Sumário
sialidase remove ácido siálico da sialoglicoconjugados e desempenha um papel crucial em muitos processos fisiológicos e patológicos. Vários cancros humanos expressam um nível anormalmente elevado do plasma associada à membrana isoform.Visualization sialidase de actividade de sialidase, em tecidos de mamíferos que vivem seria útil não só para a compreensão funções de sialidase, mas também para o diagnóstico do cancro. No entanto, uma vez que a actividade enzimática da sialidase de mamífero é extremamente fraca em comparação com a de sialidases bacterianos e virais, tem sido difícil de detectar actividade de sialidase, em tecidos de mamíferos. Nós sintetizado um derivado de ácido siálico com base benzothiazolylphenol-novela (BTP-Neu5Ac) como um substrato de sialidase fluorescente. BTP-Neu5Ac pode visualizar atividades sialidase sensibilidade e seletivamente em fatias de cérebro de rato agudas. As células cancerosas implantadas ortotopicamente em dois pontos do rato e cancros do cólon humano (estágios T3-T4) também foram claramente detectadas com BTP-Neu5Ac. Os resultados sugerem que BTP-Neu5Ac é útil para imagens histoquímica de atividades sialidase
Citation:. Minami A, Otsubo T, Ieno D, Ikeda K, Kanazawa H, Shimizu K, et al. (2014) Visualização de sialidase Actividade em mamíferos tecidos e Detecção de Câncer com um Novel fluorescente sialidase substrato. PLoS ONE 9 (1): e81941. doi: 10.1371 /journal.pone.0081941
Autor: Alberto G. Passi, Universidade de Insubria, Itália |
Recebido: 25 de julho de 2013; Aceito: 17 de outubro de 2013; Publicação: 10 de janeiro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Minami et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiada por Grant-in-Aid para Jovens cientistas (b) (KAKENHI;. não 24.790.080), The Research Grant Sasakawa científica da Sociedade Japonesa de Ciência e o subsídio Naito Fundação para a promoção de projectos de investigação específicos. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
sialidase (CE 3.2.1.18) remove ácido siálico da sialoglicoconjugados, tais como glicoproteínas e glicolípidos. sialidase de mamíferos é conhecido por ter 4 isoformas (Neu1, NEU2, NEU3 e NEU4) e desempenha muitos papéis em funções celulares, incluindo a diferenciação, crescimento, apoptose e migração e na sobrevivência e proliferação das células cancerosas [1], [2]. Visualizar a distribuição detalhada da atividade sialidase em tecidos de mamíferos pode nos ajudar a compreender os papéis fisiológicos e patológicos da sialidase. Além disso, uma vez que o nível de NEU3, uma sialidase do plasma associada à membrana de expressão, é notavelmente aumentada em vários cancros humanos, tais como cólon, renal, da próstata e do ovário [1], [2], [3], a detecção de actividades de sialidase de membrana em tecido de cancro viável também será útil para o diagnóstico do cancro e monitorização em tempo real de cancro durante uma operação cirúrgica.
X-Neu5Ac (5-bromo-4-cloro-indol-3-il-α-DN-acetilneuramínico ácido) é um substrato de sialidase artificial amplamente utilizado para imagiologia e citoquímica histoquímica de actividade de sialidase. Composto X (5-bromo-4-cloro-3-hidroxi-indole) é libertado a partir de X-Neu5Ac com sialidase e oxidado para se obter um índigo visível azul insolúvel em água. Para aumentar a especificidade da coloração, substratos indigogenic são frequentemente utilizados com uma mistura equimolar de K
3 [Fe (CN)
6] e K
4 [Fe (CN)
6] como um catalisador de oxidação. No entanto, a sensibilidade não é suficiente para observar a distribuição detalhada da atividade sialidase em tecidos [4] mamíferos. A actividade enzimática da sialidase de mamífero é notavelmente baixa em comparação com a de bactérias e vírus [5], [6]. Para aumentar a sensibilidade de X-Neu5Ac, um sensibilizador como vermelho rápido Violet LB (LB FRV) como um acoplador, para formar um corante azóico é usado com X-Neu5Ac [6], [7], [8]. No entanto, uma vez que uma reacção em duas fases é necessário para a coloração com o FRV LB, coloração não específica causada por o sensibilizador é inevitável e faz com que seja difícil de utilizar, especialmente em campos clínicos. No presente estudo, nós desenvolvemos novos substratos fluorescentes de sialidase, derivados de ácido siálico com base em benzothiazolylphenol (BTP-Neu5Ac), para visualização altamente sensível e específico de actividade de sialidase em viver tecidos de mamíferos através de uma reacção de passo único.
no presente estudo, descobrimos que BTP-Neu5Ac pode visualizar atividades sialidase sensibilidade e seletivamente em fatias de cérebro de rato agudas. BTP-Neu5Ac pode também detectar claramente as células cancerosas implantadas ortotopicamente em dois pontos do rato e cancros do cólon humanos.
procedimentos sintéticos Materiais e Métodos
A síntese de compostos é descrito em detalhes em S1 Arquivo
Materiais
os seguintes produtos foram adquiridos de fornecedores indicados:.. sialidase de
Arthrobacter ureafaciens
(AUSA, recombinante expressa em
Escherichia coli
, Calbiochem, San Diego, CA, EUA), X-Neu5Ac (Peptide Institute, Osaka, Japão), halotano (Takeda Pharmaceutical Company, de Osaka, Japão), meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Wako Puré Chemical Industries, Osaka, Japão), penicilina e estreptomicina (MP Biomedicals, Santa Ana, CA, EUA), soro fetal de bovino (FBS, AusGeneX, Molendinar, Queensland, Austrália), ficoeritrina (PE) -conjugated IgG anti-coelho de cabra (Santa Cruz Biotechnology, Dallas , TX, EUA) e de coelho anti-CD71 (receptor de transferrina), anticorpo policlonal (Ensaio de Biotecnologia, Sunnyvale, CA, EUA). Os reagentes utilizados para a tomada de soluções tampão foram adquiridos de Wako Pure Chemical Industries.
animais experimentais
Ratos e camundongos foram adquiridos da Japan SLC (Hamamatsu, Japão). Eles foram alojados em condições padrão de laboratório (23 ± 1 ° C, 55 ± 5% de umidade) e tinha acesso à água da torneira e dieta
ad libitum
. As luzes foram automaticamente ligado às 8:00 e desligado às 20:00. Todos os experimentos foram realizados de acordo com o guia japonês farmacológico Sociedade para o cuidado e uso de animais de laboratório, e os protocolos foram pré-aprovados pelo animal Comitê de Ética da Universidade de Shizuoka.
Análise de espectro
espectros fluorescente de 5 mM BTP2, BTP3 e BTP4 no fluido artificial cerebrospinal (ACSF, pH 7,3, 200 ul) contendo NaCl 119 mM, KCl 2,5 mM, CaCl 2,5
2, MgCl 1,3 mM
2 , 1,0 mM NaH
2 PO?
4, NaHCO 26,2 mM
3 e mM D-glucose 11 foram medidos com um leitor de microplacas, Infinito M200 (Tecan, Männedorf, Schweiz). espectros de excitação foram adquiridos com comprimentos de onda de emissão a 518 nm para BTP2, 526 nm para BTP3 e 542 nm para BTP4. espectros de emissão foram adquiridas com comprimentos de onda de excitação a 370 nm para BTP2, 372 nm para BTP3 e 374 nm para BTP4. visualizações de fluorescência de 5 BTP2 mM, BTP3 e BTP4 em ACSF e BTP2, BTP3 e BTP4 em um papel de filtro foram fotografadas sob luz UV de excitação de 365 nm (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, França) com uma câmera digital, CX1 ( . Ricoh, Tóquio, Japão)
a análise quantitativa da atividade sialidase
AUSA (10
0-10
5,7 mU ml
-1: uma unidade foi definida como a quantidade de enzima que catalisou a libertação de 1 umol de ácido siálico para 1 min.) foi incubado em 100 ul de tampão 100 mM de fosfato de sódio (pH 7,3) contendo 10 ^ M BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac, BTP4-Neu5Ac ou resorufina -Neu5Ac (Res-Neu5Ac) a 37 ° C durante 60 min em uma microplaca negra de 96 poços (Corning, Corning, NY, EUA). A reacção foi terminada pela adição de 150 ul de carbonato de sódio (500 mM, pH 10,7) a cada poço. A intensidade de fluorescência foi medida com um leitor de microplacas (ex /em: 370 nm /518 nm para BTP2, 372 nm /526 nm para BTP3, 374 nm /542 nm para BTP4 e 570 nm /585 nm para resorufina).
Detecção de actividade de sialidase em uma membrana de PVDF
AUSA (10
-1-10
4 mU) foi apagado em uma difluoreto de polivinilideno (PVDF) membrana usando um dotblotter de 96 poços (círculo tamanho bem: 28,3 milímetros
2, Sanplatec, Osaka, Japão). Cada poço foi lavado com mM de tampão de fosfato de sódio 100 (pH 7,3), e, em seguida, foi adicionado 50 ul de 10 mM BTP4-Neu5Ac ou X-Neu5Ac em tampão de fosfato de sódio. Após incubação a 37 ° C durante 6 horas, soluções de reacção foram removidos, e, em seguida, as membranas de PVDF foram observadas com uma câmara digital com luz UV (365 nm) para BTP4-Neu5Ac ou com um SZX7 microscópio estéreo (Olympus, Tóquio, Japão) sob luz visível para X-Neu5Ac.
Imagem da atividade sialidase em fatias de cérebro
ratos Wistar foram anestesiados (masculino, 7-10 semanas de idade, n = 3) com halotano e decapitados. O cérebro de cada rato foi rapidamente colhidos e imersos em ACSF gelado para suprimir a excitação neuronal excessiva e o dano. ACSF utilizado nesta experiência foi continuamente borbulhada com 95% de O
2 e 5% de CO
2. fatias cerebrais coronais (400 um de espessura) foram preparados usando um LinearSlicer PRO-7 (Dosaka EM, Kyoto, Japão) em ACSF gelado. fatias cerebrais agudos foram mantidas em ACSF à temperatura ambiente durante pelo menos 60 minutos e depois incubadas com 400 uL ACSF contendo 1 mM BTP2-Neu5Ac (n = 3), BTP3-Neu5Ac (n = 4) ou BTP4-Neu5Ac (n = 4 ) a 27 ° C durante 1 h. câmaras de incubação foram continuamente borbulhada com 95% de O
2 e 5% de CO
2 durante a coloração. As fatias foram lavadas três vezes com ACSF e transferidos para placas de base de vidro IWAKI 3,5 milímetros (Asahi Glass, Tóquio, Japão) cheios com ACSF. A fluorescência foi observada usando um microscópio de fluorescência IX71 (filtro de filtro de excitação /emissão: BP330-385 /BA420 ou BP330-385 /BA510IF, Olympus). nível de fundo de fluorescência para imagiologia de actividade de sialidase foi determinada por incubação das fatias de cérebro em ACSF sem um substrato. Em todas as observações com um microscópio de fluorescência, o ganho de uma câmera DP70 Digital Microscope (Olympus) foi definido para não detectar a fluorescência de fundo.
Para toda imagem da fatia do cérebro área, fotos foram tiradas sequencialmente e cada peça foi piso frio usando o Photoshop CS4 (Adobe Systems, San Jose, CA, EUA). Quando necessário, mesmo processamento foi realizado da seguinte experimento.
A citotoxicidade
células MDCK foram expostas a um meio isento de soro (SFM) contendo 10 ou 100 uM BTP-Neu5Ac ou BTP. LDH libertada foi medida utilizando um ensaio enzimático acoplado (CytoTox-ONE ™, Promega, WI, EUA).
Modelo de tumor do cólon do rato
Cólon Murino 26 NL-17 de carcinoma de células foram cultivadas em DMEM suplementado com 10% de FBS, 100 unidades ml
-1 de penicilina e 100 ug ml
-1 de estreptomicina a 37 ° C na presença de 5% de CO
2 numa atmosfera húmida. células cancerosas do cólon foram implantadas ortotopicamente na sequência de um protocolo baseado no método descrito por Takahashi
et ai.
[9] Os ratos BALB /cCrSlc (macho, 6 semanas de idade) foram submetidos a jejum durante 12 h e, em seguida anestesiados com hidrato de cloral (400 mg kg
-1 de peso corporal). Para induzir a colite, os ratos foram injectados por via intra-rectalmente com 200 ul de HCI 0,1 M em um local distante do cólon 1,5 cm a partir do ânus através do ânus. Após 10 min, os ratinhos foram injectados por via intra-rectalmente com 200 uL de 0,1 M de KOH para neutralização, seguido de injecção com 400 ul de PBS. Depois de 9 horas, os ratos foram novamente anestesiados e injectados intra-rectalmente com 200 ul de células Colon26 NL-17 (8 x 10
6 células) suspensas com DMEM livre de soro da mesma maneira. O ânus foi imediatamente fixa com uma pequena Klemme durante 2 h. A 1 (n = 3) ou duas semanas (n = 3) após o implante ortotópico de cancro do cólon, dois pontos foram colhidas após perfusão intracardíaca com PBS para remover o sangue a partir de todo o corpo.
amostras de cancro de cólon humano
Dois espécimes cirúrgicos foram obtidos a partir de adenocarcinoma de cólon humano (UICC T classificação T3 e T4) e corados com BTP4-Neu5Ac dentro de 2 horas após a cirurgia. O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Geral de Shizuoka (Protocolo 13-03-59) e da Universidade de Shizuoka (Protocolo 25-2) e está em linha com a Declaração dos Direitos Humanos, Helsínquia, 2002. Todos os pacientes deram informado por escrito consentimento.
a detecção de cancro do cólon com BTP4-Neu5Ac
mouse e tecidos de câncer de cólon humano foram incubadas em PBS contendo 100-200 mM BTP4-Neu5Ac a 37 ° C por 60 min. Após lavagem com PBS, a fluorescência foi observada com um microscópio de fluorescência (filtro de excitação /emissão de filtro: BP330-385 /BA420) ou IVIS Imaging System (Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA). nível de fundo de fluorescência foi determinada utilizando dois pontos normais incubadas em PBS sem BTP4-Neu5Ac.
manchas histopatológicos
Mouse e dois pontos humanos que haviam sido usados para imagens de atividade sialidase foram fixadas com paraformaldeído a 4% . Depois de ser encaixado com a parafina, o tecido foi cortado em secções de 4-7 mícrons de espessura e coradas utilizando anticorpo anti-CD71 de coelho como anticorpo primário, o anticorpo anti-IgG de coelho de cabra conjugado com PE como o anticorpo secundário e 4 ‘, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão).
reprodutibilidade
Todas as colorações foram repetidas pelo menos duas vezes e reprodutibilidade foi confirmada.
resultados e Discussão
desenho de novo substrato de sialidase para imagiologia histoquímica
para visualizar actividade de sialidase sobre o tecido, a aglicona do substrato de sialidase deve ser um corante coloração insolúvel em água a ser ligado ao tecido . Uma vez que o fluoróforo de 4-metilumbeliferil-α-D-
N
ácido acetilneuramínico (Neu5Ac-4MU), um substrato de sialidase artificial utilizada para a quantificação da actividade da enzima, é solúvel em água, 4MU-Neu5Ac não é adequado para imagiologia histoquímica de actividade de sialidase. Benzothiazolylphenol (BTP), um fluoróforo insolúvel em água, mostra fluorescência intensa no estado sólido de um [10]. sondas fluorescentes baseados em BTP têm sido usados por alguns indicadores biológicos e químicos [11], [12], [13]. Quando derivados de BTP, BTP2 [14], BTP3 [15] e BTP4 [15], foram colocados num fluido artificial cerebrospinal (ACSF, pH 7,3), que foram precipitados no fundo de tubos de ensaio (Figura 1 A).
A, vistas de fluorescência de BTP2, BTP3 e BTP4 em ACSF (superior) e em papéis de filtro em 365 nm de luz UV (inferior) são mostrados. Os espectros de BTP2 (B) B-D, excitação (pontos azuis e linhas de emissão) e (pontos vermelhos e linhas), BTP3 (C) e BTP4 (D) foram medidos em ACSF (pH 7,3). Números azuis e vermelhos representam comprimento de onda (nm) no pico de intensidade de fluorescência. Abreviaturas:. RF, intensidade de fluorescência relativa
BTP2, BTP3 e BTP4 têm emissões diferentes e espectros de excitação (Figura 1 B-D). Desde corantes de coloração fluorescentes com diferentes espectros de excitação e emissão têm uma vantagem sobre a seleção de conjuntos de filtros para tirar imagens de fluorescência, usamos esses três derivados BTP como a aglicona do substrato de sialidase.
A hidrólise da BTP-Neu5Ac com sialidase de
Arthrobacter ureafaciens
sintetizado baseado em BTP derivados de ácido siálico (BTP-Neu5Ac), BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac e BTP4-Neu5Ac, de acordo com o esquema sintético mostrado na Figura 2 . Estes derivados de ácido siálico foram solúveis em água e mostrou pouca fluorescência. Quando BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac e BTP4-Neu5Ac foram incubadas em ACSF contendo 10
0-10
5,7 mU ml
-1 sialidase de
Arthrobacter ureafaciens
(AUSA) a 37 ° C durante 60 min (pH 7,3), as intensidades fluorescentes foram aumentados em proporção com a concentração de AUSA e atingiu um patamar em concentrações elevadas (Figura 3 a-C). coeficientes de extinção (M
-1 cm
-1) de BTP2, BTP3 e BTP4 em clorofórmio foram 14970, 12440 e 14350, respectivamente. Estes resultados indicaram que BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac e BTP4-Neu5Ac são úteis para a análise quantitativa das actividades de sialidase
Condições:. (A), Amberlite IR-120 (H
+), MeOH seco, durante a noite, rendimento de 92%. (B) AcCl-AcOH, durante a noite, quant. (C) BTP2~4, NaH, THF-DMF, temperatura ambiente, durante a noite. (D) NaOMe, MeOH seco, 6 h, temperatura ambiente, depois NaOH aq., MeOH, temperatura ambiente, 2 dias.
A-D, as intensidades de fluorescência relativa proporcionalmente aumentados com quantidades crescentes de AUSA em 10 uM BTP2-Neu5Ac (a), BTP3-Neu5Ac (B) e BTP4-Neu5Ac (C), mas não em 10 um Res-Neu5Ac (D). Cada barra ea linha representam a média ± S.E.M. (N = 3). As intensidades de fluorescência de cada barra preta foram criados a 10
5. Res 10: uM Resorufina. E, AUSA apagados em membranas de PVDF foi corado com 10 mM BTP4-Neu5Ac ou X-Neu5Ac. As membranas de PVDF foram observados sob luz UV para BTP4-Neu5Ac ou luz visível para X-Neu5Ac. A cor azul causada por coloração da AUSA com 100 uM X-Neu5Ac está mostrado à direita da linha ponteada.
Resorufina é um fluoróforo insolúvel em água com um tamanho molecular semelhante à de BTP- Neu5Ac. glicosidase substratos baseados em Resorufina têm sido utilizados para a coloração citoquímica e medição da actividade da enzima [16]. No caso dos derivados de ácido siálico com resorufina (Res-Neu5Ac), intensidades fluorescentes não foram significativamente alteradas por AUSA (ANOVA de uma via, a Figura 3 D). BTP-Neu5Ac seria mais adequado do que Res-Neu5Ac para caber no bolso de reacção da sialidase.
AUSA riscados sobre uma membrana de PVDF com diferentes concentrações foi corada com 10 | iM BTP4-Neu5Ac. Como um resultado da observação sob luz UV, intensidades de fluorescência poderia ser alterada numa gama ampla dinâmico (E Figura 3, parte superior). A sensibilidade de BTP4-Neu5Ac foi notavelmente maior do que a de X-Neu5Ac (Figura 3 E, parte inferior).
A visualização da actividade de sialidase em fatias de cérebro de rato agudas
Para visualizar actividade de sialidase na cérebro de rato, fatias cerebrais agudas foram incubadas com ACSF (pH 7,3) contendo 1 mM de BTP2-Neu5Ac, 1 mM BTP3-Neu5Ac ou 1 mM BTP4-Neu5Ac a 27 ° C durante 60 min. câmaras de incubação foram continuamente borbulhada com 95% de O
2 e 5% de CO
2 durante a coloração para manter a condição saudável fatia. Depois de se lavar com ACSF, matéria branca mostrou intensa fluorescência nos cortes corados com BTP2-Neu5Ac, BTP3-Neu5Ac e BTP4-Neu5Ac (Figura 4 A-C). Este resultado foi consistente com os resultados de estudos anteriores que demonstram que a substância branca do cérebro dos mamíferos exibe actividade de sialidase intensa utilizando 4MU-Neu5Ac ou X-Neu5Ac com FRV LB [8], [17].
A-C , actividade de sialidase foi fotografada em fatias coronais agudos de cérebros de ratos adultos com BTP2-Neu5Ac (a), BTP3-Neu5Ac (B) e BTP4-Neu5Ac (C) a pH 7,3. Abreviaturas: cc, corpo caloso; ec, cápsula externa; fi, fimbria; quadril, hipocampo; ic, cápsula interna. D, fatias de cérebro foram corados com várias concentrações (1-1000 ^ M) de BTP4-Neu5Ac. E, actividade de sialidase foi representada por imagem com 10 uM BTP4-Neu5Ac ou 10 uM BTP4-Neu5Ac DANA contendo 1 mM, um inibidor da sialidase. filtros de emissão que transmitem acima de 420 e 510 nm foram utilizados na A-D e E, respectivamente. Barras de escala em cada painel representam 2 mm.
Desde BTP4 está animado com mais eficiência com o filtro passa-banda de excitação (330-385 nm) de um microscópio de fluorescência do que BTP2 ou BTP3, imagiologia com BTP4-Neu5Ac exibiu a fluorescência mais intensa nessas séries BTP-Neu5Ac. Analisamos também a sensibilidade e especificidade de BTP4-Neu5Ac em direção sialidase. No caso da imagiologia actividade de sialidase com X-Neu5Ac e FRV LB, uma concentração elevada de X-Neu5Ac, geralmente, de 1 mm, é necessário para melhorar a sensibilidade e especificidade para a actividade de sialidase de mamífero [7], [8]. Por outro lado, BTP4-Neu5Ac pode detectar actividades de sialidase com baixas concentrações de substrato, mesmo inferior a 10 um (Figura 4 D). Quando o ácido 2,3-desidro-2-desoxi-N-acetilneuramínico (DANA, 1 mM), um inibidor da sialidase, foi aplicada durante a coloração com BTP4-Neu5Ac, a fluorescência foi notavelmente atenuada em toda a área do cérebro (Figura 4E). BTP-Neu5Ac está especificamente hidrolisado com sialidase, o que resulta em um aumento notável na intensidade de fluorescência.
Desde BTP-Neu5Ac, um substrato hidrófilo, preenchido o espaço extracelular foi hidrolisado com sialidase de mamífero de tecidos vivos, sob condições fisiológicas extracelulares , sialidase iria decompor BTP-Neu5Ac principalmente na superfície da célula. A sialidase NEU3 membrana plasmática hidrolisado gangliósido e eficientemente substratos de baixo peso molecular, tais como 4MU-Neu5Ac ligeiramente [18], [19]. Embora o pH ideal de NEU3 é 3.8, NEU3 hidrolisa gangliosídios no mesmo pH neutro [19], [20]. A sialidase lisossomal Neu1 também foi relatado estar presente nas membranas de plasma e para hidrolisar 4MU-Neu5Ac eficientemente [21], [22], [23]. Além disso, o NEU2 sialidase citosólica possui uma forma ligada à membrana e hidrolisa-Neu5Ac 4MU [24]. Portanto, não só NEU3 mas também outras isozimas sialidase estaria envolvido na atividade sialidase detectado com BTP-Neu5Ac.
ensaio de citotoxicidade da BTP-Neu5Ac e BTP
Para a medição de citotoxicidade, as células MDCK foram expostas a BTP-Neu5Ac ou BTP para 6 (dados não mostrados) ou 16 (Figura 5) horas. Como um resultado de medição para os valores de libertação de lactato desidrogenase (LDH) a partir de células com membrana danificada, sem citotoxicidade significativa foi detectada em BTP-Neu5Ac e BTP (one-way ANOVA).
células MDCK foram expostas a um meio isento de soro (SFM) contendo 10 ou 100 uM BTP-Neu5Ac (a) ou BTP (B) durante 16 horas e LDH libertada foi medida. liberação de LDH é mostrado como em relação à libertação completa LDH (100%) por tratamento com tampão de lise.
A detecção de células cancerígenas em tecidos do cólon do rato
Recentemente, a tecnologia de imagiologia câncer se progredido notavelmente. Por exemplo, Oku
et al.
Desenvolvido um lipossoma de pósitrons emissor marcado novo para a tomografia por emissão de positrões (PET) para a imagem de um pequeno câncer no cérebro de forma não invasiva, em tempo real [25]. Urano
et al.
Desenvolvido um anticorpo monoclonal de metas de câncer conjugado com sondas de fluorescência de pH activável para
in vivo
detecção de tumores [26]. A sonda fluorescente câncer altamente sensível e específico tem vantagens para a detecção de pequenos cânceres porque o tamanho mínimo de um tumor detectado usando endoscopia fluorescência (cerca de ~ 1 mm) é muito menor do que em PET, tomografia computadorizada (TC) e ressonância magnética ( RM) (cerca de 5-20 mm) [27], [28]. A detecção precoce dos cancros e seguindo cura rápida deles efetivamente impede não só a alteração maligna de cancro, mas também a metástase distal e promete fortemente melhoria do prognóstico.
Uma vez que o cancro do cólon é relatado para exibir a atividade enzimática intensa de um por membrana plasmática sialidase associada [29], tentamos detectar cancro do cólon com BTP4-Neu5Ac em tecidos vivos do cólon. Os ratinhos foram implantados ortotopicamente com Colon26 células NL-17, que são altamente metastáticas células cancerosas isoladas a partir de um adenocarcinoma do cólon do rato 26. Após 1 ou 2 semanas, os tecidos do cólon foram recolhidas e incubadas em solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo 100 uM BTP4- Neu5Ac. fluorescência intensa foi observada no cólon implantado com células Colon26 NL-17, mas não em dois pontos inflamatórias ou normais (Figura 6 A-C, Figura S1). Considerando que o tecido do cólon normal mostraram fluorescência fraca, de fluorescência de cancro do cólon foi muito mais forte do que a do tecido normal (Figura 6 D-F). As regiões que mostram fluorescência intensa no cólon implantado com células Colon26 NL-17 foram confirmados de possuir cancro por coloração imuno-histoquímica (Figura 6 L). Portanto, cancros do cólon poderia ser distinguido facilmente de tecidos normais usando BTP-Neu5Ac.
A, Uma semana após a implantação do cólon ortotópico de Colon26 células NL-17, que vivem tecidos do cólon foram coradas com BTP4-Neu5Ac. Arrowhead indica a região de câncer. B e C, inflamatória cólons normais (C) (B) ou também foram coradas com BTP4-Neu5Ac. À esquerda, meio e painéis à direita no painel A-C mostram campo claro, se fundiu e vistas fluorescentes, respectivamente. D e E, Imagem ampliada de câncer (D) e região normal (E) corado com BTP4-Neu5Ac. F, o nível de fluorescência de fundo de painéis D e E é mostrado. L, coloração imuno-histoquímica (fluorescência vermelha), utilizando anticorpo de coelho anti-CD71 e anticorpo IgG de cabra anti-coelho conjugada com PE e coloração nuclear com DAPI (azul de fluorescência) foram realizados para detectar cancro do cólon em secções transversais dos tecidos do rato do cólon que eram utilizado para imagiologia de actividade de sialidase em painéis a e D. as setas indicam as regiões que mostram fluorescência intensa de BTP no painel a e D. a barra de escala no painel C representa 2,5 mm e é comum nos painéis a e B. a barra de escala no painel F representa 0,5 mm e é comum em painéis D e E. a barra de escala no painel G representa 0,2 mm.
actividades sialidase expressos em Colon26 NL-17 foram relatados para ser mais fraco entre adenocarcinoma do cólon 26 sublinhas como NL- 4, NL-17, NL-22 e NL-44 [30]. Uma vez que até Colon 26 NL-17 adenocarcinoma implantado ortotopicamente em dois pontos do rato foram detectadas com BTP-Neu5Ac claramente, BTP4-Neu5Ac seria sensível o suficiente para a sonda câncer.
Detecção de câncer nos tecidos do cólon humano
tem sido relatado que o nível de expressão de ARNm Neu3 no cancro de cólon humano é 3-100-vezes maior do que em tecidos normais [29]. Portanto, nós também tentou detectar o câncer de cólon humano com BTP4-Neu5Ac. Após incubação de tecidos vivos de cancro do cólon humano, classificado como T3 pela classificação T da União para Cancer Control Internacional (UICC), em PBS contendo 200 uM BTP4-Neu5Ac, fluorescência intensa foi observada nas regiões do tumor mas não nas regiões normais (Figura 7 A-G). As regiões que mostram fluorescência intensa e fluorescência não foram confirmadas como sendo o cancro e tecidos normais, respectivamente, usando a coloração com hematoxilina-eosina (Figura 7 H e I). Câncer categorizados como T4 também foi detectada com BTP4-Neu5Ac em tecidos do cólon humano (dados não mostrados). Embora seja necessária uma avaliação adicional de toxicidade, seria possível usar BTP4-Neu5Ac para a detecção do câncer não só no exame patológico mas também diagnóstico não invasivo.
A, A amostra de cancro do cólon humano (região delimitada com uma linha branca ) foi obtido a partir de tecido de cancro cirúrgico (classificação UICC T: T3). B-D, O tecido do cólon foi corado com BTP4-Neu5Ac. B, C e D mostram fotográfica, fundidos e imagens fluorescentes, respectivamente. E-G, imagens de fluorescência ampliada do normal (E) e regiões do cancro (F e G) foram adquiridas com um microscópio fluorescente. H e I, um corte longitudinal de tecido do cólon foi preparado na linha pontilhada nas regiões de painel B. Não fluorescência e fluorescência no painel C foram coradas com hematoxilina-eosina e são mostrados em painéis H e I, respectivamente. Barras de escala no painel B, E e H representam 10 mm (comum em painéis B-D), 500 mm (comum em painéis E-G) e 250 mm (comum em painéis de H e I), respectivamente.
Conclusões
Nós desenvolvemos novos substratos sialidase fluorescentes para a coloração histoquímica de actividades de sialidase em tecidos de mamíferos. Desde sialidase desempenha um papel crucial em muitas funções biológicas, incluindo o catabolismo lisossomal, sistema imunológico e as funções neuronais [2], [31], BTP-Neu5Ac é uma ferramenta poderosa para a investigação pormenorizada das funções de sialidase. Uma vez que não foram detectáveis, BTP-Neu5Ac pode ser utilizado os citotoxicidades de BTP-Neu5Ac e BTP para ensaio biológico de sialidase no tecido vivo, v.g. imagem time-lapse. Finalmente, cancros do cólon foram detectados com BTP4-Neu5Ac em um tecido vivo, sugerindo que BTP-Neu5Ac seria também útil para sondas de câncer.
Informações de Apoio
Figura S1.
detecção de cancro do cólon com BTP4-Neu5Ac em duas semanas após a implantação das células cancerosas. Duas semanas após a implantação orthotopical de células Colon26 NL-17, dois pontos do rato foram coradas com BTP4-Neu5Ac. dois pontos inflamatórios ou normais também foram coradas com BTP4-Neu5Ac. painéis esquerdo e direito mostrar imagens fluorescentes e imagens de campo claro se fundiu com imagens fluorescentes, respectivamente. barra de escala representa 5,0 mm
doi:. 10.1371 /journal.pone.0081941.s001
(TIF)
S1 arquivo.
procedimentos sintéticos e
espectros 1H de novos compostos
doi:. 10.1371 /journal.pone.0081941.s002
(PDF)