Abstract

Segmentação está se tornando uma importante nova área de atuação farmacêutica. Consequentemente, uma busca sistemática para definir se há dependências específicas fonte de energia nos tumores, e como estes podem ser ditadas por condução mutações genéticas a montante, é necessário. A via de sinalização de PI3K-AKT-mTOR tem um papel seminal na regulação de diversos processos celulares, incluindo a proliferação celular e sobrevivência, mas também tem sido associada com a desregulação metabólica. Neste estudo, buscou-se definir como mutações dentro

PI3KCA

pode afetar a dependência metabólica de uma célula cancerosa, utilizando linhas celulares isog�nicas precisamente engenharia. Os estudos revelaram assinaturas de expressão gênica em

PIK3CA

células mutantes indicativos de um aumento da regulação consistente da glicólise. Curiosamente, os genes para cima e para baixo-regulado variada entre modelos isogénicas, sugerindo que o nó principal de regulação não é a mesma entre os modelos. Alterações na expressão de genes adicionais foram também observadas, sugerindo que outros do que a glicólise vias metabólicas, tais como glutaminolysis, também foram afectadas. estudos de nutrientes dependência revelou que o crescimento da

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células mutantes é altamente dependente de glicose, Considerando que a dependência glutamina é independente do

Status PIK3CA

. Além disso, a dependência de glicose exibido pela

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células mutantes não pôde ser substituído pela suplementação com outros nutrientes. Esta dependência específicas para a glicose para o crescimento foi ainda ilustrado pelos estudos para avaliar os efeitos da ruptura direccionada da via glicolítica utilizando siRNA e também foi encontrado para estar presente entre um painel mais vasto de linhas celulares de cancro abrigando

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mutações endógenos. Em conclusão, descobrimos que

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mutações levam a uma mudança para um fenótipo altamente glicolítica, e que apesar das sugestões de que as células cancerosas são adeptos a utilização de fontes alternativas de nutrientes,

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células mutantes são não é capaz de compensar a retirada de glicose. Compreendendo as dependências metabólicas do

PIK3CA

cancros mutantes irá fornecer informações importantes para a concepção de terapias eficazes e estratégias de visualização tumor

Citation:. Foster R, Griffin S, Grooby S, Feltell R, Christopherson C, H Chang, et al. (2012) Várias alterações metabólicas existe em cancros Mutant PI3K, mas somente glicose é essencial como fonte de nutrientes. PLoS ONE 7 (9): e45061. doi: 10.1371 /journal.pone.0045061

editor: Jen-Tsan Ashley Chi, da Universidade de Duke, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de fevereiro de 2012; Aceito: 14 de agosto de 2012; Publicado: September 13, 2012 |

Direitos de autor: © Foster et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo não recebeu qualquer financiamento externo. O trabalho foi financiado exclusivamente pela Horizon Descoberta Ltd e Celera Corporation como parte de um programa de investigação interna. desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar e preparação do manuscrito foram realizadas por funcionários da Horizon Descoberta Ltd e Celera Corporation Ações

Conflito de interesses:. Rebeccca Foster, Sue Griffin, Suzanne Grooby, Ruth Feltell e Chris Torrance são todos os funcionários da Horizon Descoberta Ltd. Chris Torrance é co-fundador da Horizon Descoberta Ltd e atua no conselho de administração. Cindy Christopherson, Monica Chang, John Sninsky e Shirley Kwok são todos os funcionários da Celera Corporation. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A via PI3K-AKT-mTOR é um caminho chave de sinalização oncogénica e como tal tem um papel central na regulação da proliferação celular, sobrevivência celular, invasão e metástase de células de cancro [1] – [3]. Hiper-activação da via é comum em cancros humanos e pode ser conseguida de um certo número de maneiras, incluindo a mutação de

PIK3CA

.

PIK3CA

, o gene que codifica a subunidade alfa catalítica da cinase, sofre mutação em aproximadamente 15% dos tumores colorrectais e cerca de 30% dos cancros da mama, a maioria das mutações que ocorrem em três pontos de acesso,

E542K

,

E545K

e

H1047R

[4] – [9]. As duas primeiras mutações de ponto de acesso,

E542K

e

E545K

, são encontrados no exão 9, que se encontra dentro do domínio helicoidal, enquanto

H1047R

, a mutação mais prevalente no peito cancro, é encontrado no exão 20, que se encontra dentro do domínio da quinase. As mutações dentro de ambas as regiões levar à activação constitutiva de PI3K-AKT-mTOR sinalização [3], [5], [10].

A PI3K-AKT-mTOR regula não só a proliferação celular e sobrevivência celular, mas é um caminho importante no controle e regulação do metabolismo do câncer [2], [11] – [15]. A integração de alterações metabólicas, com proliferação de sinalização é crucial para conferir uma vantagem competitiva sobre uma célula de cancro, resultando na oncogénese e metástase.

A análise da expressão do gene comparativa foi realizada por um conjunto de genes que representam diferentes vias metabólicas utilizando (a ) o par isogênico MCF10A PI3Knull (+ /+ e H1047R /+) e (B) o par isogênico HCT116 PI3Knull (+/- e H1047R /+). Ox fosf, phosphorytion oxidativo; PPP, via das pentoses fosfato. Replicar conjuntos de dados foram calculados e alterações de expressão de genes para as células mutantes PI3Knull são representados como vezes de mudança relativa às células do tipo selvagem PI3Knull. genes glicólise diferentes foram regulados positivamente como resultado da

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mutação nos diferentes modelos de celulares.

adaptação metabólica das células cancerosas é um fenômeno bem conhecido, com os estudos de Otto Warburg demonstraram que as células cancerosas consomem glicose a uma taxa elevada, mesmo na presença de oxigénio, mantendo-se ao campo seminal (revisto [16] – [18]). As alterações metabólicas não simplesmente resultar em alterações na produção de energia, mas são fundamentais para a regulação da produção de blocos de construção necessários macromoleculares por uma célula e para a manutenção do equilíbrio redox [16], [19] – [22]. Embora glicólise aeróbica (o efeito Warburg) é a actividade metabólica mais amplamente documentado em tumores e linhas celulares de cancro, vias adicionais, tais como metabolismo de glutamina mitocondrial e síntese dos ácidos gordos cooperam para produzir as macromoléculas necessários para suportar o crescimento celular contínua. Com efeito, glutamina contribui para muitas funções metabólicas principais da proliferação de células tumorais e é muitas vezes apenas considerada secundária em glucose em termos de importância no metabolismo das células do tumor. A glutamina é o aminoácido mais abundante em plasma humano, e células cancerosas metabolizar glutamina em excesso de qualquer outro aminoácido [23] – [25]. Não obstante, um número de estudos publicados ligaram outras dependências de aminoácidos com efeitos metabólicos e sobrevivência de células cancerosas [26] – [28]. Estes estudos nutricionais destacar a natureza complexa e pouco flexível do metabolismo do tumor, uma vez que as células cancerosas não só se adaptar e alternar entre diferentes vias metabólicas, mas também ter acesso simultâneo a vários nutrientes.

O PI3K via de sinalização, principalmente através os seus efeitos sobre a AKT e mTOR, tem sido associado com a regulação de um certo número de efeitos metabólicos, incluindo a absorção de glucose, a estimulação do efeito Warburg, e melhorada a síntese de lípidos e proteínas [11], [29], [30]. activação AKT, por exemplo, tem sido mostrado que estimula a glicólise pelo aumento da expressão e da membrana translocação do transportador de glucose GLUT4. AKT activa também actua através GSK3β para regular a glicogénio sintase e promover a associação de duas hexoquinase com a membrana mitocondrial, onde hexoquinase 2 pode mais facilmente fosforilar glucose [11], [13], [29] – [33].

a expressão proteica foi avaliada por transferência de Western para confirmar os dados de expressão de genes em ambos (a) a par isogénica MCF10A PI3Knull (+ /+ e H1047R /+) e (B) o par isogénica HCT116 PI3Knull (+/- e H1047R /+ ) de linhas celulares.

Enquanto estudos históricos têm demonstrado conexões entre a via PI3K-AKT-mTOR e metabolismo, os sistemas de modelos usados ​​frequentemente invocada comparações entre linhas celulares que têm várias diferenças genéticas ou usado estratégias de sobre-expressão que não são reflexivo da genética do tumor do paciente. O foco predominante da investigação tem-se centrado sobre a influência da genética do tumor no metabolismo da glucose. No entanto, alterações genéticas também podem ditar nutrientes alternativas e dependências metabólicas.

A fim de explorar como endógena

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mutações especificamente alterar vias metabólicas e para melhor entender se qualquer uma destas alterações potenciais estabelecer terapeuticamente targetable dependências metabólicas celulares, temos realizado focado análise metabólica expressão do gene, a comutação de nutrientes e experimentos de siRNA usando modelos da linha celular isogênicos que são geneticamente idênticos, com exceção do estado de mutação do endógena

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gene.

Materiais e Métodos

Cultura de células

Todos os MCF10A e HCT116 X-MAN ™ linhas celulares isogênicos foram obtidos a partir Horizon Descoberta Ltd (https://www.horizondiscovery.com). A seguir X-MAN ™ linhas celulares isogênicos foram utilizados neste estudo: MCF10A PI3Knull (H1047R /+), heterozigotos knock-in do

PIK3CA

domínio quinase ativação mutação (HD 101-011); MCF10A PI3Knull (E545K /+), heterozigotos knock-in do

PIK3CA

domínio helicoidal ativando mutação (HD 101-002); HCT116 PI3Knull (+/-), knock-out de

PIK3CA

domínio quinase alelo mutante (

H1047R

) em células parentais heterozigotos (HD 104-007). linhas celulares parentais, MCF10A PI3K (+ /+) e HCT116 PI3K (/+ H1047R) também foram utilizados. Todas as linhas celulares foram criadas usando isogénicas recombinação homóloga mediada por rAAV para alterar de forma precisa e de forma estável loci genómico alvo específica [3], [34]. Todas as linhas celulares isogénicas MCF10A foram mantidas em DMEM /F12 (PAA) suplementado com 5% de soro de cavalo (Invitrogen), 10 ug /ml de insulina (Sigma), 0,5 ug /ml de hidrocortisona (Sigma) e 0,1 ug de toxina /ml cólera ( Sigma). células parentais foram MCF10A, adicionalmente suplementado com 20 ng /ml de hEGF (R D Systems). Linhas celulares HCT116 isogénicas foram mantidas em meio de McCoy 5A (Invitrogen) suplementado com soro fetal bovino a 10% (PAA).

linhas de células não isogénicas abrigando

PIK3CA

mutações foram adquiridas a partir da ATCC (BT20 , DLD-1, MDA-MB-453 e RKO) e ECACC (MCF7 e T47D), e mantidos de acordo com as recomendações do fornecedor.

células isog�nicas MCF10A PI3Knull (+ /+, H1047R /+ e E545K /+) e células HCT116 isogénicas (+/- e H1047R /+) foram cultivadas em meio contendo glutamina 2 mM e as concentrações indicadas de glucose (a e B, respectivamente), ou em meios contendo glucose 25 mM e as concentrações indicadas de glutamina ( C e D, respectivamente) durante 120 horas e o crescimento celular avaliada utilizando SRB. O crescimento de cada linha de células é expressa relativamente ao crescimento em glucose ou glutamina 2 mM 25 mM (* p 0,05; ** p 0,01)

MCF10A PI3Knull (+ /+) e MCF10A PI3Knull. células (/+ H1047R) foram cultivados durante 120 horas em meios contendo glucose 25 mM ou sem glucose, como indicado. Todas as mídias contidas glutamina 2 mM. Além disso, as células cultivadas sem glucose foram suplementados quer com frutose a 0,5 mM de (+ fruct), a galactose 10 mM de (+ galact), ácido gordo de cultura de células suplemento (+ FA) ou 0,1 mM de ácido aspártico (+ AA). O crescimento celular foi avaliada usando SRB.

MCF10A PI3Knull (+ /+) e MCF10A PI3Knull (H1047R /+) células foram transfectadas com siRNA não-alvo (NT) e 2 siRNA segmentação individuais

HK2

, HK2 A e B. HK2 (A) o crescimento celular foi avaliada 96 horas pós-transf ecção usando SRB. O crescimento foi avaliada como uma percentagem de controlo não específico (* p 0,05; ** p 0,01). (B) Queda de proteína HK2 foi confirmada por Western blotting. HK1 transferência de Western foi realizada para confirmar a especificidade de knockdown.

As linhas celulares foram crescidas durante 120 horas em meio contendo glutamina 2 mM, e a concentração indicada de glucose e de crescimento avaliada utilizando SRB. O crescimento de cada linha de células foi expresso como uma percentagem do crescimento em glicose a 25 mM (* p 0,05; ** p 0,01)

Crescimento Dependência Ensaios

A proliferação de células. ao longo de um período de 120 horas foi avaliada utilizando o ensaio de sulfo-rodamina B (SRB) [35]. As células foram semeadas em placas de 96 cavidades, em triplicado, em DMEM de glucose e glutamina livre (PAA), suplementado com a concentração necessária de glucose (Sigma) e glutamina (PAA). linhas celulares isogénica MCF10A foram adicionalmente suplementado com 5% de soro de cavalo, 10 ug /ml de insulina, 0,5 ng /ml de hidrocortisona, 0,1 ng /ml toxina da cólera e 0,2 ng /ml de hEGF. Todas as outras linhas celulares foram suplementados com soro fetal bovino a 10% somente. Onde meios indicados também foi suplementado com 0,5 mM de frutose, galactose 10 mM, 0,5 ml /l de ácido gordo de suplemento de cultura de células ou ácido aspártico 0,1 mM (Sigma).

Estudos Gene Expression

MCF10A isogénica As linhas celulares foram semeadas em placas de 25 cm

2 frascos em meio DMEM /F12 suplementado com 5% de soro de cavalo, 10 ug /ml de insulina, 0,5 ng /ml de hidrocortisona, 0,1 ng /ml toxina da cólera e 0,2 ng /ml de hEGF. linhas celulares HCT116 isogénicas foram semeadas em 25 cm

2 frascos em meio 5A de McCoy suplementado com soro fetal bovino a 10%. Após 48 horas as células foram colhidas por tripsinização e ARN preparado utilizando o Kit RNeasy (Qiagen), de acordo com as instruções do fabricante.

O ARN total foi transcrito de forma inversa utilizando o High Capacity cDNA de transcrição reversa Kit (Applied Biosystems). Os níveis de transcrição de 45 genes envolvidos na glicólise, glutaminolysis, via das pentoses fosfato, fosforilação oxidativa, e o metabolismo de lípidos foram quantificados por PCR em tempo real, juntamente com três genes de normalização (

NUP214

,

PPIG

e

SLU7

). 5 ng de ADNc por RCP foram utilizados. As amplificações foram realizadas com

ΔZO5

polimerase de ADN num tampão contendo 20 mM de Tris pH7.85, KCl 30 mM, MgCl 3 mM de

2, 100? M dA, L, CTP, 200 pM, dUTP 0.8units uracilo N-glicosilase, 6% de glicerol, 1X ROX, 0,2X e SYBR verde. As reacções foram amplificadas no Prism 7900 utilizando os seguintes parâmetros de ciclagem: 50 ° C durante 2 minutos, 95 ° C durante 12 minutos, seguido por 45 ciclos de 95 ° C durante 20 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. Um conjunto de referência (Universal Human RNA Referência, Stratagene) a 2,5 ng foi amplificado com cada gene. Todas as amplificações foram realizadas em duplicado.

A expressão de genes foi determinada utilizando o método 2 (-ΔΔCt) descrito por Livak e Schmittgen [36]. A expressão de um gene em

PIK3CA

células mutantes em relação a

PIK3CA

células do tipo selvagem foi determinada usando a fórmula 2

(ΔΔCt PI3K mutada-ΔΔ Ct PI3K WT).

Western Blotting

as células foram lisadas em tampão de lise em concentrações de TG de gelo e de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína BCA (Sigma). Quantidades iguais de proteína foram carregadas em géis de 10% Bis-Tris resolvidas por electroforese em SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de PVDF (Invitrogen). As membranas foram bloqueadas em 5% w /v de leite em pó desnatado, soro fisiológico 1x Tris-tamponada, 0,1% de Tween-20 durante 1 hora à temperatura ambiente e, em seguida, incubadas em anticorpos primários a 4 ° C durante a noite. Foram utilizados os seguintes anticorpos: anti-GLUT1 (1:5000 diluição; Epitomics 2944-1), anti-GLUT5 (1:500 diluição; Santa Cruz AC-271055), anti-hexoquinase 1 (1:500 diluição; Cell Signaling Tecnologia 2804), anti-hexoquinase 2 (1:500-1000 diluição; Cell Signaling Tecnologia 2106), anti-MCT4 (1:500; Millipore AB3314P), anti-fosfo-AKT (1:1000; Cell Signaling Tecnologia 9271) e anti -β-actina (1:500 000; Sigma A5441). Subsequentemente, as membranas foram incubadas com o anticorpo secundário adequado (Cell Signaling Technology) durante 1 hora à temperatura ambiente. As proteínas foram detectadas utilizando ECL-Plus (GE Healthcare) e exposição a filmar.

siRNA Estudos

ON-TARGETplus pool não-targeting siRNA (Dharmacon # D-001810-10-20) e duas individuais ON-TARGETplus siRNA contra Hexokinase 2 (Dharmacon # J-006735-06 e # J-006735-07) foram transfectados em células usando Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen), seguindo as instruções do fabricante para transfecção para a frente. complexos de transfecção foram deixados nas células durante 6 horas antes de substituir com meios de crescimento. O crescimento celular foi determinada 96 horas após a transfecção usando o ensaio SRB como descrito acima. Hexoquinase 2 knockdown foi confirmada por Western blot, conforme descrito, com hexoquinase 1 expressão monitorada para confirmar a especificidade de knockdown.

Análise Estatística

A análise estatística foi realizada usando 2-way ANOVA testa seguido por múltiplas de Bonferroni teste de comparação. Para simplificar, os valores de p são representados como p 0,05 (*) ou p . 0.01 (**), só

Resultados

A presença de uma PIK3CA Activar mutação resulta em Gene Expression mudanças associadas com o aumento da Glicosidases Dependência e metabólica adicionais Pathway alterações

Para caracterizar completamente a influência de um

PIK3CA

mutação em alterações metabólicas como um todo, um conjunto gene alvo foi compilado em primeiro lugar, representando 45 genes de diferentes vias metabólicas, tais como a glicólise, fosforilação oxidativa, glutaminolysis, via das pentoses fosfato e metabolismo de ácidos graxos. A expressão de genes foi, em seguida, analisado em amostras de ARN replicado, preparado a partir de dois sistemas modelo isogénicas. O primeiro sistema de modelo celular foi uma célula de cancro do par de linhas não tumorigénicas composto de células parentais em que MCF10A PI3Knull é tipo selvagem (WT), PI3Knull (+ /+) e MCF10A células nas quais a mutação

H1047R

activação tinha sido introduzido, PI3Knull (H1047R /+). O segundo foi uma linha de células de câncer de cólon HCT116, que é heterozigoto para o

H1047R PIK3CA

mutação, PI3Knull (H1047R /+), emparelhado com células em que o alelo mutante tem sido nocauteado para tornar as células funcionalmente WT, PI3Knull (+/-). Análise da expressão do gene para o

PIK3CA

amostras de células mutantes em relação ao

PIK3CA

células WT revelou algumas alterações marcantes nos níveis de expressão de genes metabólicos. Enquanto os genes precisos cima e para baixo-regulamentada no

PIK3CA

células mutantes em comparação com

PIK3CA

WT diferiu entre os dois sistemas modelo celular, as mudanças globais na expressão gênica foram indicativos de um aumento fenótipo aeróbica glycolytic dentro

PIK3CA

células mutantes. Introdução de uma mutação ativando dentro

PIK3CA

em células MCF10A levaram a um aumento da expressão da enzima glicolítica tecla

Hexokinase 2

(

HK2

), e uma redução simultânea na expressão do transportador de frutose,

GLUT5

(Figura 1A). No fundo de células de cancro do cólon HCT116, a presença de um

PIK3CA

resultou em elevada expressão do transportador de glucose,

GLUT1

(Figura 1B).

Outra expressão do gene mutado variações como consequência da presença de um

PIK3CA

mutação sugeriu que podem existir alterações adicionais da via metabólica. Em MCF10A PI3Knull (H1047R /+), as células, o transportador de ácidos gordos

SLC27A1

mostraram redução da expressão, com vários genes envolvidos na fosforilação oxidativa também mostra a expressão reduzida (Figura 1A). Aumento da expressão de genes tais como

(+ H1047R /) células

asparagina sintetase

(ASN) e glutaminase (GLS)

foram consistentemente visto em PI3Knull, sugestivo de glutaminolysis elevada (Figura 1A e 1B).

alterações na expressão de ARNm foram depois confirmados ao nível da proteína, demonstrando níveis elevados de enzimas glicolíticas, tais como chaves HK2 e GLUT1, e, adicionalmente, que revelam a sobre-regulação do transportador MCT4 lactato no MCF10A PI3Knull ( H1047R /+) células (Figura 2). A activação da via PI3K foi confirmada em ambos os modelos isogénicas como mostrado por fosforilação de AKT.

Crescimento de Células PIK3CA mutante é selectivamente Dependente de Glicose Glutamina Enquanto é essencial em ambos os WT e PIK3CA células mutantes

os resultados do perfil de expressão do gene foi sugestivo de um número de alterações no metabolismo celular como um resultado de mutação

PIK3CA

, especificamente aumentada glicólise e glutaminolysis alterada. Para explorar a possibilidade de que as células podem ser mais dependentes não só nas vias específicas, mas também demonstram dependência fonte de nutrientes, investigamos o efeito do esgotamento de nutrientes no crescimento celular, concentrando-se em dependência celular em glicose e glutamina. Mais de 120 horas, a retirada completa da glucose (na presença de glutamina) afetado negativamente a capacidade de MCF10A PI3Knull (H1047R /+) para proliferar e crescer, enquanto tendo nenhum efeito sobre o crescimento de MCF10A PI3Knull (+ /+) células (Figura 3A). Este impacto diferencial também era verdade para uma segunda linha celular MCF10A contendo uma alternativa

PIK3CA

mutação, MCF10A PI3Knull (E545K /+) (Figura 3A). Do mesmo modo, o crescimento de HCT116 PI3Knull (H1047R /+) foi mais gravemente afectado após a depleção de glicose e retirada de HCT116 PI3Knull (+/-) células (Figura 3B). Esta observação sugeriu que o

PIK3CA

células WT eram mais capazes de tolerar a retirada de glicose do que o

PIK3CA

células mutantes, embora na presença de glutamina. Para entender melhor o envolvimento de glutamina, foi realizada uma matriz de estudos, avaliando a depleção de glicose e retirada em conjunto com depleção de glutamina e de retirada. O crescimento de células MCF10A, independentemente de

PIK3CA

estado de mutação foi severamente comprometida pela retirada completa de glutamina, mesmo na presença de glucose (Figura 3C). esgotamento parcial da glutamina, também influenciado negativamente o crescimento das células, mas a extensão da dependência não pareceu correlacionar-se com

PIK3CA

estado de mutação. Da mesma forma, a retirada glutamina completa severamente comprometida crescimento de células HCT116. Em contraste com as células MCF10A, as células HCT116 foram mais capazes de tolerar um nível intermediário de retirada glutamina, sem prejudicar o crescimento visto em qualquer

PIK3CA

WT ou células mutantes (Figura 3D). O padrão de sensibilidade à glicose foi mantido com este nível intermediário de glutamina (Figura S1).

O Glucose Dependência exibido por células PIK3CA mutante pode não ser ultrapassado por suplementação com outros nutrientes

Para mais caracterizar o fenótipo glicolítica e aparente dependência de glicose de

PIK3CA

células mutantes, foi utilizado o sistema modelo isogênico MCF10A para avaliar se fontes de nutrientes alternativos poderia compensar glicose e substituir a dependência. Alternar a fonte de nutrientes com um monosacárido alternativo (frutose ou galactose) foi incapaz de compensar a retirada de glicose no MCF10A PI3Knull (/+ H1047R) células, enquanto o crescimento de MCF10A PI3Knull (+ /+), as células permaneceram inalterados pela remoção de glicose ou nutriente comutação (Figura 4). Como os dados de expressão gênica sugeriu que

PIK3CA

células mutantes podem ter alterações em outros do que a glicólise vias metabólicas, nós investigado se a dependência do crescimento da glicose poderia ser substituído, completando com nutrientes que podem promover essas vias alternativas. Com base nas alterações de expressão de genes em asparagina sintetase e transportadores de ácidos gordos, que complementado células com ácido aspártico ou uma mistura de ácidos gordos. Nem o suplemento foi capaz de substituir os efeitos da retirada de glucose no crescimento de MCF10A PI3Knull (H1047R /+) células (Figura 4). Foram observados resultados semelhantes quando a MCF10A PI3Knull (E545K /+) e HCT116 PI3Knull (H1047R /+) células foram perfilado (Figura S2).

A ruptura do Glicosidases Caminho Demonstra os efeitos anti-proliferativos em células mutantes PIK3CA

o MCF10A PI3Knull (H1047R /+), as células mostram um nível elevado de glicose e de dependência é incapaz de compensar a ausência de glicose através da utilização de outros nutrientes. Em conjunto com a demonstração de que os dados in

PIK3CA

células mutantes mostram aumento da expressão da enzima chave HK2 glicólise, a hipótese é que a perturbação da via glicolítica deve ser suficiente, mesmo na presença de glicose, para inibir o crescimento do células mutantes. Portanto, foram avaliados os efeitos da ruptura direccionada de glicólise utilizando duas moléculas de siRNA para knockdown níveis de hK2 as células isogénicas MCF10A. Usando uma molécula não-alvo siRNA como um controle, descobrimos que knockdown HK2 específica, de fato, resultar em efeitos anti-proliferativa, seletivo para o

PIK3CA

células mutantes (Figura 5A). Knockdown dos níveis de proteína HK2 em ambos

PIK3CA

WT e células mutantes linhas foi confirmada por Western blot (Figura 5B), com especificidade de knockdown confirmada pelo monitoramento expressão HK1.

Glucose Dependência é visto em outras linhas celulares de cancro Abrigando endógena PIK3CA mutações

Nossas investigações têm utilizado um sistema preciso e geneticamente definido para investigar os efeitos de um

PIK3CA

mutação no metabolismo celular de forma isolada. Nós estendemos nossos estudos para entender se estas descobertas eram verdadeiras através de um painel mais amplo de linhas celulares de cancro. Por isso, determinou-se a dependência de crescimento de glucose de seis linhas de células do cólon e do cancro da mama, todos contendo endógena

PIK3CA

mutações (Tabela 1). No entanto, estas linhas têm também a ressalva de ter um número de outras diferenças genéticas, que podem modular ou eliminam a dependência glicose putativa determinada em sistemas de células-isogénicas. A medida em que o crescimento foi afetado variada entre as linhas, com 3 das linhas 6 células (T47D, BT20 e DLD-1), demonstrando um crescimento reduzido após a depleção de glicose parcial (Figura 6). No entanto, o crescimento de todas as linhas de células 6 foi comprometida pela retirada completa de glicose, mesmo na presença da glutamina, apoiando o conceito de que

PIK3CA

cancros mutantes são fortemente dependentes de glicose para apoiar o crescimento celular.

Discussão

o interesse em estudar o metabolismo do câncer e desenvolver agentes metabólicos apontado como terapias tem crescido nos últimos anos, e assim uma melhor compreensão do metabolismo único das células cancerosas é imperativo para a concepção de medicamentos eficazes e tratamento racional dos pacientes , bem como a monitorização da resposta visualização de nutrientes e tratamento rotulados. Apesar de activação da via PI3K-AKT-mTOR sendo uma característica comum de muitos cancros, e activação desta via a ser associada com a regulação de um certo número de efeitos metabólicos, o perfil global da consequência de

PIK3CA

mutações no metabólica dependências não foi estudado. Usando modelos de células isog�nicas geneticamente definidas, temos sido capazes de definir precisamente como

PIK3CA

mutações podem influenciar vias metabólicas dentro de um tumor.

Regulamento de processos metabólicos e utilização de nutrientes são processos complexos. análise de expressão gênica neste estudo revelou que a consequência geral de

PIK3CA

mutações é uma mudança no sentido de um aumento do fenótipo glicolítica. No entanto, a maneira exata de efeitos celulares este deslocamento pode variar. Ao invés de uma molécula limitação de taxa única, várias etapas criando uma ‘via regulatória’ podem compartilhar o controle homeostático do metabolismo energético. controle multi-passo foi destacada pelo diferencial de genes-regulação de enzimas-chave da glicólise nos diferentes modelos isogênicos. Embora as diferenças foram vistos, o efeito líquido é sugestivo da sobre-regulação da glicólise em ambos os casos. Esta ligação entre o

PIK3CA

mutações relevantes do paciente e fenótipo glicolítica resultante é consistente com estudos anteriores que foram associados a activação da via de sinalização com AKT estimular o efeito Warburg [11], [13]. Este conceito é construído sobre e fortalecidas por ter revelado uma clara dependência da

PIK3CA

células mutantes em glucose para o crescimento continuado. Apesar das sugestões que as células cancerosas são adeptos a utilizar outras fontes de nutrientes, este estudo demonstrou que

PIK3CA

células mutantes não são facilmente capazes de compensar a retirada de glicose, seja através do uso da glutamina, monossacarídeos alternativas ou outros nutrientes. A dependência de glucose para o crescimento também foi mostrado através de um painel mais amplo de linhas celulares de cancro abrigar

PIK3CA

mutações endógenos. Os resultados deste estudo poderia fornecer informações importantes para a concepção de estratégias terapêuticas, uma vez que eles têm destacado nós críticos dentro de vias metabólicas que podem ser chave para o destino. De fato, estudos knockdown confirmou que a segmentação da via glicolítica para os resultados de interrupção nos efeitos anti-proliferativa, específicas para

células mutantes PIK3CA

, sugerindo que esta poderia ser uma estratégia terapêutica para alvejar especificamente pacientes com

PIK3CA

tumores mutantes. A dependência de glicose ostensiva de células com esta mutação também oferece rotas para imagem não invasivo de tumores ativados PI3K-via.

Através caracterização do fenótipo metabólico das células isog�nicas geneticamente compatíveis, temos sido capazes de definir o metabólica consequências de uma única alteração genética engenharia, neste caso uma mutação ativadora dentro do

gene PIK3CA

. Embora confirmando que a activação da via PI3K resultados por AKT-mTOR em um aumento do fenótipo glicolítica, também demonstraram uma dependência específico para

PIK3CA

células mutadas sobre a glicose e ilustrado que a segmentação esta via oferece um potencial terapêutico e imagiologia de tumores insight.

Informações de Apoio

Figura S1.

sensibilidade à glicose dos HCT116 PI3Knull (H1047R /+) foi mantida células quando cultivadas em meios de glutamina de 0,5 mM. isogénicas células HCT116 (+/- e H1047R /+) foram cultivados durante 120 horas em meio contendo glutamina 0,5 mM e as concentrações indicadas de glicose. O crescimento celular foi avaliada por meio da coloração SRB. O crescimento de cada linha de células é expressa relativamente ao crescimento em meio contendo glutamina 0,5 mM e glicose 25 mM

doi:. 10.1371 /journal.pone.0045061.s001

(TIF)

Figura S2.

A dependência de glicose de

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células mutante não pode ser substituído pela suplementação com nutrientes alternativos. células isogénicas MCF10A PI3Knull (+ /+ e E545K /+) e células HCT116 isogénicas (+/- e H1047R /+) foram cultivados durante 120 horas em meio contendo glutamina 2 mM e as concentrações indicadas de glucose (A e B respectivamente). Além disso, as células cultivadas sem glucose foram suplementados quer com suplemento de ácido gordo de cultura de células (+ FA) ou 0,1 mM de ácido aspártico (+ AA). O crescimento celular foi avaliada por coloração SRB

doi:. 10.1371 /journal.pone.0045061.s002

(TIF)