógenos (luz 12h /12h horário de escuro) e alimentados com uma dieta ad libitum autoclavado. Foram selecionados CWR22Rν1 células para determinar os efeitos in vivo de MAM como estas células formam tumores rápida e reprodutível em ratinhos nus. A implantação de células CWR22Rν1 também é responsável pela secreção de quantidades significativas de PSA na corrente sanguínea do hospedeiro. xenoenxertos de tumores em ratinhos foram estabelecidos por injecção subcutânea de células CWR22Rν1 (1 × 10

6) misturado com Matrigel (Collaborative Biomedical Products, MA) numa proporção de 1: 1. Dezoito animais foram seleccionados aleatoriamente em três grupos que consistem em seis animais cada. O primeiro grupo de animais considerados como grupo controle recebeu DMSO intra-peritoneal (i.p.). Os animais dos grupos 2 e 3 receberam i.p. injecção de MEM, 1,25 mg e 2,5 mg por animal, respectivamente, duas vezes por semana ao longo do estudo e o peso corporal, dieta, e o consumo de água foram registados. O volume do tumor foi calculado pela fórmula 0,5238 × L1 L2 x A x (L1 = diâmetro de comprimento, L2 = diâmetro curto, e H = altura do tumor) e os tamanhos do tumor foram medidos duas vezes por semana. Os animais foram sacrificados utilizando o método de inalação de CO2 seguindo orientações Arac, quando o volume do tumor atingiu a ~ 1.200 milímetros

3. As amostras de sangue foram recolhidas por o sangramento mandibular e separação do soro a partir do sangue completo foi armazenado a -20 ° C. Os níveis de PSA do soro foram ensaiadas pelo kit ELISA de PSA descrito acima. H E slides de pulmão, rim, fígado, coração e cérebro coradas foram preparados para examinar os possíveis efeitos tóxicos do tratamento MEM

Imunohistoquímica

seções tecidos tumorais foram coradas com hematoxilina e eosina para. visualização morfológica. Além disso, os tecidos fixados em formalina a 10% foram submetidos a análise imuno-histoquímica. Resumidamente, após desparafinização em tampão de citrato de sódio, as secções foram incubadas durante a noite com anticorpos contra a caspase-3 clivada e Histona 3-fosfato (P-H3) [1:75] (Cell Signaling, MA) seguido de incubação com o apropriado conjugado com HRP secundário anticorpos, diamminobenzidine /DAB (DAKO, CA) coloração e contra coloração com hematoxilina. Após a montagem com Permount, as secções foram cobertas com lamelas e coloração foi analisada por um patologista experiente cego para os grupos de tratamento.

Análise Estatística

Toda a análise estatística foi realizada com GraphPad Prism (San Diego , CA) e p valores . 0,05 foram considerados significativos

resultados

análise fitoquímica de MEM

MEM junto com n-hexano, butanol, acetato de etila e aquosa residual As fracções foram separadas por análise de LC-MS. Esta técnica foi usada principalmente para gerar uma impressão digital da composição fitoquímicos do MAM. O extracto parece ser uma mistura complexa de fitoquímicos desconhecidos como visto no cromatograma do pico base da cromatograma HILIC (-ve) (Fig. 1). O prazo de HILIC MEM mostrou a presença de 164 compostos com base nos picos de base geradas de vez em massa e retenção molar dos compostos (Fig 1A;. De dados anexas como S1_Dataset). Estendendo a mesma análise dos dados para as outras fracções no modo de HILIC (-ve), a fracção de n-butanol continha 79 compostos, enquanto o acetato de etilo e n-hexano fracções mostrou 69 e 40 respectivamente, compostos. RP C18 (-ve) cromatograma da fracção aquosa residual mostrou a presença de 84 compostos, enquanto o HILIC (-ve) mostrou 83 compostos. Com base nas provas preliminares obtidos a partir dos dados de LC-MS, descritas acima (Fig. 1A), foi realizada uma análise mais aprofundada para categorizar os compostos constituintes de MEM, utilizando detectores de arranjo de díodos de UV-. O ácido cafeico e quercetina-3-ramnosido foram identificados por comparação da sua UV e espectros de MS para os padrões internos correspondentes. Os espectros de UV das fracções de n-hexano, acetato de etilo e n-butanol, revelou a presença de ácido cafeico e quercetina-3-ramnosido em concentrações variáveis ​​indicando que MEM com elevado teor de flavonóides com actividade anti-cancro conhecida (Fig 1B;. S1 Fig ).

a. Tabela mostrando o número total de compostos encontrados em MEM e suas várias frações com HILIC e cromatografia C18 RP, com base no tempo de retenção e massa molar; Total de cromatogramas iónicos de várias fracções: fracção de acetato de etilo (HILIC -vos); fracção de n-butanol (HILIC -vos); n-hexano fracção (HILIC -vos); fracção aquosa (HILIC -vos); fracção aquosa (-ve C18 RP). b. UV cromatogramas de acetato de etilo n-hexano e n-butanol fracções de MEM, a 280, 320 370 nm, com ácido caféico e quercetina normas internas de 3 ramnosídeo.

MEM inibe o crescimento ea viabilidade das células de câncer de próstata

Uma vez que ambos estes compostos são conhecidos por possuir actividades anti-câncer , foi perguntado se o próprio extracto seria mais eficaz na inibição do crescimento e da viabilidade das células de cancro da próstata. Para investigar o potencial anti-proliferativa de MEM, realizou-ensaio de 3- (4, 5-dimethythiazol-2-il) -2, 5-difenil tetrazólio (MTT) contra andrógeno-sensível (C

4-2 e CWR22Rν1) e andrógeno-independente (PC3 e 145 DU) células cancerosas da próstata. Observou-se que o tratamento MEM (10-180μg /ml durante 24 h e 48 h) para as células de cancro da próstata causado inibição do crescimento celular de um modo dependente da dose. análise de curso de tempo revelaram que existia uma diferença de apenas modesto entre a diminuição de viabilidade celular de células às 24 h e 48 h, sugerindo que as células de cancro da próstata responderam ao tratamento MEM dentro de 24h. Tal como mostrado na (Fig. 2A), o CI

50 valores de CWR22Rν1 tratou-MEM foram 47,4 42 ug /ml; para C

4-2, 52,8 44,4? G /ml; para PC3, 61,8 36 ug /ml; e para DU145, 90,6 88,2 ug /ml para 24 e 48h, respectivamente. Os dados sugerem que sensível ao androgénio células C

4-2 e CWR22Rν1 mostrou ligeiramente melhor sensibilidade ao tratamento de MEM DU145 e PC3cells (Fig. 2A). ensaio clonogênica validado ainda mais estes resultados, onde CWR22Rν1 e C

4-2 células tratadas durante sete dias com MEM a 20, 40 60 ug /ml mostrou uma inibição dependente da dose significativo de formação de colónias em relação aos controlos não tratados (Fig. 2B). As diferentes fracções de MEM separadas na base de polaridade em diferentes solventes, como n-hexano, acetato de etilo, n-butanol e água também foram investigados para o seu efeito inibidor do crescimento em células CWR22Rν1. O n-hexano e as fracções aquosas provou ser mais potente na inibição da proliferação de células CWR22Rν1 (20 36μg /ml) em comparação com o butanol e as fracções de acetato de etilo (39,6 66.8μg /mL). (Fig. 2C)

a. células de cancro da próstata foram tratados com MEM de 24 /48h, e a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT. Tabela mostra o IC

50 de

CWR

22Rν1, C

4-2, PC-3 e DU145 às 24 e 48h. Média ± SD de experimentos realizados em triplicado é mostrado. b. efeito dose-dependente de MEM em clonogenecity de

CWR

22Rν1 e C

4-2 células detectadas por ensaio de formação de colónia. Os pormenores são descritos em métodos de materiais. c. Efeito de várias fracções (n-hexano, acetato de etilo, N-butanol e aquosas) sobre a viabilidade de

CWR

22R ν1 células, determinada pelo ensaio de MTT. * P 0,05 e ** p . 0,01 foi considerado estatisticamente significativo

MEM induz prisão fase G2 de células cancerosas da próstata

Para avaliar o perfil do ciclo celular da próstata tratados com MEM células de cancro foi realizada a análise de citometria de fluxo e observado o efeito sobre a distribuição de MEM ciclo celular. Um aumento dependente da dose significativo na população de células na fase G2 do ciclo celular foi observada como resultado do tratamento em MEM CWR22Rν1 e C

4-2 células. A distribuição do ciclo celular fase G2 para C

4-2 foi de 25,7%, 44,61%, 59,52% e 38,6% para CWR22Rν1was, 47,72%, 57,72% e a 20, 40 e 60μM concentrações de MEM, respectivamente (Fig. 3A; Fig S2). O aumento da população de células de fase G2 foi acompanhado por uma redução simultânea na fase G0 /G1 e população de células da fase S. A seguir, examinou o efeito de MEM no ciclo celular moléculas reguladoras operatórias na fase G2 do ciclo celular. A análise de imunotransferência mostrou que o tratamento MEM para C

4-2 e CWR22Rν1 resultou numa diminuição da expressão de proteínas de cdk 2, 4 6 e ciclinas B1, D1, D2 E em comparação com os controlos não tratados (Fig 3A e 3B; FIG). S3. Isto foi associado com a indução notável de p21 e p27 em células MEM tratados (Fig 3D;. S3 Fig).

a.

CWR

22Rν1 e C

4-2 células tratadas com MEM durante 24 horas foram coradas com iodeto de propidio e analisadas por citometria de fluxo. Percentagem da população de células em G2-fase do ciclo celular é mostrado na caixa de cada histograma. Média ± SD de experimentos realizados em triplicado é mostrado. b-d. Efeito do tratamento MEM em proteínas reguladoras do ciclo celular: lisados ​​de células inteiras de

CWR

22Rν1 e C

4-2 células com /sem MEM (20-60 ng /ml: 24h) foram submetidos a SDS electroforese em gel de poliacrilamida. Carga igual foi confirmada por reprobing com GAPDH. Os imunotransfer�cias mostrados são representativos de três experiências independentes, com resultados semelhantes.

MEM induz a apoptose através da ativação da via intrínseca e extrínseca

Para examinar se a diminuição observada na viabilidade celular está ligado a indução de apoptose foi realizada coloração de anexina de MEM tratadas células de cancro da próstata. Utilizou-se a Anexina V etiquetada com FITC, que tem uma afinidade forte e específica para fosfatidilserina, para monitorizar a sua translocação para a membrana plasmática. MEM células tratadas mostraram um aumento significativo na fluorescência verde em contraste com os controlos não tratados, indicando que o tratamento com MEM induziu apoptose em células de cancro da próstata (Fig S4). A análise de citometria de fluxo foi então realizada para quantificar o número de células que sofrem apoptose como um resultado de tratamento MEM. Um aumento dependente da dose significativo na população de células apoptóticas foi observada em ambas as linhas celulares, resultantes de tratamento MEM (Fig 4A;. S4 figura). A análise de imunotransferência foi empregue próxima para estudar a expressão de proteínas envolvidas na apoptose celular. A caspase-3, um membro da família de proteases de cisteína caspase-aspartato específica desempenha um papel central na execução do programa apoptótico. A PARP-1 é um dos vários substratos celulares conhecidas de caspases, clivagem de PARP-1 por caspases é considerado como uma característica da apoptose [16]. MEM células tratadas mostraram um aumento da expressão da caspase-3 activada; associado com a clivagem de PARP (Fig 4B;. S5 fig) mais a validação de que a apoptose é o principal mecanismo de morte celular induzida por MEM. Para investigar se a apoptose induzida MEM é mediada através da activação das vias intrínsecas e extrínsecas que próxima estudada a expressão das caspases -8 e -9 em células tratadas MEM. Encontrámos uma indução de caspase-8 clivado em células tratadas com 20, 40 e 60 ug /ml de MEM (Figura 4C;. S5 figura). diminuição concomitante na pro-forma de Caspase-9 e Bid em CWR22Rν1 e C

4-2 células, o tratamento pós MEM sugeriu ativação de ambas as vias extrínsecas e intrínsecas da apoptose. Foi avaliado o efeito do extracto sobre a família Bcl-2 de proteínas, envolvidos na apoptose. células tratadas MEM mostraram um aumento na expressão de pró-apoptótica Bax e Bak e uma diminuição na expressão de anti-apoptótica de Bcl-2 e Bcl-X

proteínas G (Fig 4D;. S5 figura).

a.

CWR

22Rν1 e C

4-2 células tratadas com MEM (20-60 ug /ml: 24h) foram marcados com FITC e analisados ​​por citometria de fluxo. Percentagem de células em apoptose com a dose correspondente de MEM é mostrado em cada histograma. Média ± SD de experimentos realizados em triplicado é mostrado. b-d. Os lisados ​​de células totais de

CWR

22Rν1 e C

4-2 células com /sem MEM (20-60 ug /ml: 24 h) tratamento foram sujeitos a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Efeito do tratamento de MEM em proteínas envolvidas em vias de apoptose. Carga igual foi confirmada por reprobing com GAPDH. Os imunotransfer�cias mostrados são representativos de três experiências independentes, com resultados semelhantes.

MEM diminui AR e expressão PSA em células de câncer de próstata

Os andrógenos desempenham um papel importante no desenvolvimento e progressão do câncer de próstata e PSA, um gene de androgénio-responsivo bem conhecida actualmente é o marcador mais aceite para a avaliação da progressão do cancro da próstata em humanos [17]. O efeito do tratamento sobre a expressão MEM AR e PSA foi examinada em CWR22Rν1and C

2/4 linhas celulares que empregam imunotransferência e RT-PCR. Uma diminuição significativa na expressão da proteína AR foi observado com o tratamento MEM (Fig 5A e 5B;. S6 figura). coloração por imunofluorescência de CWR22Rν1 C

4-2 células mostraram localização nuclear diminuição da AR em MEM células tratadas em relação ao controle (Fig. 5B) .A CWR22Rν1 e C

4-2 células cancerosas da próstata apresentam níveis elevados de proteínas de PSA intracelular, como evidenciada por uma banda de PSA de 34 kDa (Fig. 5A). O efeito dependente da dose de MEM em sub

4-2 células CWR22Rν1 C e resultou numa diminuição significativa nos níveis de proteína de PSA em 20, 40 e 60 ug /ml concentrações (Figura 5A;. S6 figura). A diminuição na expressão da proteína foi acompanhada por níveis de transcrição reduzidos de AR em Mem trataram células (Fig 5C;. S6 FIG). Determinou-se ainda mais os níveis de PSA secretada em CWR22Rν1 e C linhas

4-2 celulares, empregando a técnica de ELISA sanduíche quantitativo. Uma redução significativa nos níveis de PSA foi observado em ambas as linhas celulares com MEM (40 ug /ml) o tratamento (Fig. 5D).

a. Os lisados ​​de células totais de

CWR

22Rν1 e C

4-2 células com /sem MEM (20-60 ug /ml: 24h) foram sujeitos a electroforese em gel de SDS-poliacrilamida. Carga igual foi confirmada por reprobing com GAPDH. Os imunoblots apresentados são representativos de três experiências independentes com resultados semelhantes. b. c. d. e. b. c. d. b. b.