Sumário

Quimiocinas CXCL12 e receptor CXCR4 emergiram como alvos terapêuticos promissores para o câncer de ovário, uma doença que continua a ter um prognóstico sombrio. CXCL12-CXCR4 sinalização unidades proliferação, a sobrevivência e a invasão de células de cancro do ovário, o que leva ao crescimento de tumores e metástases. efeitos pleiotrópicos de CXCR4 em vários passos-chave no cancro do ovário sugerem que o bloqueio desta via irá melhorar os resultados para os pacientes com esta doença. Para quantificar CXCL12-CXCR4 de sinalização em ensaios baseados em células e modelos de ratinho vivo de cancro do ovário, foi desenvolvido um repórter de luciferase complementação vermelho escaravelho que detecta a activação dos receptores CXCR4 com base no recrutamento da proteína citosólica adaptador β-arrestina 2. Tanto em dois culturas de células dimensionais e tridimensionais, estabelecemos que a bioluminescência de este repórter mede a activação dependente de CXCL12 de CXCR4 e a inibição desta via com AMD3100, um clinicamente aprovado molécula pequena que a ligação blocos CXCL12-CXCR4. Nós usamos este sistema de imagem para quantificar CXCL12-CXCR4 sinalização em um mouse modelo de cancro do ovário metastático e mostrou que o tratamento com AMD3100 interrompido esta via

in vivo

. A terapia de combinação com cisplatina AMD3100 e diminuiu significativamente a carga do tumor em ratinhos, embora as diferenças na sobrevivência total não foram significativamente maiores do que o tratamento com qualquer um dos agentes em monoterapia. Estes estudos estabelecem um sistema repórter imagiologia molecular para a análise de CXCL12-CXCR4 de sinalização no cancro do ovário, o que pode ser utilizado para investigar a biologia e direccionamento terapêutico desta via em ensaios baseados em células e ratinhos que vivem

citação:. E Salomonnson , Stacer AC, Ehrlich a, Luker KE, Luker GD (2013) Imagiologia CXCL12-CXCR4 Sinalização na terapia do cancro do ovário. PLoS ONE 8 (1): e51500. doi: 10.1371 /journal.pone.0051500

editor: Shannon M. Hawkins, Baylor College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 23 Agosto, 2012; Aceite: 1 de novembro de 2012; Publicação: 23 de janeiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Salomonnson et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. A investigação foi apoiado por bolsas de Institutos Nacionais de Saúde (NIH R01CA136553, R01CA136829 e P50CA093990) e do Departamento de Defesa (W81XWH-09-1-0128). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Quimiocinas CXCL12 (SDF-1) ea sua CXCR4 receptor estão fortemente implicados como principais determinantes da iniciação do tumor e metástases intraperitoneal de câncer de ovário [1]. CXCL12 é secretado por ≈70-90% das células de cancro do ovário, bem como células de mesotélio no peritoneu de ratos e humanos [2] [3] [4] [5]. Os pacientes com os mais altos níveis de expressão CXCL12 em células de câncer de ovário têm um prognóstico significativamente pior, enfatizando a importância biológica desta molécula sinalizadora na progressão da doença [6]. Efeitos da CXCL12 em cancro do ovário parece ser mediada por CXCR4, um dos dois receptores de quimiocina conhecidos para este. A amplificação de CXCR4 é um evento precoce em transformação maligna de células epiteliais do ovário, o que sugere que CXCL12-CXCR4 é crítico para a patogénese da doença [7]. Aproximadamente 60% dos pacientes com cancro do ovário tem o CXCR4 nas células malignas, e estes pacientes têm reduzido significativamente a sobrevivência geral [4]. CXCL12 sinalização através CXCR4 promove a proliferação, invasão e metástase de células de cancro do ovário, todos os quais contribuem para a doença mais agressiva. Os efeitos adversos da CXCL12 no cancro do ovário, também pode ser devido aos efeitos sobre o compartimento estromal do microambiente do tumor, incluindo a angiogénese aumentada e recrutamento de células imunossupressoras [8] [9] [10] [11].

central funções de CXCL12-CXCR4 sinalização em células malignas e a posição microambiente do tumor este eixo de sinalização como um alvo chave para melhorar a terapia para pacientes com câncer de ovário. Em modelos de ratos, nós e outros têm mostrado que o bloqueio CXCL12-CXCR4 sinalizando com interferência de RNA contra CXCL12 ou uma pequena molécula inibidora da CXCL12-CXCR4 ligação (AMD3100) limita o crescimento de implantes de células de cancro do ovário [12], [13], [14 ]. A inibição de sinalização CXCL12-CXCR4 também prolonga a sobrevivência de ratinhos com cancro do ovário. No entanto, os efeitos da terapia de agente único são modestos, sugerindo que a segmentação CXCL12-CXCR4, em combinação com um outro agente pode ser mais benéfico.

O estabelecimento de um composto que efectivamente atinge o seu alvo pretendido é essencial para o desenvolvimento de fármacos no pré-clínica modelos e ensaios clínicos. Para a análise farmacodinâmica dos agentes de direccionamento CXCL12-CXCR4 sinalização em modelos de ratos com câncer de ovário, foi desenvolvido um repórter luciferase complementação clique besouro para a imagem e quantificar ativação e inibição desta via

in vivo

. Neste sistema, o CXCR4 e o adaptador da proteína citosólica β-arrestina 2 são fundidas com amino inactivo (QBRN) e carboxi (CBC) fragmentos terminais de escaravelho vermelho da luciferase. O repórter medidas de activação CXCL12 de CXCR4 sinalização com base em recrutamento do citosólica proteína adaptadora β-arrestina 2 a este receptor. Recrutamento de β-arrestina 2 é um evento comum, no início da activação de receptores de quimiocina e a maior família de sete receptores transmembranares [15]. Com o sistema de complementação de luciferase, as interacções entre o CXCR4 e β-arrestina 2 Reconstituir clique activa besouro da luciferase para produzir luz, proporcionando uma métrica de imagiologia para CXCR4 sinalização em células intactas, esferóides culturas tridimensionais, e ratos vivos. Os esferóides são um importante intermediário entre ensaios de cultura celular padrão bidimensional e xenoenxertos de tumor uma vez que os esferóides de tumor reproduzem de difusão restrita de compostos em tumores e a formação de esferóides cancro do ovário em fluido ascítico de pacientes. Desde luciferase complementação é reversível, este repórter de imagem também pode ser usado para medir os efeitos de compostos que bloqueiam CXCL12-CXCR4 sinalização

in vitro

e

in vivo

.

Nós usado repórter de imagem para analisar CXCL12-CXCR4 de sinalização no cancro do ovário e estabelecer que AMD3100, um inibidor de molécula pequena de CXCR4, a activação do receptor blocos no microambiente tumoral. Usando este sistema de imagem, determinou-se que a terapia de combinação com cisplatina AMD3100 e diminuiu significativamente a carga global do tumor num modelo de ratinho de cancro do ovário humano com metástases intraperitoneais. Esses resultados estabelecer um novo método de imagem molecular para analisar CXCL12-CXCR4 sinalização no cancro do ovário e sugerir possíveis benefícios terapêuticos da combinação de inibição selectiva desta via receptor de quimiocinas com medicamentos quimioterápicos padrão.

Materiais e Métodos

os plasmídeos

Para gerar fusões de CXCR4 com o fragmento N-terminal de escaravelho vermelho da luciferase (QBRN) (Promega), foi amplificado por PCR o CXCR4 e o produto clonado nos locais XhoI e AgeI de EGFP-N1 (Clontech). Utilizou-se PCR para amplificar a sequência de ADN para os aminoácidos 2-413 de escaravelho vermelho da luciferase (QBRN) e clonado deste produto em locais AgeI e NotI de EGFP-N1 [16]. Esta estratégia de clonagem remove EGFP a partir do vector. Nós amplificada a sequência de aminoácidos 395-542 da luciferase de escaravelho (CBC) por PCR e clonado o produto nos locais AgeI e NotI de EGFP-N1 para criar uma fusão com a extremidade C-terminal de β-arrestina 2 (presente de Robert Lefkowitz). Para transferir as construções a partir da espinha dorsal de EGFP-N1 a FUW vector lentiviral, utilizou-se PCR para amplificar a sequência de ADN alvo e adicionar locais XbaI para clonagem. Construções utilizadas para este estudo estão resumidos na Figura 1 (Fig. 1A), e iniciadores de PCR utilizados para clonagem estão listados na Tabela 1.

A) Painel mostra vectores lentivirais e células transduzidas estavelmente utilizados para estudos de imagiologia. B) Diagrama esquemático do sistema de complementação vermelha clique besouro. fragmentos N- e C-terminais de escaravelho vermelho da luciferase são fundidos ao C-terminais de CXCR4 e β-arrestina 2, respectivamente. ligação a CXCR4 CXCL12 provoca recrutamento de β-arrestina 2 ao receptor ativado, reconstituindo clique besouro luciferase vermelho para produzir luz.

Células

HeyA8 células de cancro do ovário (desde por Gordon Mills, MD Anderson Cancer Center) foram estavelmente transduzidas com lentivírus recombinantes para CXCR4-CBRN e Ar-CBC (HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC) [17]. Usamos transdução lentiviral para estabelecer populações de células HeyA8 estavelmente expressando CXCL12 fundidos a

Gaussia

luciferase (HeyA8-CXCL12-GL), não fundido

Gaussia

luciferase (Hey-GL), e luciferase de pirilampo e proteína verde fluorescente (GFP) (HeyA8-FL /GFP) [18], [19]. Nós também transduzidas células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC e HeyA8-CXCL12-GL com proteína fluorescente eqFP650 [20]. A Figura 1 mostra uma lista de células transduzidas estavelmente utilizadas neste estudo (Fig. 1A). Todas as células foram mantidas em DMEM com 10% de soro fetal de bovino, 1% de glutamina e 0,1% de penicilina /estreptomicina.

A citometria de fluxo

As células intactas foram coradas com um anticorpo para o CXCR4 (clone 12G5 , R D Systems) ou controlo de isotipo correspondente, tal como descrito anteriormente para revelar os níveis da superfície da célula deste receptor [21]. As células não coradas a partir de cada população de células foram utilizados como controlos de compensação para citometria de fluxo.

Western blotting

As células foram cultivadas em meio contendo soro de 1% durante a noite e em seguida estimuladas durante 10 minutos com várias concentrações de recombinante CXCL12-α (R D Systems) para a activação de AKT. Para determinar a activação dependente de CXCL12 de ERK1 /2, que trataram células privadas de soro com 100 CXCL12-α ng /mL para 0, 5, 15, ou 30 minutos, na presença de controlo do veículo ou 1 uM AMD3100, uma pequena molécula inibidora de CXCR4 (Tocris). Os lisados ​​celulares foram transferidas para AKT fosforilado ou fosforilado ERK1 /2 (Cell Signaling) como descrito anteriormente [19]. As manchas foram retirados e re-sondados para AKT total ou quase total de ERK1 /2 como um controlo de carga. Nós também utilizado Western blot para determinar a expressão de endógena β-arrestina 2 e β-arrestina 2-CBC em células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC (Cell Signaling). As membranas foram retirados uma hora adicional e re-sondados para gliceraldeído fosfato desidrogenase (GAPDH) como um controlo adicional de carregamento. Medimos intensidades de bandas com ImageJ e valores divididos por AKT fosforilada por AKT total e GAPDH. Realizamos cálculos semelhantes para fosforilada ERK em relação ao ERK total e GAPDH. Para ambos AKT fosforilada e ERK, normalizamos todos os valores para as células não tratadas com CXCL12.

Dois experimentos de cultura de células dimensional

Nós banhado a 1,5 × 10

4 HeyA8-CXCR4-CBRN /células Ar-CBC por poço em placas de 96 poços parede pretas um dia antes dos ensaios. Mudamos meio do meio de cultura padrão para DMEM com 1% de soro para experimentos. Incubámos células para aumentar os períodos de tempo com 100 CXCL12-α ng /mL (R D Systems) ou durante 60 minutos com concentrações crescentes de quimiocina. Em experiências seleccionadas, as células foram incubadas com AMD3100 para inibir a ligação ao CXCR4 ou controlo de veículo em concentrações listadas na Figura lendas CXCL12. Nós adicionou-se 150 ug /ml de luciferina (Promega) aos poços e depois quantificado bioluminescência de células vivas utilizando um IVIS 100 (Perkin Elmer). A bioluminescência de luciferase de escaravelho foi quantificada tal como descrito anteriormente e normalizada para a proteína total por cavidade quantificado por coloração com sulforodamina B [19]. Os dados foram expressos como valores médios ± SEM por luminescência em relação aos controles não tratados.

Spheroids

Spheroids foram formados em 384 poços que penduram placas gota semeando um total de 2 × 10

4 HeyA8 células por poço [22]. Foram utilizados dois tipos diferentes de esferóides: 1) células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC misturadas com um número igual de células HeyA8-CXCL12-GL para ensaio de activação e inibição da sinalização de CXCR4; ou 2) células HeyA8-FL /GFP combinadas com números iguais de células, quer HeyA8-CXCL12-GL GL-HeyA8 ou, respectivamente, por ensaios de viabilidade celular em resposta cisplatina. Para as experiências com AMD3100, concentrações crescentes de composto foram adicionados a esferóides um dia após a sementeira em placas pendurado gota. Incubámos esferóides com AMD3100 ou veículo para um ou dois dias antes da quantificação de bioluminescência. HeyA8 células-FL /GFP em células esferóides com qualquer HeyA8-GL-CXCL12 ou HeyA8-GL foram tratados durante um ou dois dias com concentrações crescentes de cisplatina. Foram quantificados de fluorescência a partir de um espectro de eqFP650 IVIS antes da quantificação de bioluminescência após a adição de 6 ug /ml de luciferina para cada esferóide. Nós normalizou bioluminescência fluxo de fótons de fluorescência radiância para explicar as diferenças no número de células.

Os estudos em animais

Todos os procedimentos com animais foram aprovados pela Universidade de Michigan Comitê para o Uso e tratamento dos animais. Os animais foram comutada para ração livre de clorofila (Dietas Investigação) para todos os estudos para minimizar a fluorescência de fundo em estudos de imagem. 2,5 × 10

5 células cada uma das células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC e HeyA8-CXCL12-GL foram injetados por via intraperitoneal em 100 mL de NaCl 0,9% em 5-7 semanas de idade NOD fêmea /SCID

IL2rγ

– /- ratos do sexo feminino (Taconic). Para inibir a CXCL12 ligação ao CXCR4, utilizou-se cinco dias, 1,0 mL /hora bombas osmóticas (para a experiência ilustrada na Fig. 5) ou de 14 dias, 0,5 mL /hora bombas osmóticas (para a experiência ilustrada na Fig. 6) (Alzet) carregado com 25 mg /ml AMD3100 ou 0,9% de NaCl de controlo com veículo. Estas bombas fornecem 1,25 ou 0,625 ug AMD3100 /g /hora para cada ratinho. As bombas foram implantadas em momentos indicados no texto para cada figura. Para estudos de tratamento mostradas na Figura 6, que os ratos injectados com 4 mg /kg de cisplatina i.p. ou veículo combinado cada 5 dias. Cisplatina ou veículo PBS injeções continuou durante todo o período de duas semanas que bombas de infusão osmótica estavam no local. Todos os ratinhos receberam composto activo (AMD3100 e /ou cisplatina) ou veículo combinado para ambas as vias de entrega (bomba de infusão osmótica e injecção i.p.). Como exemplos, os ratinhos de controlo receberam veículo bombas osmóticas com NaCl a 0,9% e i.p. injecções de PBS, enquanto que os ratinhos no grupo de tratamento tiveram AMD3100 bombas osmóticas com AMD3100 e i.p. PBS.

Mouse imaging

imagem de bioluminescência foi realizada em um espectro IVIS (Perkin Elmer). imagens de fluorescência e de imagem de luciferase luciferina com besouro foram realizados como descrito anteriormente [23]. dados de imagem foram quantificados como brilho de fluorescência ou de fluxo de fótons, respectivamente. Os dados para click beetle luciferase vermelho complementação foram normalizados para carga total do tumor por meio de fluorescência de eqFP650.

Estatísticas

Gráficos e análises estatísticas foram preparadas com GraphPad Prism. estudos de cultura de células foram realizados 3-5 vezes, enquanto que estudos com animais foram realizados duas vezes. Os dados foram representados como valores médios com desvio padrão da média (SEM). Os pares de dados foram analisados ​​pelo teste de Mann-Whitney U para determinar diferenças estatisticamente significativas. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram analisadas por Gehan-Breslow-Wilcoxon teste.

Resultados

Clique repórter complementação besouro para a interação de CXCR4 e β-arrestina 2

CXCL12 ligação a resultados receptor CXCR4 no recrutamento da proteína citosólica adaptador β-arrestina 2 para o receptor activado. À imagem e quantificar este passo chave na transdução de sinal, foi utilizado um ensaio de complementação fragmento de proteína recentemente descrita com base em cliques besouro luciferase vermelho [16]. Neste sistema, o CXCR4 é fundida com o fragmento N-terminal de luciferase de escaravelho (CXCR4-QBRN) e β-arrestina 2 para o fragmento C-terminal desta enzima (Ar-CBC) (Fig. 1B). Recrutamento de β-arrestina 2 a CXCR4 também reúne fragmentos de luciferase para produzir bioluminescência como uma medida quantitativa desta interação de proteínas na sinalização CXCR4.

Nós transduzidas HeyA8 células cancerosas do ovário com vetores de lentivírus para CXCR4-CBRN e Ar- CBC. células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC AKT fosforilado em resposta à incubação com a CXCL12 como determinado por transferência de Western, que mostra que estas células activado um efector a jusante conhecido de CXCL12-CXCR4 (Fig. 2A). Em comparação com as células parentais HeyA8, células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC mostrou uma maior activação de AKT em resposta a CXCL12, consistente com a transdução de CXCR4 funcional adicional para as células repórter de imagem. Também demonstramos que as células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC mostram a activação dependente do tempo do quinases ERK1 /2, que foi inibido por uma concentração saturante (1 uM) de AMD3100 o inibidor de CXCR4 (Fig. 2B). células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC sobreexpressam β-arrestina 2-CT em relação à proteína endógena, tal como determinado por Western blotting.

) HeyA8 células A-CXCR4-QBRN /Ar-CBC e HeyA8 parental eram tratadas com concentrações crescentes de CXCL12 durante 10 minutos. Western blot de lisados ​​celulares totais mostra AKT fosforilada e total, respectivamente. Foi utilizado GAPDH como um controlo de carga. Gráfico mostra intensidades de banda relativa para AKT fosforilada em cada linha de células normalizada para AKT total e GAPDH. B) células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC foram tratados com 100 CXCL12-α ng /mL para 0, 5, 15, ou 30 minutos, na ausência ou na presença de 1 uM AMD3100. Os lisados ​​celulares totais foram sondadas para ERK1 fosforilado total e /2, respectivamente. Os lisados ​​foram também analisados ​​por Western blot para expressão de β-arrestina 2-CBC e endógena β-arrestina 1 e 2. GAPDH é mostrada como um controlo de carga. C) A citometria de fluxo de expressão de CXCR4 em várias linhas celulares HeyA8 utilizados neste estudo. linha escura e as linhas tracejadas em histograma denotam controle isotipo e coloração com anticorpo CXCR4.

Nós usamos citometria de fluxo para avaliar a expressão na superfície celular de CXCR4 em células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC, como bem como células HeyA8 parentais e células transduzidas estavelmente com

Gaussia

luciferase (HeyA8-GL), CXCL12 fundido a Gaussia luciferase (HeyA8-CXCL12-GL) ou luciferase de pirilampo e GFP (HeyA8-FL-GFP). Todas as células expressaram níveis similares de CXCR4 na superfície celular (Fig. 2C). Embora transduzidas com CXCR4-QBRN, HeyA8-CXCR4-QBRN /células Ar-CBC tinham níveis de CXCR4 na superfície celular que eram comparáveis ​​às células parentais HeyA8, provavelmente, porque a sobre-expressão de β-arrestina 2 internalização causas deste receptor da superfície da célula. [24], [25].

unidades CXCL12 complementação entre CXCR4 e β-arrestina 2

Para estabelecer que a bioluminescência de HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC medidas células de ativação da sinalização CXCR4 , nós tratamos culturas em monocamada de células com estas concentrações crescentes de CXCL12 durante 60 minutos. Nós tratada culturas paralelas de células com uma concentração inibitória (1 uM) de AMD3100 o inibidor de CXCR4 ou controlo de veículo durante o período de incubação [26] [27]. O tratamento com CXCL12 produziu um aumento dependente da concentração na bioluminescência de associação de CXCR4-QBRN e Ar-CBC, atingindo pico indução de 3 vezes a 1 ug /ml de CXCL12 (Fig. 3A). Por comparação, as células tratadas com AMD3100 mostrou apenas bioluminescência basal, sem resposta a CXCL12.

) células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-A CBC foram plaqueadas como culturas bidimensionais em placas de 96 poços e incubou-se com o aumento concentrações de CXCL12-α na presença de 1 uM AMD3100 ou controlo de veículo. Os dados foram representados graficamente como valores médios de luminescência relativa a células não tratadas com a CXCL12 (n = 4 para cada condição). As barras de erro representam SEM. B) células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC foram tratados com 100 ng /ml de CXCL12, por períodos de tempo crescente, na presença de 1 uM AMD3100 ou controlo de veículo. Os dados foram representados graficamente como valores médios ± SEM para luminescência relativa a células não incubadas com CXCL12 (n = 4 para cada condição). *, P 0,05; ** P . 0,01

Nós também incubadas células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC com 100 ng /ml CXCL12 e AMD3100 ou veículo de controlo 1 M para aumentar períodos de tempo através de 4 horas antes de medir a actividade da luciferase. Relativamente às células não tratadas, as células incubadas com 100 ng /ml de CXCL12 e controlo de veículo apresentaram aumentos dependentes do tempo na bioluminescência, atingindo um máximo de cerca de indução de 2 vezes em 2 horas e, em seguida, declínio modesto (Fig. 3B). AMD3100 efeitos da CXCL12 na complementação bioluminescência entre CXCR4-CBRN e Ar-CBC completamente bloqueada. Colectivamente, estes estudos mostram que a bioluminescência a partir de células HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC responde a CXCL12 e estabelecer que este sistema repórter pode quantificar a inibição da sinalização de CXCL12-CXCR4.

efeitos de drogas na cultura esferóide

estudos recentes sugerem que esferóides e sistemas de cultura celular tridimensional semelhantes são modelos mais fisiológicos de drogas segmentação e eficácia, devido a fatores que incluem interações intercelulares diretos e difusão restrita de compostos [28], [29]. Além disso, as células de cancro do ovário em pacientes formar esferóides em ascite, o que representa uma barreira potencial para entrega da droga [30]. Para modelar o microambiente do tumor de câncer de ovário

in vivo

, usamos esferóides de HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC células combinadas com números iguais de células HeyA8-CXCL12-GL, reproduzindo o câncer de ovário humano, no qual tumor células secretam CXCL12 e /ou expressar CXCR4. Enquanto as células HeyA8 parentais não expressam CXCL12 como determinado por qRT-PCR (dados não mostrados), as células HeyA8-CXCL12-GL segregam cerca de 12 ng /ml de CXCL12 num período de 24 horas, o que é comparável com os valores obtidos para outras células de cancro do ovário que segregam este quimiocina endogenamente [19] [31]. Foram tratados esferóides com concentrações crescentes de AMD3100 durante 24 horas antes de se quantificar a bioluminescência. Em relação ao esferóides tratados com o controle do veículo, AMD3100 inibida bioluminescência de associação de CXCR4-CBRN e Ar-CBC. A actividade de luciferase a partir do repórter complementação diminuiu ≈50% em esferóides tratados com 1 uM AMD3100 (p 0,05) (Fig. 4A). Observam-se resultados semelhantes quando estendida incubações a dois dias com AMD3100 (dados não mostrados). Inibição de CXCR4, como quantificado pelo ensaio de complementação, foi menos eficaz em comparação com esferóides como cultura em monocamada, sugerindo que tridimensional limites Arquitectura penetração de AMD3100 para todas as células. No entanto, notamos que as culturas esferóides testar os efeitos da exposição crônica a CXCL12 em vez de adição agudo de quimiocinas como foi feito na cultura bidimensional, que também podem contribuir para diferenças na eficácia de AMD3100.

A) culturas Spheroid de células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC e HeyA8-CXCL12-GL foram tratadas durante 24 horas com concentrações crescentes de AMD3100. Os dados foram representados graficamente como valores médios ± SEM de luminescência para click beetle complementação em relação ao esferóides tratados apenas com veículo de controlo (n = 10 esferóides por condição). B) células HeyA8-FL-GFP foram cultivadas como esferóides com células HeyA8-CXCL12-GL ou HeyA8-GL e, em seguida, tratada com concentrações crescentes de cisplatina durante 24 horas. Os dados foram representados graficamente como valores médios ± SEM para a luciferase do pirilampo de luminescência relativa para esferóides não tratados com cisplatina (n = 10 esferóides por condição). *, P . 0,05

Testamos efeitos protectores da CXCL12 contra a citotoxicidade da cisplatina, um quimioterápico padrão para câncer de ovário. Para estes ensaios, foram utilizadas células-FL HeyA8-GFP, as quais expressam endogenamente o CXCR4 (ver Fig. 2C). actividade da luciferase do pirilampo é directamente proporcional ao número de células tumorais, proporcionando um ensaio fácil para a viabilidade celular em esferóides intactas [32]. Geramos esferóides que combinam células HeyA8-FL-GFP com células HeyA8-CXCL12-GL GL-HeyA8 ou, respectivamente, e depois tratou-se esferóides com concentrações crescentes de cisplatina durante 24 horas. Em esferóides contendo células HeyA8-CXCL12-GL, as células HeyA8-FL-GFP foram protegidos modestamente contra os efeitos citotóxicos da cisplatina, embora apenas a 10 uM fizemos detectar diferenças significativas na citotoxicidade em relação ao esferóides contendo células HeyA8-GL (p 0,05) (Fig. 4B). O grau de citotoxicidade era comparável seguintes tratamentos com drogas durante 48 horas (dados não mostrados). Esses estudos mostram que CXCL12 confere uma protecção muito modesto contra a cisplatina em esferóides composto exclusivamente de células de cancro do ovário.

In vivo

imagem de CXCR4 e β-arrestina 2 complementação no cancro do ovário

Nós usamos um modelo de xenotransplante tumoral humana de câncer de ovário intraperitoneal metastático para determinar em que medida complementação entre CXCR4 e β-arrestina 2 detecta a activação CXCR4 e inibição

in vivo

. Nós co-injectado um número igual de células HeyA8-CXCL12-GL HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC e intraperitoneal em ratos e usou imagem de bioluminescência para quantificar recrutamento de β-arrestina 2 a CXCR4. Em condições basais, que facilmente observado bioluminescência de complementação entre HeyA8-CXCR4-CBRN e Ar-CBC (Fig. 5A), indicando a sinalização CXCR4 ativo em células malignas. Nós, então, separados aleatoriamente ratos em grupos tratados por cinco dias com AMD3100 ou controle do veículo entregue a partir de bombas de infusão osmótica. Não houve evidência de toxicidade fenotípica em ratinhos tratados com AMD3100. Os ratinhos tratados com AMD3100 teve relativamente menos crescimento de células de cancro do ovário do que os animais que receberam apenas veículo como controlo quantificado por fluorescência de proteína fluorescente vermelho longínquo eqFP650 expresso em células malignas (Fig 5B.) (P 0,05). Usando fluorescência de eqFP650 para normalizar as diferenças nos números totais de células de cancro do ovário, a bioluminescência de interacção de CXCR4-CBRN com Ar-CT foi significativamente menor nos ratos que receberam AMD3100 por cinco dias, em comparação com o controlo de veículo. Colectivamente, estes dados mostram a utilidade deste sistema de imagem para medir a segmentação farmacológico da CXCL12-CXCR4 efeitos resultantes do crescimento do tumor sinalização e

in vivo

(Fig 5C.) (P 0,05).

A) imagens representativas de ratos com implantes intraperitoneais de HeyA8-CXCR4-CBRN /células HeyA8-CXCL12-GL Ar-CBC e. As imagens foram obtidas antes e após 5 dias de tratamento com bombas osmóticas contendo AMD3100 ou controlo de veículo. barra de escala representa gamas de valores de fluxo de fótons exibidos nas imagens PseudoColor. B) A fluorescência a partir de células de cancro do ovário foi medida em ratinhos tratados com veículo ou o controlo AMD3100 vivo. gráfico mostra os valores médios + SEM de fluorescência relativa aos valores medidos no dia 0 antes de iniciar o tratamento. As setas mostram o período em que as bombas osmóticas foram no lugar. C) quantificado de dados de fluxo de fótons de escaravelho vermelho complementação em ratinhos tratados com AMD3100 ou controlo de veículo, respectivamente. Os dados foram normalizados para a fluorescência do tumor para cada ratinho e representada graficamente como valores médios ± SEM (n = 7 ratinhos por grupo). *, P . 0,05

A terapia combinada com AMD3100 e cisplatina reduz a carga tumoral

Nós anteriormente demonstrado que a terapia de agente único, com AMD3100 melhora sozinho modestamente sobrevida de ratos com intraperitoneal disseminada câncer de ovário [14]. Colocámos a hipótese de que a terapia combinada com AMD3100 e um fármaco quimioterapêutico padrão iria melhorar significativamente o controlo do tumor e a sobrevivência, com base em estudos que mostram que em leucemia CXCL12 no microambiente tumoral confere resistência a fármacos citotóxicos convencionais [33]. Para testar esta hipótese, implantado camundongos com células HeyA8-CXCL12-GL HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC e. Uma semana após a implantação de tumores nos murganhos ao acaso em quatro grupos de tratamento: 1) de controle do veículo; 2) AMD3100 entregue por bombas de infusão osmótica de duas semanas; 3) cisplatina administrada como 4 mg /kg i.p. a cada 5 dias; e 4) combinado AMD3100 e cisplatina. Continuamos injecções de cisplatina durante o período de entrega de duas semanas de AMD3100 bombas e depois descontinuado todas as terapias.

Nós usamos bioluminescência de HeyA8-CXCR4-CBRN /Ar-CBC analisar CXCR4 sinalização

in vivo

e fluorescência de imagiologia para eqFP650 para quantificar a carga tumoral ao longo do tempo. Calculou-se a área sob a curva para a bioluminescência e fluorescência e proporções destes parâmetros utilizados para avaliar a inibição de CXCR4 ao longo do tempo (Fig. 6A). Ratos tratados com AMD3100 ou a combinação de AMD3100 e cisplatina tiveram significativamente menor bioluminescência de CXCR4-CBRN e Ar-CBC complementação em relação à carga global tumor, mostrando que esta droga bloqueia com sucesso CXCR4 sinalização em células de cancro do ovário

in vivo

(p 0,01)

a) Área sob a análise da curva de dados de imagem para relações de complementação clique besouro luciferase vermelho para o CXCR4 e β-arrestina 2 normalizado para eqFP650 fluorescência (carga tumoral) nos ratos implantados com HeyA8. -CXCR4-CBRN /Ar-CBC e HeyA8-CXCL12-GL células. Os dados são mostrados para os grupos tratados com o controlo do veículo, AMD3100, cisplatina, ou ambos AMD3100 e cisplatina, durante duas semanas com início uma semana após implantação de células. gráfico mostra os valores médios + SEM (n = 7 ratos por grupo). *, P 0,05. B) Área sob a curva de análise de fluorescência de eqFP650 produzido por células de cancro do ovário implantados ao longo do curso do experimento. gráfico mostra os valores médios + SEM. *, P 0,05, **, P 0,01. curvas C) de Kaplan-Meier para a sobrevivência de ratinhos tratados com veículo, AMD3100, cisplatina, ou AMD3100 e cisplatina. Todos os grupos de tratamento diferente do controlo do veículo (p 0,05). Mas não umas das outras

Os ratinhos tratados com agente único, a cisplatina tinha AMD3100 ou modesto, mas significativo, a redução da carga tumoral medida por imagem de fluorescência ao longo o curso da experiência (P 0,05) (Figura 6B.). Por comparação, a terapia de combinação com ambas AMD3100 cisplatina e reduziu significativamente o número total de células HeyA8-CXCR4-QBRN /Ar-CBC relativos ao veículo de controlo ou qualquer um dos fármacos sozinhos (p 0,01 e P 0,05, respectivamente). Estas diferenças eram evidentes, embora os ratinhos receberam apenas duas semanas de tratamento com estas drogas. Os ratos implantados com células de cancro do ovário HeyA8 desenvolvido ascite, mas não houve diferença nos pesos corporais global entre vários grupos de tratamento (dados não mostrados). Houve uma tendência para a sobrevivência melhorada nos camundongos tratados com tanto AMD3100 e cisplatina (Fig. 6C). No entanto, as diferenças entre AMD3100, cisplatina e AMD3100 combinados e cisplatina não foram significativas, embora todos os tratamentos aumento de sobrevivência em relação ao veículo de controlo (p 0,05).

Discussão

O câncer de ovário continua a ser o líder causa de morte por doenças malignas ginecológicas com uma sobrevida global em cinco anos de ≈50%. O mau prognóstico de cancro do ovário é em parte devido ao facto de que a maioria dos pacientes apresentam com doença avançada associada com intraperitoneal, fígado, ou metástases sistémicas [34]. cancro do ovário, inicialmente, é sensível à quimioterapia com drogas à base de platina, embora a maioria dos doentes com recaída com células tumorais resistentes a drogas em aproximadamente um ano.