Abstract

Fundo

junções aderentes consistem em cadherins transmembrana, que interagem intracelularmente com p120ctn, ß-catenina e α-catenina. p120ctn é conhecido por regular a adesão célula-célula, aumentando a estabilidade da caderina, mas os efeitos de outros componentes aderentes de junção na adesão célula-célula não foram comparadas com a de p120ctn.

Metodologia /principais conclusões

mostra-se que a depleção de p120ctn por pequeno ARN interferente (siRNA) no cancro da próstata DU145 e células epiteliais da mama MCF10A reduz os níveis das proteínas aderentes de junção, a caderina-e, P-caderina, SS-catenina e α-catenina expressão, e induz a perda de adesão célula-célula. células com depleção de p120ctn também têm aumentado a velocidade migração e invasão, que se correlaciona com o aumento Rap1 mas não Rac1 ou RhoA atividade. Regulação negativa de P-caderina, β-catenina e α-catenina mas não E-caderina induz uma perda de adesão célula-célula, o aumento da migração e invasão aumentada semelhante à p120ctn depleção. No entanto, apenas a depleção p120ctn conduz a uma diminuição dos níveis de outras proteínas aderentes de junção.

Conclusões /Significado

Os nossos dados indicam que o P-caderina, mas não de E-caderina é importante para a manutenção adherens junções em DU145 e MCF10A células, e que a depleção de qualquer uma das proteínas associadas-caderina, p120ctn, SS-catenina ou α-catenina, é suficiente para perturbar junções aderentes de células DU145 e aumentar a migração e a invasão de células de cancro.

Citation: Kümper S, Ridley AJ (2010) p120ctn e P-caderina, mas não a e-caderina regulam a motilidade celular e invasão de DU145 Prostate Cancer Cells. PLoS ONE 5 (7): e11801. doi: 10.1371 /journal.pone.0011801

editor: Robin Charles May, da Universidade de Birmingham, Reino Unido

Recebido: 02 de fevereiro de 2010; Aceito: 29 de junho de 2010; Publicação: 27 de julho de 2010

Direitos de autor: © 2010 Kuemper, Ridley. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo Cancer Research UK, Fundação Bettencourt-Schueller, e um Quadro 6 contrato Comissão Europeia (LSHG-CT-2003-502.935; MAIN). SK foi apoiado por uma bolsa de estudo de doutoramento do Kings College London School of Biomedical e Ciências da Saúde. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Durante a metástase, as células cancerosas geralmente ganham a capacidade de migrar e invadir tecidos, regulando a sua interacção com outras células e seu ambiente extracelular. Muitos estudos mostram que as alterações na adesão célula-célula correlaciona com a progressão do tumor epitelial e metástase [1]. As células cancerosas podem invadir quer como células simples ou colectivamente como grupos de células [2], [3], [4]. Ambos os tipos de invasão envolvem perturbações do epitélio, que normalmente requer um enfraquecimento de contactos célula-célula e uma alteração na forma da célula. As caderinas e cateninas formar junções aderentes, que são mediadores centrais da adesão célula-célula. Expressão de proteínas adherens junção é frequentemente diminuída em tumores, e reconstituição de aderentes funcionais junções pode reverter o fenótipo invasivo de células cancerosas [5], [6], [7].

As caderinas clássicas (E-, VE, N- e P-caderina) são as proteínas transmembranares centrais do complexo adherens junção e mediar Ca

2 + -dependente homofílicas interacções intercelulares. β-catenina e placoglobina ligamento /γ-catenina caderina domínios intracelulares de um modo mutuamente exclusivo e α-catenina, por sua vez liga-se a p-catenina [8]. P120-catenina (p120ctn), por outro lado se liga a uma região diferente de caderinas a p-catenina [9], [10], [11], [12], [13], [14]. A composição de proteínas do complexo adherens junção depende do tipo de célula e a expressão de caderina. α-catenin fornece uma ligação importante entre junções aderentes e do citoesqueleto de actina. A sua interacção com os filamentos de actina no entanto, parece ser mutuamente exclusivas para a sua ligação a p-catenina sugerindo uma relação indirecta entre as junções e o citoesqueleto de actina [15], [16].

p120ctn foi encontrado para regular adherens estabilidade junção

in vitro

[17], [18], [19] e

in vivo

[20], [21], [22]. Seu esgotamento por RNAi conduz a uma diminuição em proteínas de junções aderentes e suprime a adesão célula-célula [17], em parte através do aumento da caderina endocitose e degradação [19], [23]. p120ctn também afecta a actividade das pequenas GTPases RhoA, Rac1 e Cdc42, em alguns tipos de células [24], [25], [26], [27], que desempenham um papel central na regulação da dinâmica do citoesqueleto, a formação e manutenção de adherens entroncamentos e migração celular [28], [29]. p120ctn pode, portanto, ligar junções aderentes e GTPases Rho.

Os efeitos de p120ctn sobre a migração celular e invasão variam dependendo do tipo de célula, as condições de ensaio e os tipos de caderinas expressa [30], [31], [32] . Não está claro até que ponto os efeitos de p120ctn são mediadas através de junções aderentes ou GTPases Rho. Para resolver isso, temos derrubado p120ctn em DU145 células cancerosas da próstata e células epiteliais mamárias MCF10A, os quais normalmente têm junções aderentes contendo E-caderina e P-caderina. Em ambos os tipos de células o esgotamento de p120ctn conduz ao rompimento de contactos célula-célula, regulação negativa de proteínas de junções aderentes e aumento da motilidade celular. Curiosamente, o knockdown de p120ctn não afectou os níveis de Rho GTPases RhoA e Rac1 actividade, mas conduziu a um aumento na Rap1 activo. Pela primeira vez que se derrubado caderinas, bem como cateninas e mostram que a P-caderina, β-catenina e α-catenina mas não depleção de E-caderina mimetizar os efeitos da supressão p120ctn e levar a uma perda de contactos célula-célula e aprimorado invasão.

resultados

a supressão da expressão p120ctn leva a regulação baixa de proteínas de adesão célula-célula e interrupção dos contatos célula-célula

para investigar os efeitos da p120ctn no celular aderência -cell, compararam-se os efeitos de depleção p120ctn em duas linhas de células diferentes que têm junções aderentes, a linha celular de cancro da próstata humano DU145 e a linha epitelial mamária humana celular MCF10A. células DU145 e MCF10A formados contactos célula-célula e expressa tanto E- e P-caderina, que se localizou contactos célula-célula (Fig. 1a, b). células DU145 e MCF10A predominantemente expressar duas isoformas p120ctn que, com base no seu peso molecular, são previstos para ser isoformas 1 e 3 [33] com isoforma 3 (banda inferior) a ser expresso em níveis ligeiramente mais elevados (Fig. 1).

células DU145 (a) e (B) MCF10A foram transfectadas com ARNsi para p120ctn (p120ctn (1), (2)), ARNsi de controlo ou com o reagente de transfecção única (simulado). Após 72 h, as células foram fixadas e coradas para a F-actina, p120ctn e E-caderina ou P-caderina (painéis da esquerda), ou lisadas e analisadas por imunotransferência para as moléculas de adesão célula-célula indicados e p120ctn eficiência knockdown (painéis da direita) . Barras de escala = 25 uM. ERK foi utilizado como um controlo de carga para imunoblots.

knockdown de p120ctn com dois diferentes ARNic em células DU145 e MCF10A ruptura de adesão célula-célula, resultando num fenótipo “espalhados” induzidas (Fig. 1, Fig. 2). Além disso, as células DU145 empobrecido de forma estável p120ctn não têm conexão aderente estável (Fig. S1). Este fenótipo foi especificamente devido ao esgotamento p120ctn, uma vez que a expressão de shRNA resistente p120ctn rato (GFP-fusão) formação junção resgatado, tal como determinado por localização de p120ctn e E-caderina (Fig. S1).

DU145 ( a, C, D) e MCF10A (b), as células C foram transfectadas com ARNsi para p120ctn (p120ctn (1), (2)), de siRNA para e-caderina (caderina-e), ARNsi de controlo (controlo) ou com transfecção reagente somente (simulada). Após 56 h, as células foram monitorizadas por microscopia de lapso de tempo, a aquisição de uma imagem a cada 10 minutos ao longo de um período de 16 h. Exemplos representativos de imagens de contraste de fase de células dos filmes (painéis à esquerda) e faixas de migração (painéis da direita, começar a ponto de cada célula é plotado na intersecção de x e-eixos y) são mostrados para transf-controle e p120ctn-empobrecido DU145 (A) e (B) MCF10A células. Barras de escala = 50 uM. velocidades de Migração (C, D) são descritos como Box-Whisker mostrando mediana, intervalo interquartil (caixas) e maiores e menores valores (filamentos). (C) velocidades de migração de células DU145 e MCF10A. (D) velocidades de migração de células de controlo DU145 em colônias em comparação com células individuais. Os dados são de três experiências diferentes, cada uma realizada em duplicado, analisando a 15 células por campo (~ 90 células no total). *** P 0,001, comparado com o controlo e determinado pelo teste t de Student

Ambos caderina-E e caderina-P, bem como β- e α-catenina foram regulados negativamente em p120ctn-empobrecido. células. Regulação negativa de caderinas correlacionados com a extensão da depleção p120ctn: a 72 h após a transfecção com siRNAs segmentação p120ctn, níveis p120ctn foram inferiores a 48 h, e os níveis de E-caderina foi menor às 72 h do que 48 h (dados não mostrados)

p120ctn-decréscimos foram no entanto não é provável que tenham sido submetidos epitelial para mesenquimal (EMT) como os níveis de proteínas marcadoras EMT tal como vimentina não foram aumentados em comparação com células DU145 (dados não mostrados) transfectadas controlar-.

p120ctn regula a migração de células DU145 e MCF10A

para testar se a migração celular foi afectada pela depleção p120ctn, as células foram monitorizadas por microscopia de lapso de tempo ao longo de 16 h (Fig. 2A, B) e rastreados para determinar a sua velocidade de migração. células DU145 e MCF10A empobrecido-p120ctn ambos migraram mais rapidamente do que as células de controlo (Fig. 2, Filmes S1, S2, S3 e S4). Em contraste, a depleção de E-caderina não alterou a velocidade de migração de células (Fig. 2C), embora o seu nível de expressão foi reduzido por p120ctn knockdown (Fig. 1). A velocidade de migração de células de controlo foi determinado a partir de células localizadas dentro de colónias de células (Fig. 2C), mas algumas células na população migrou como células individuais (Filmes S1 e S3). No entanto, não houve diferença na velocidade de migração de células DU145 em colónias ou de células individuais (Fig. 2D), o que exclui a possibilidade de que as células-empobrecido p120ctn migraram mais rápido porque eram predominantemente células individuais em vez de colónias.

a migração celular foi também analisado em ensaios de ferida-zero em monocamadas confluentes de células DU145. A maioria das células com depleção de p120ctn migrou como células individuais dentro da ferida, enquanto que as células de controlo migrou como uma folha, mantendo contactos célula-célula (Fig. 3A, filmes S5, S6). células empobrecido-p120ctn migraram mais rapidamente do que as células de controlo (Fig. 3B). No entanto, as células empobrecido-p120ctn mostrou uma diminuição na persistência (Fig. 3B), o que indica que eles mudar de direcção mais frequentemente. Assim, apesar do aumento da velocidade de migração, o tempo de fechamento da ferida foi semelhante para controlar transfectadas células (Fig. 3C).

células DU145 foram transfectadas com siRNAs para p120ctn (p120ctn (2)) e controlar siRNA (controle) . Após 56 h, uma monocamada confluente foi ferido utilizando uma ponta de pipeta e células monitorizada por microscopia de lapso de tempo, a aquisição de uma imagem a cada 10 minutos ao longo de um período de 16 h. (A) imagens de contraste de fase de células a partir do primeiro quadro de cada filme são mostrados sem ou com faixas representativas de células (7 /imagem; rastreados para 16 h) sobrepostas (imagens acima). Além disso, as feridas scratch de células de controlo e células com depleção de p120ctn são mostrados em 0 h e 16 h após a lesão (painéis inferiores). Barras de escala = 50 uM. velocidade (B) Migração (à esquerda) e persistência (direita; deslocamento comprimento /pista) foram determinados. velocidades de migração são retratados como Box-Whisker mostrando mediana, intervalo interquartil (caixas) e maiores e menores valores (filamentos). (C) Área ocupada por células em feridas scratch foi determinada a partir de imagens de contraste de fase tomadas em momentos diferentes de filmes. Os dados são de três experiências diferentes, cada uma realizada em duplicado, analisando a 15 células por campo (~ 90 células no total). * P 0,05; *** P . 0.001, comparado ao controle e determinado pelo teste t de Student

A supressão da expressão p120ctn leva ao aumento da atividade Rap1

Regulamentação das actividades de Rho GTPase por p120ctn tem previamente sido correlacionada com o aumento da motilidade celular [25], [26]. No entanto, não foram observadas diferenças nos níveis de ativos RhoA, Rac1 ou Cdc42 entre as células DU145 transfectada de controle de depleção de p120ctn e (Fig 4A, B;. De dados para Cdc42 não mostrados). Desde p120ctn knockdown induziu uma perda de contactos célula-célula e a GTPase Rap1 foi previamente associada com estabilização da E-caderina na membrana plasmática e deve ser activada a seguir a E-caderina de desengate [34], foram analisados ​​os níveis de Rap1 activas. células DU145 empobrecido-p120ctn apresentaram níveis aumentados de actividade Rap1 (Fig. 4A, B).

células DU145 foram transfectadas com ARNsi para p120ctn (p120ctn (1), (2)), ARNsi de controlo (controlo) ou com reagente de transfecção única (simulada). Após 72 células h foram lisadas e incubadas com GST-Rhotekin-RBD, GST-PAK1-PBD ou GST-RalGDS-RBD em esferas de glutationa para puxar para baixo RhoA activa, Rac1 e Rap1 respectivamente. Os lisados ​​de células transfectadas por simulação incubadas com GTPyS para pré-carregar GTPases foram usadas como controlo positivo para os ensaios de pulldown. Imunotransferência de (A) Exemplo para ensaios de actividade de GTPase. os níveis de ERK em imunoblots foram utilizados como um controlo de carga. Ponceau coloração de imunotransferências mostra os níveis de proteínas de fusão com GST. (B) Os gráficos mostram dados de 3 (RhoA, Rac1) ou 4 (Rap1) experiências independentes e os resultados são comparados com total de RhoA, Rac1, Cdc42 e normalizada para o controle. As barras de erro representam SEM. * P 0,05, comparado ao controle e determinado pelo teste t de Student

A exaustão das caderinas, ß-catenina ou α-catenina não afeta os níveis de outras proteínas adherens junção expressão

Desde depleção p120ctn reduziu os níveis das proteínas aderentes junção de e-caderina, P-caderina, SS-catenina e α-catenina (Fig. 1), foi investigado o efeito de empobrecimento cada uma dessas proteínas em junções aderentes. células DU145 foram transfectadas com 2 ou 3 diferentes oligos siRNA para E-caderina, P-caderina, β-catenina, α-catenina e p120ctn (Fig. 5A).

células DU145 foram transfectadas com os ARNsi indicados durante e-caderina, P-caderina, α-catenina e β-catenina, ou com ARNsi de controlo (controlo), ou o reagente de transfecção única (simulado). (A) Após 72 h as células foram lisadas e os níveis de proteína das proteínas indicadas analisados ​​por imunotransferência. Os níveis totais de proteína ERK ou GAPDH foram utilizados como um controlo de carga. (B) Os gráficos mostram os níveis de proteína da P-caderina, E-caderina, α-catenina e p120ctn seguinte knockdown das proteínas indicadas, quantificados por digitalização Odyssey de imunotransfer�cias (esquerda) ou knockdown β-catenina, quantificados por densitometria (à direita), a partir de 4 expericias independentes. Os resultados são normalizados para controlar. As barras representam SEM. *** P 0,001, ** p 0,01, * p . 0,05, comparado com o controlo e determinado pelo teste t de Student

Os níveis de expressão de cada uma destas proteínas foram então determinados por quantificação de imunotransfer�cias. Os níveis de P-caderina, β-catenina, α-catenina e proteínas p120ctn não foram afectadas pela depleção de E-caderina (Fig. 5A, B). Knockdown de P-caderina reduziu ligeiramente os níveis de E-caderina, SS-catenina e α-catenina mas não p120ctn, mas isto só foi observada para ARNsi oligo (1) que deu o mais forte ( 80%) a depleção de P-caderina . Dois outros oligos que reduziram os níveis de P-caderina por ~ 50% não afetou os níveis de outras proteínas juncionais. SS-catenina ou o esgotamento α-catenina não alterou os níveis de outras proteínas aderentes junção significativamente (Fig. 5). É, assim, apenas a depleção p120ctn que resulta num decréscimo nos níveis de todas as outras moléculas de adesão célula-célula (Fig. 5B).

Supressão de p120ctn, P-caderina, β-catenina e α-catenina mas não de e-caderina leva à ruptura de contactos célula-célula e aumenta a invasão de células de cancro

uma vez que a regulação negativa da p120ctn levou a uma perda de junções célula-célula e um aumento na velocidade de migração celular, os efeitos de empobrecimento outra proteínas de junções aderentes na adesão célula-célula e a motilidade celular foram investigados. Knockdown de caderina-E, P-caderina, SS-catenina e α-catenina por RNAi era altamente eficaz, tanto dentro de colónias e em células individuais, como observado por imunofluorescência, mas não afetou perceptivelmente níveis p120ctn (Fig. 6).

células DU145 (a) foram transfectadas com os ARNsi indicados para e-caderina, P-caderina, β-catenina, α-catenina, ARNsi de controlo (controlo) ou com o reagente de transfecção única (simulado). Após 72 h, as células foram fixadas e coradas para a P-caderina, E-caderina, β-catenina, α-catenina e p120ctn correlacionar fenótipos de knockdown com a expressão de proteínas knocked-down. Barras de escala = 25 um.

O knockdown da P-caderina, β-catenina e α-catenina por cada um dos 2 siRNAs diferentes (ou 3 de P-caderina) levou ao rompimento de célula-célula contactos, semelhante à depleção p120ctn (Fig. 6, Fig. S2, Fig. S3). Notavelmente, todos os três siRNAs 1, 2 e 3 de segmentação P-caderina perda de contactos célula-célula induzida, apesar de níveis reduzidos de P-caderina por quantidades diferentes (Fig. 5, a Fig. 6, Fig. S3). Em contraste, knockdown de E-caderina nas células DU145 não induziu uma perda de contactos célula-célula (Fig. 2C, a Fig. 6, Fig. 7).

células DU145 foram transfectadas com os ARNsi indicados durante e-caderina, P-caderina, β-catenina, α-catenina e p120ctn, com ARNsi de controlo (controlo) ou o reagente de transfecção única (simulado). 56 h após a transfecção, as células foram monitorizadas por microscopia de lapso de tempo, a aquisição de uma imagem de contraste de fase a cada 10 minutos ao longo de um período de 16 h. Exemplos representativos de imagens de contraste de fase nas trilhas de início e de migração após 16 h são mostradas. Barras de escala = 25 uM. velocidade (B) A migração foi determinada utilizando ImageJ Software. Análise de velocidade de migração é descrito como Box-Whisker mostrando mediana, intervalo interquartil (caixas) e maiores e menores valores (filamentos). Os dados são de pelo menos 50 células de três experiências diferentes. *** P . 0.001, comparado ao controle e determinado pelo teste t de Student

Células empobrecido de cada proteína de junção adherens foram rastreados a partir de filmes timelapse para determinar a sua velocidade de migração (Fig. 7). Como depleção p120ctn, knockdown de P-caderina, β-catenina e α-catenina levou a um aumento da velocidade de migração celular, semelhante aos resultados obtidos com depleção p120ctn, ao passo que a depleção de E-caderina não alterou a velocidade de migração (Fig. 7). Da mesma forma P-caderina, mas não depleção de E-caderina nas células MCF10A levou ao rompimento de contactos célula-célula e aumento da velocidade de migração (Fig. 8).

(A) As células foram transfectadas MCF10A com os ARNsi indicados para E -cadherin, P-caderina ou com ARNsi de controlo (controlo). Após 72 h, as células foram fixadas e coradas para a F-actina e p120ctn. Barras de escala = 25 uM. (B) 56 horas após a transfecção, as células foram monitorizadas por microscopia de lapso de tempo, a aquisição de uma imagem de contraste de fase a cada 10 minutos ao longo de um período de 16 h. velocidade de migração foi determinada utilizando ImageJ Software. Análise de velocidade de migração é descrito como Box-Whisker mostrando mediana, intervalo interquartil (caixas) e maiores e menores valores (filamentos). Os dados são de pelo menos 50 células de três experiências diferentes. *** P . 0,001, comparado com o controlo e determinado pelo teste t de Student

Com base nas alterações na adesão célula-célula e a velocidade de migração observados, os efeitos de p120ctn, E-caderina, P-caderina, β- e α-catenina em invasão Matrigel através foi investigada. Knockdown de p120ctn com dois diferentes ARNsi aumentada através de invasão de Matrigel enquanto que a depleção de E-caderina não afectou a invasão (Fig. 9A, B). O knockdown de P-caderina por outro lado conduziu a um aumento na invasão semelhante à depleção p120ctn (Fig. 9). A depleção de β-catenina, bem como α-catenina induziu um aumento na invasão semelhante ao p120ctn e P-caderina. Para excluir a possibilidade de que as diferenças no número de células na parte inferior de Transwells Matrigel-revestidas foram devidas a proliferação celular alterada, as células foram contadas 48 horas depois de terem sido transfectadas com ARNsi. Não ocorreram alterações no número de células em comparação com células de controlo transfectadas com ARNsi foram observadas (Fig. 9C). Em conclusão, knockdown de P-caderina, β-catenina e α-catenina mas não E-caderina induzida uma perturbação de contactos célula-célula e um aumento da migração de células de cancro e invasão semelhante para o knockdown de p120ctn.

células DU145 foram transfectadas com os ARNsi indicados para p120ctn, P-caderina, e-caderina, α-catenina e β-catenina, com ARNsi de controlo (controlo) ou o reagente de transfecção única (simulado). Após 55 h as células foram semeadas sobre inserções de membrana Transwell contendo uma camada de Matrigel. De FCS foi utilizado como um quimioatractivo na câmara inferior. Os ensaios foram interrompidos após 17 h, fixando as células na parte inferior dos insertos de membrana utilizando violeta de cristal. Imagens de oito campos de vista diferentes foram adquiridos e células em todas as imagens contadas e analisadas. Gráficos (A) mostram dados de três experimentos independentes, cada uma realizada em triplicado. Os resultados são normalizados para controlar. As barras representam SEM. ** P 0,01, * p 0,05, comparado com o controlo, determinada pelo teste t de Student. (B) Imagens representativas de células na parte inferior das membranas Transwell. Barras de escala = 50 uM. (C) 48 horas após a transfecção as células foram contadas e comparadas com sicontrol. Os gráficos mostram dados de pelo menos três experiências independentes. Os resultados são normalizados para controlar. As barras representam SEM.

Discussão

p120ctn expressão é frequentemente perdido ou reprimidos em uma grande variedade de cancros humanos [35] e diminuição dos níveis p120ctn se correlacionam com o grau do tumor [36], [37], [38], [39]. Mostrámos aqui que a depleção de p120ctn em E-caderina e células DU145 e MCF10A que expressam caderina-P perturba os contactos célula-célula, e aumenta a migração e a invasão de células DU145, suportando um modelo em que p120ctn actua como uma invasão ou metástase supressor [48]. Estes efeitos correlacionados com a diminuição da expressão das proteínas aderentes junção de E-caderina, P-caderina, SS-catenina e α-catenina. No entanto, apenas a regulação negativa da P-caderina e E-caderina não foi capaz de induzir um fenótipo semelhante a depleção p120ctn, indicando que a E-caderina não é necessária para manter a adesão célula-célula em células DU145 ou MCF10A.

em contraste com os nossos resultados, p120ctn tem sido relatada a ser necessário para a invasão de células-e-caderina deficiente em parte, estabilizando as caderinas mesenquimais N-caderina-11 ou caderina, que são conhecidos para promover a invasão [32]. Por outro lado, a invasão colectiva de E- e células A431 que expressam P-caderina foi inibida quando os contactos célula-célula foram rompidas por qualquer um knockdown p120ctn o knockdown ou simultânea de E-caderina e P-caderina [35]. Nestes estudos HGF ou EGF, respectivamente, foram usados ​​como chemoattractants em ensaios de invasão e migração, enquanto que nós usamos soro. Uma possibilidade é que p120ctn poderia contribuir especificamente a HGF /migração induzida por EGF ou invasão, uma vez que tenha sido previamente ligado a HGF- ou espalhamento celular induzida por EGF [40].

p120ctn foi mostrada para estimular e Rac /ou atividade Cdc42 e /ou inibir a actividade de RhoA em células sem a e-caderina, incluindo fibroblastos e linhas celulares de cancro, [41] [32]. Em contraste, verificou-se que em células DU145, que expressam P- e E-caderina, mas não N-caderina, o esgotamento dos p120ctn não afectou a actividade de RhoA e Rac1. Da mesma forma, em E-caderina /P-caderina-expressando células A431, depleção p120ctn não alteram a actividade de RhoA /Rac1 [31].

Tomados em conjunto, estes resultados indicam que os efeitos sobre as actividades de p120ctn Rho GTPase são -tipo específico de células. Isto pode ser devido a diferenças na composição de complexos p120ctn, por exemplo, complexos contendo GEFs que poderia activar Rac1 /Cdc42 ou lacunas de regular negativamente RhoA [26], [41]. Interessantemente, em células MDA-MB-231 de cancro da mama, a activação de RAC p120ctn requer caderina ligação [32], sugerindo que as caderinas mesenquimais poderia contribuir especificamente a actividade de RAC. Embora a atividade GTPase Rho não foi afetada pela p120ctn, descobrimos que a atividade Rap1 é aumentada em células DU145 depleção de p120ctn. Rap1 é um importante regulador de junções célula-célula, e é activada por acoplamento de E-caderina [42], [43]. Perturbação de junções aderentes por depleção de cálcio extracelular também induz um aumento em actividade Rap1 [44]. Os nossos resultados com depleção p120ctn são consistentes com a hipótese de que a endocitose de E-caderina aumenta a actividade Rap1 [44].

Surpreendentemente, o knockdown da P-caderina, β- e α-catenina mas não levou a E-caderina para o rompimento de contactos célula-célula. Presumivelmente substitutos P-caderina para E-caderina de manter contactos célula-célula, mas não da caderina-E P-caderina. Esta hipótese é apoiada por estudos em células MDCK, onde foi mostrado que a E-caderina só é importante para o estabelecimento mas não manutenção de contactos célula-célula, ao passo que foi necessário α-catenina para manter os contactos célula-célula [45]. Além disso, a depleção de P-caderina sozinho foi relatado para induzir a perda de contactos célula-célula e a regulação negativa dos níveis de E-caderina nas células MCF10A [46] e a sobre-expressão de P-caderina em-231 MDA-MB células de cancro da mama reduzida migração celular e invasão [47]. No cancro da maioria dos estudos se concentraram na ligação entre downregulation E-caderina e aumento da agressividade do câncer e invasão, embora também existam indicações de que P-caderina afeta a progressão do tumor. Por exemplo, os níveis de P-caderina são reprimidos durante melanoma progressão [48] e P-caderina é muitas vezes perdido em cancros da próstata [49]. Em células DU145, descobrimos que a depleção de P-caderina induz a perda de junções célula-célula, sem afectar de forma significativa os níveis de outras proteínas aderentes de junção, indicando que é o principal caderina necessária para a adesão célula-célula nestas células.

o knockdown de interrupção β- e α-catenina também induziu contactos de célula-célula e um aumento na invasão, mas não alterou os níveis de P-caderina ou proteína p120ctn. É possível que eles afectam a localização de P-caderina e /ou p120ctn em vez de níveis. p- e a-cateninas têm sido relatados para afectar a aderência mediada por caderina-[15], [16], e a depleção de β-catenina em uma linha de células-E-caderina deficiente levou a uma diminuição na invasão [50], mas até agora pouco se sabe sobre seus papéis na migração e invasão. β-catenina também tem um papel importante na sinalização de Wnt-e proliferação de células de cancro que é pensado para ser independente da sua função caderina [51].

Os nossos resultados demonstram que p120ctn regula os níveis de SS e de expressão α -catenina, bem como em células DU145 caderinas. Uma vez que temos mostrado que P-caderina níveis são mais importantes do que a E-caderina na manutenção da adesão célula-célula em células DU145 e MCF10A, postulamos que o aumento da migração e invasão observamos seguinte p120ctn, ß-catenina ou knockdown α-catenin é devido quer à diminuição da estabilidade P-caderina ou alterações na sua localização.

Materiais e Métodos

siRNAs

Todos os siRNAs utilizados foram obtidos a partir Dharmacon (Fisher Scientific UK, Loughborough, REINO UNIDO). O p120ctn alvo seguinte ON-TARGET

além

individuais oligos foram utilizados (CTNND1 (1) 5′-UAGCUGACCUCCUGACUAA-3 ‘; (2) 5′-GGACCUUACUGAAGUUA-3′), E-caderina (CDH1 (1 ) 5’-GGCCUGAAGUGACUCGUAAU-3 ‘; (2) 5’GAGAACGCAUUGCCACAUA-3’), P-caderina (CDH3 (1) 5’GUGACAACGUCUUCUACUA-3 ‘; (2) 5′-GAGGGUGUCUUCGCUGUAG-3’; (3) 5 ‘-GAAAUCGGCAACUUUAUAA-3′), β-catenina (CTNNB1 (1) 5’-GCGUUUGGCUGAACCAUCA-3 ‘) e α-catenina (CTNNA1 (1) 5′-GAUGGUAUCUUGAAGUUGA-3′; (2) 5’-3-GUGGAUAAGCUGAACAUUA ‘). Não segmentação siARN foi utilizado como um controlo em todas as experiências (EM-alvo de controlo # 1; 5’-UGGUUUACAUGUCGACUAA-3 ‘).

Cultura celular e transfecções

células de cancro da próstata DU145 eram cultivadas em RPMI suplementado com FCS a 10%, 100 IU /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina. MCF10A células epiteliais mamarias foram cultivadas em DMEM /F12 suplementado com 5% de soro de cavalo, 100 UI /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 20 ng /mL de EGF, 0,5 ug /ml de hidrocortisona, com 100 ng ml de toxina /cólera e 5 ug /ml de insulina. As células foram semeadas a 1,8 x 10

5 por poço em placas de 24 poços e inverter transfectadas com ARNsi (concentração final 20 nM) em meio de antibiótico-livre utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Paisley, UK), de acordo com as instruções do fabricante . Após 6-8 h, as células foram replantadas em 2 × 10

4 células por poço (DU145) ou 10

4 células por poço (MCF10A) para microscopia de imunofluorescência e lapso de tempo e em 1 × 10

5 por poço (placa de 24 poços) para ensaios de immunoblotting e scratch-ferida. Para a criação de células DU145 empobrecido-p120ctn estáveis, foi utilizado o sistema de vector pSuperior (Oligoengine, Seattle, WA). A sequência do oligo shRNA segmentação p120ctn humano foi concebido como descrito [52]. Um conjunto de células estável que contém o shRNA foram seleccionados em meio contendo 5 ug /ml de puromicina. Para as experiências de murídeo salvamento p120ctn-GFP [26], que não é sensível à segmentação shRNA p120ctn humano, foi transfectado transientemente em células DU145 usando Amaxa nucleofection (Lonza, Colónia, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante (www.lonzabio.com) .

imunotransferência

células cultivadas para aproximadamente 80% de confluência foram lavadas uma vez com PBS frio e lisadas em qualquer 2 × tampão frio de SDS de amostra (Invitrogen) e homogeneizou-se directamente com uma agulha de 21G ou na lise tampão (50 mM Tris pH 7,5, 1% de Triton-X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS, 500 mM de NaCl, 10 mM de MgCl

2, EDTA 2 mM, glicerol a 10%, de Na 1 mM de

3VO

4, 25 mM de NaF, completo isento de EDTA mini-inibidores de proteases (Roche, Welwyn Garden City, Reino Unido), PhosSTOP inibidor de fosfatase (Roche)) e, em seguida clarificados por centrifugação. Os lisados ​​foram separados por SDS-PAGE e submetidos a análise de imunotransferência. Para reprobing, membranas PVDF foram incubadas com tampão de extracção (Tris HCl 50 mM (pH 7,5), mercaptoetanol mM β-100, SDS a 2%) durante 20 min a 65 ° C. Os anticorpos primários foram utilizados a uma diluição de 1:1000: p120ctn (# 610134), a E-caderina (# 610182) foram adquiridos a BD Biosciences (Oxford, Reino Unido), P-caderina (# 05-916), Rac1 (# 05 -389) da Upstate (Millipore, Watford, Reino Unido), β-catenina (# C2206), α-catenina (# C2081) a partir de Sigma-Aldrich (Dorset, Reino Unido), ERK (# SC-94), RhoA (# sc -418) de Santa Cruz Biotechnology (insight Biotecnologia, Wembley, UK) e Rap1A /Rap1B (# 4938) a partir de Cell Signaling (New England Biolabs, Hitchin, UK).