Sumário

1-metil-D-triptofano (1-D- MT) está actualmente a ser utilizado em ensaios clínicos em pacientes com tumores sólidos recidiva ou refractário, com o objetivo de inibir indoleamine-2,3-dioxigenase (IDO) mediada por tumor de escape imunológico. IDO é expressa em tumores e nódulos linfáticos de drenagem de tumor e degrada triptofano (trp) para criar um micromilieu immunsuppressive tanto através da redução de trp e pela acumulação de metabolitos imunossupressora da quinurenina (Kyn) via. Aqui nós mostramos que a proliferação de alorreativas células-T co-cultivadas com células cancerosas humanas IDO1 positivo paradoxalmente foi inibida pelo 1-D-MT. Surpreendentemente incubação com 1-D-MT produção aumentada Kyn de células cancerosas humanas. Os ensaios isentos de células revelou que 1-D-MT não alterou a actividade enzimática IDO1. Em vez disso, 1-D-MT induzida mRNA IDO1 e expressão da proteína através de vias que envolvem p38 MAPK e sinalização JNK. Tratamento de doentes de cancro com 1-D-MT tem efeitos de transcrição que podem promover a suprimir, em vez de anti-tumor de escape imune, aumentando IDO1 nas células cancerosas. Estes efeitos fora do alvo deve ser cuidadosamente analisados ​​nos ensaios clínicos em curso com 1-D-MT

Citation:. Opitz CA, Litzenburger UM, Opitz U, Sahm F, Ochs K, Lutz C, et al. (2011) A indoleamina-2,3-dioxigenase (IDO) Inibidor upregulates IDO1 1-metil-D-triptofano em células cancerosas humanas. PLoS ONE 6 (5): e19823. doi: 10.1371 /journal.pone.0019823

editor: Matej Oresic, Governamental Centro de Pesquisa Técnica da Finlândia, Finlândia |

Recebido: 25 de novembro de 2010; Aceito: 18 de abril de 2011; Publicado em: 20 de maio de 2011 |

Direitos de autor: © 2011 Opitz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Associação Helmholtz (VH-NG-306) para MP e da Fundação Hertie para WW. CAO é apoiado por uma universidade de Heidelberg Faculdade de Medicina pós-doutorado. Como Uta Opitz e Christian Lutz são funcionários da Heidelberg Pharma, Heidelberg Pharma teve um papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes. Uta Opitz e Christian Lutz são funcionários da Heidelberg Pharma. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Em triptofano degradação últimos anos (trp) tem recebido atenção crescente como um mecanismo imunossupressor potente envolvido na manutenção da tolerância imunológica. A enzima indoleamina-2,3-dioxigenase Trp-degradantes (IDO) foi implicada na tolerância alogénica materna em direcção concepti [1], o controlo de doenças autoimunes [2], [3] e infecção crónica [4], bem como a promoção tumoral fuga imune [5], [6], [7]. Trp degradação mediada por IDO não é restrita a células de tumor [7], mas é também detectada em gânglios linfáticos de drenagem de tumor [8]. Em ambos os nódulos linfáticos de drenagem de tumores e tumores, IDO1 cria tolerância local por supressão directa respostas de células T e aumentar a imunossupressão mediada por células T reguladoras (T

reg

) [6]. IDO é cronicamente activado em muitos pacientes com câncer [9] e sua expressão ou atividade da enzima correlaciona-se com um mau prognóstico em pacientes com vários tipos de câncer como o carcinoma de ovário [10], [11], carcinoma endometrial [12], [13], hepatocelular carcinoma de [14] e carcinoma colorrectal [15].

Apesar de a maior parte das provas que sustentam um papel para IDO na promoção da formação de tumor e do tumor de escape imune, há estudos que mostram uma actividade anti-tumoral de IDO1. A indução de IDO1 tem sido descrito como um mecanismo pelo qual o interferão (IFN) -γ inibe a proliferação de células malignas [16], [17]. Algumas experiências com animais demonstraram que a expressão IDO1 foi positivamente associado com a eliminação das células malignas [18], [19]. Estes resultados foram corroborados em estudos clínicos mostra que apesar de ser um forte indutor de IDO1, IFN-γ foi eficaz na terapia do carcinoma do ovário e cancro da bexiga [20], [21], [22]. Além disso, a expressão IDO1 em espécimes de carcinoma hepatocelular e em células endoteliais de carcinoma de células renais positivamente correlacionada com a sobrevivência livre de progressão e sobrevivência a longo prazo, respectivamente [23], [24]. Resta, portanto, a incerteza sobre a relevância clínica de expressão IDO1 em tumores.

Em estudos pré-clínicos da IDO inibidor 1-metil-triptofano (1-MT) reduziu o volume do tumor de ratos premunizadas com um antigénio tumoral [7 ] e – em combinação com agentes quimioterápicos – causou a regressão de cancros da mama murino estabelecidas [5]. A inibição da IDO em combinação com quimioterapia, ou como um adjuvante de vacina, por conseguinte, representa uma abordagem atraente para imunoterapia do cancro [5], [6], [7], [25], [26]. Recentemente, uma nova isoforma de IDO, denominado IDO2 foi descoberto, que – como IDO1 – é expressa em tumores e nódulos linfáticos de drenagem de tumores [27]. A terceira enzima Trp-degradantes em seres humanos, triptofano-2,3-dioxigenase (TDO) é expresso principalmente no fígado e regula concentrações trp Depois da absorção Trp nutricional. O inibidor da IDO 1-MT existe como dois estereoisómeros, 1-D-MT e 1-L-MT. A maioria dos estudos pré-clínicos têm empregue a mistura racémica 1-D /L-MT para inibir IDO. Estudos recentes têm mostrado que IDO1 é o alvo preferencial de 1-L-MT, enquanto que 1-D-MT inibe preferencialmente a IDO2 [26], [27], [28], [29]. 1-D-MT é actualmente utilizado na Fase I de ensaios clínicos, como adjuvante da quimioterapia convencional com base em estudos pré-clínicos em modelos de ratinho de cancro. Nós estávamos interessados ​​nos efeitos imunomoduladores de 1-D-MT em células cancerosas humanas IDO1-positivos.

Resultados

1-D-MT induz imunossupressão de células cancerosas humanas

células SKOV-3 constitutivamente degradar trp para Kyn e expressam níveis elevados de ARNm IDO1 enquanto IDO2 e ARNm TDO são expressos em níveis baixos (Fig. 1a). Knockdown de IDO1 por siRNA em células SKOV-3 diminuiu a expressão de ARNm IDO1 por 87,5% (Fig. 1B) que conduz a uma forte redução da expressão da proteína IDO1 como evidenciado por manchas de Western (Fig. 1C) e imunocitoquímica (Fig. 1D). Finalmente, a produção Kyn foi inibida por 91,4% nas células IDO1 knockdown em comparação com a produção Kyn significativo de SKOV-3 células transfectadas sem siARN ou com um ARNsi de controlo não-direccionamento (Fig. 1E), o que sugere que IDO1 é principalmente responsável pela a produção Kyn constitutiva em células SKOV-3. Para determinar o efeito do tratamento com 1-MT sobre o fenótipo das células cancerosas imunomodulador, foram realizadas SKOV-3 /MLR experiências co-cultura. A adição de Kyn (Fig. 2A) ou a presença de células SKOV-3 (Fig. 2B) inibiram a proliferação de células T alorreactivas em MLR. Knockdown de IDO1 por siRNA não só reverteu a célula supressão SKOV-3 mediada por proliferação de células T, mas mesmo o aumento da proliferação de células T (Fig. 2C), provavelmente devido a uma estimulação alogénica adicional das células T pela ido-deficiente SKOV-3 células. Em seguida, testou os efeitos dos dois estereoisómeros de 1-MT. A adição de 1-metilo-L-triptofano (1-L-MT), também inverteu a supressão da proliferação de células T nas células SKOV-3 /MLR experiências co-cultura (Fig. 2D). Surpreendentemente, a proliferação de células T não foi melhorada mas inibiu em co-culturas tratadas com 1-metil-D-triptofano (1-D-MT, Fig. 2E). A adição de trp não alterou esta inibição, indicando que a depleção de trp não está envolvido neste efeito paradoxal de 1-D-MT (Fig. 2F). Em seguida analisou-se o efeito de 1-D-MT sobre a progressão do ciclo celular e a proliferação de SKOV-3 células, como um efeito inibidor de 1-D-MT sobre células SKOV-3 poderia explicar a absorção reduzida

3H timidina em as experiências de co-cultura (Fig. 3). No entanto, 1-D-MT alterada nem

absorção de 3H timidina (Fig. 3A) nem a progressão do ciclo celular de células SKOV-3 (Fig. 3B). Para descartar, que 1-D-MT pode ter inibido

absorção de timidina 3H por células SKOV-3 apenas quando estes foram cultivados na proliferação de células de MLR, T em co-culturas de SKOV-3 células com MLR na presença de diferentes As concentrações de D-1-MT foi medida por coloração com CFSE e citometria de fluxo (Fig. 3C). 1-D-MT-dependente da concentração inibiu a proliferação de células T também nestes ensaios (Fig. 3C), confirmando assim que o 1-D-MT inibe a proliferação de células T e não a proliferação de células SKOV-3 nas co-culturas.

(a), a expressão de ARNm relativa dos três enzimas de degradação da trp IDO1, IDO2 e triptofano-2,3-dioxigenase (TDO) (barras brancas) e a produção Kyn (barra preta), do SKOV-3 células, medida pela quantitativa RT-PCR e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). (B) Knockdown de

IDO1

mRNA por siRNA medido por qRT-PCR. (C) Análise de mancha de Western mostrando a expressão da proteína em IDO1 SKOV-3 células com knockdown siRNA mediada de IDO1 em comparação com os controlos. (D) Imunocitoqu�ica (vermelho, coloração IDO1; azul, coloração nuclear DAPI) do controle de células SKOV-3 e células SKOV-3 com IDO1 knockdown. release (E) Kyn de células SKOV-3 após knockdown de IDO1 em comparação aos controles. As experiências foram realizadas pelo menos em triplicado. Os dados são média ± SEM. * (P 0,05)

(A), a proliferação de células T alorreactivas após a adição de 25 uM KYN a reacções de leucócitos mista (MLR).. (B) Proliferação de células T alorreactivas na presença de 6000 células SKOV-3. (C) proliferação de células T em MLR co-cultivados com 2000 células controle SKOV-3 (barra branca) ou 2000 SKOV-3 células com um knockdown de IDO1 (barra preta). proliferação celular (D) T em co-culturas de MLR com 2000 células SKOV-3, após a adição de concentrações crescentes de 1-L-MT. a proliferação de células (E) T em co-culturas de MLR com 2000 células SKOV-3, após a adição de concentrações crescentes de 1-D-MT. (F) resultado Representante da MLR /SKOV-3 experimentos co-cultura com PBMC de cinco doadores diferentes e 2000 ou 6000 células SKOV-3. As células foram tratadas com ou sem 1 mM de 1-D-MT, em combinação com ou sem 250 uM trp. A proliferação foi medida por

3 [H] captação methylthymidine. As experiências foram realizadas pelo menos em triplicado. Os dados são média ± SEM. * (P 0,05)

(A)

3 [H] methylthymidine incorporação de Skov-3 células tratadas com 1 mM 1-D-MT (barra preta) ou veículo (branco. bar) durante 6 dias. (B) análise do ciclo celular de células SKOV-3 tratadas com 1 mM de 1-D-MT ou veículo durante 48 h. (C) Análise de Proliferação de linfócitos CFSE-coradas a partir de 6 dias de co-culturas de MLR com 2000 células SKOV-3, tratada com concentrações indicadas de 1-D-MT (painel superior). Lote de o número de células em cada geração da experiência acima (painel inferior).

1- D-MT aumenta a produção de Kyn em células cancerosas humanas

Em seguida, testamos o efeito de 1-MT sobre a produção Kyn de células SKOV-3. Surpreendentemente, 1-D-MT concentração-dependente aumento da formação Kyn (Fig. 4A), ao passo que o seu estereoisómero 1-L-MT formação Kyn inibido como esperado (Fig. 4A). A mistura racémica de 1-MT, que tem sido utilizado em muitos estudos, incluindo os que têm estabelecido IDO1 como uma enzima, a formação imunossupressora Kyn inibida, embora sozinho menos de 1-L-MT (Fig. 4A). Como concentrações trp nos meios de comunicação podem ter limitado o aumento da produção Kyn, também mediram as concentrações KYN produzidos por células SKOV-3 em resposta a 1-D-MT na presença de concentrações crescentes de trp. Sob estas condições, as concentrações mais elevadas foram KYN muito atingido (Fig. 4B), sugerindo que o patamar observado acima concentrações de cerca de 250? M 1-D-MT (Fig. 4A) foi devido à disponibilidade limitada de trp. Trp concentrações em meio de cultura celular normalmente variar entre 12 e 20 um enquanto que as concentrações na gama de soro humano entre 50 e 70 uM. formação Kyn em células tratadas com 1-D-MT foi mais pronunciada quando as concentrações trp presente no soro humano (62,5 uM) em vez de concentrações trp presente nos meios de cultura de células (15 ^ M), foram utilizados (Fig. 4C). No entanto, o aumento de vezes na KYN por adição de Trp foi igual em células tratadas com ou sem 1-D-MT (Fig. 4C). Para testar ainda se 1-D-MT influencia directamente IDO1 actividade enzimática foi medida a produção Kyn IDO1 mediada em extractos de células SKOV-3. 1-D-MT, não alterou a formação Kyn independentemente de Trp estava presente a uma concentração fixa de 100 uM (Fig. 4D) ou com concentrações equimolares de 1-D-MT (Fig. 4E), o que sugere que o aumento da formação de Kyn por 1-D-MT nas células SKOV-3 não é mediada por um efeito directo do 1-D-MT sobre a actividade enzimática IDO1.

concentrações de (a) Kyn libertadas por células SKOV-3 após o tratamento com 1- D-MT (círculos a branco), 1-L-MT (círculos pretos) e a mistura racémica de 1-MT (triângulos pretos) medida após 48 h por HPLC. (B) libertação Kyn de células SKOV-3 em resposta a 500? M 1-D-MT na presença de concentrações crescentes de trp. libertação (C) Kyn de SKOV-3 células tratadas com diferentes concentrações de Trp sozinho (círculos abertos) ou em combinação com 1 mM 1-D-MT (círculos a cheio) medida após 48 h por HPLC. produção (D) Kyn em ensaios enzimáticos IDO1 realizadas na presença de 100 uM trp em combinação com o aumento 1-D-MT concentrações. produção de (E) Kyn de enzima IDO1 na presença de concentrações crescentes de Trp sozinho (círculos abertos) ou em combinação com 1-D-MT (círculos a cheio). As experiências foram realizadas em triplicado. Os dados são média ± SEM. * (P 0,05).

IDO1 expressão é reforçada por 1-D-MT em células cancerosas humanas

Em seguida, investigamos se 1-D-MT influenciou a expressão de Trp-enzimas metabolizadoras. Para nossa surpresa, descobrimos que 1-D-MT aumentou mRNA e proteína IDO1 em células SKOV-3, enquanto IDO2 e TDO permaneceu inalterada (Fig. 5A). A sobre-regulação de ARNm IDO1 foi (Fig. 5B), dependente da concentração e foi detectado pela primeira vez após 16 h de incubação com 1-D-MT (Fig. 5C). Mais importante, os efeitos de promoção IDO1 não foram restritas a células SKOV-3. Enquanto 1-D-MT não induziu

de novo

mRNA IDO1 expressão e Kyn de produção em células de carcinoma cervical IDO1 negativo HeLa, aumentou mRNA IDO1 e produção Kyn após a indução da expressão IDO1 e produção Kyn por IFN- γ (Fig. 6A, B). Curiosamente, a supra-regulação 1-D-MT-mediada de ARNm IDO1 em muitas células cancerosas IDO1-negativo foi diferencialmente dependente da concentração de IFN-γ que foi utilizado para induzir

de novo

expressão de IDO1 (Fig. 6C). Depois de estimulação com concentrações de IFN-γ apropriadas, 1-D-MT aumentada de ARNm IDO1 e produção Kyn num painel de células cancerígenas diferentes (Fig. 6C-F), indicando um mecanismo universal de activação 1-D-MT-mediada de IDO1 .

(a) painel esquerdo: expressão de mRNA de IDO1, IDO2 e TDO em células SKOV-3 após o tratamento com 1 mM 1-D-MT, analisados ​​após 24 h por qRT-PCR. Painel da direita: análise Western blot da expressão IDO1 em células SKOV-3 realizada após 48 h de 1 mM de 1-D-MT. GAPDH serviu como controle de carga. (B) a expressão de ARNm IDO1 em resposta a concentrações crescentes de 1-D-MT medidos após 24 h por qRT-PCR. Análise (C) Tempo de indução de ARNm curso IDO1 por 1 mM de 1-D-MT, analisados ​​por qRT-PCR. As experiências foram realizadas em triplicado. Os dados são média ± SEM. * (P 0,05).

(A) gráficos de HPLC representativos de produção Kyn de células HeLa, que foram ou não tratados, tratados com 1 mM 1-D-MT e /ou IFN-y 1000 U y durante 72 h. Absorção de Kyn foi medida a 365 nm. (B) Em células HeLa não tratadas 1 mM de 1-D-MT não induziu

de novo

IDO1 ARNm, mas aumentou o ARNm IDO1 após a sua indução por 1000 L expressão de ARNm de IFN-γ foi analisada por qRT-PCR 24 h após o tratamento. (C) Exemplo representativo do efeito de diferentes concentrações de IFN-γ sobre a indução de mRNA IDO1 por 1-D-MT, mostrado em células de glioma U251. (D) a expressão de ARNm IDO1 de linhas de células indicou que foram estimuladas durante 24 h com concentrações apropriadas de IFN-γ isolado (barras brancas) ou em combinação com 1 mM 1-D-MT (barras pretas). (E) Exemplo representativo de indução de ARNm IDO1 por 200 uM 1-D-MT em células de glioma T98G estimulada por IFN-y. libertação (F) Kyn de linhas de células indicou que foram estimuladas durante 72 h com concentrações apropriadas de IFN-γ sozinho (barras brancas) ou em combinação com 1 mM 1-D-MT (barras pretas), medido por HPLC. As experiências foram realizadas em triplicado. Os dados são média ± SEM. * (P 0,05).

expressão IDO1 1-D-MT-mediada envolve JNK e p38 MAPK

Em seguida, explorou vias envolvidas na regulação positiva de IDO1 em resposta à sinalização tratamento 1-D-MT. STAT1 fosforilação mediada por IFN está envolvido na indução de IDO1 em muitas células e tecidos diferentes [30], mas knockdown de STAT1 por siARN não diminuem a produção de Kyn-1-MT-D células tratadas (Fig. 7A). Em linha com este resultado, 1-D-MT não induziu a expressão do mRNA de IFN-β ou IFN-γ (Fig. 7B). Mitógeno proteína quinase activada (MAPK) Vias foram relatados para ser modulada pela mistura racémica de 1-MT e influenciar, assim, a polarização de células dendríticas (DC) [31]. Portanto, testou-se se a inibição da sinalização de MAPK afectado o aumento de 1-D-MT-mediada na expressão IDO1. A inibição da fosforilação de ERK por PD98059 afectada expressão de ARNm IDO1 e libertação Kyn nem no tratado nem em 1-D-MT células tratadas (Fig. 8A). Enquanto que a inibição de p38-MAPK fosforilação por SB203580 [32] ligeiramente reduzida de ARNm IDO1 em células não tratadas, é atenuado quase completamente o aumento na expressão do mRNA IDO1 em resposta a 1-D-MT (Fig. 8B). A ligeira inibição da IDO1 Transcrição em células não tratadas não se traduziram em Kyn libertação significativamente reduzida, enquanto que a redução na libertação de Kyn tornou-se significativa em 1-D-MT células tratadas (Fig. 8B). Resultados semelhantes foram obtidos quando inibir a JNK por SP600125 (Fig. 8C) [33]. Colectivamente, estes dados sugerem que p38 MAPK e sinalização de JNK estão envolvidos na mediação da indução de IDO1 em resposta a 1-D-MT.

(A) knockdown de ARNm de STAT1 por SI-ARN (barras brancas) não afectou libertação KYN (barras pretas) de 1-D-MT (1 mM), tratados com células SKOV-3. (B) Análise de IFN-γ e a expressão de ARNm de IFN-β em células SKOV-3, após a estimulação com 1 mM de 1-D-TA durante 24 h.

IDO1 ARNm (painel da esquerda) e Kyn libertação (painel da direita) de SKOV-3 células tratadas com (a) 50 uM da PD98059 inibidor de MEK1, (B) 20 uM da SB203580 p38 inibidor de MAPK e (C) 20 uM da SP600125 inibidor da JNK ou de controlo 1 h antes de adição de 1 mM de 1-D-MT analisados ​​por qRT-PCR após 24 h e HPLC após 48 h, respectivamente. As experiências foram realizadas em triplicado. Os dados são média ± SEM. * (P 0,05)

Discussão

Na inibição IDO passado foi principalmente conseguida usando a mistura racémica de 1-MT [34].. Quando se tornou aparente que a inibição de IDO podem ser um alvo promissor para a terapia do cancro, os estereoisómeros individuais de 1-MT foram investigadas em maior detalhe [5], [35]. Embora 1-L-MT foi mostrado para inibir de forma mais eficaz IDO1 em ensaios de enzima e em linhas celulares de cancro, 1-D-MT mostrou actividade anti-tumoral superior em modelos de ratinho e, portanto, foi escolhido para os ensaios clínicos [35]. Um estudo subsequente sugeriu que a actividade anti-tumoral superior de 1-D-MT pode resultar da inibição da isoforma IDO2 [27]. Estudos recentes indicaram que 1-D-MT inibe a actividade IDO nem em culas dendricas, nem nas células tumorais [26], [28] e não eficazmente restaurar prisão induzida por ido de proliferação de célula T [36]. No nosso estudo, 1-D-MT suprimiu a proliferação de células T quando as células constitutivamente expressando IDO1 SKOV-3 foram co-cultivadas com reacções mistas de linfócitos (Fig. 2E, F). Investigação dos mecanismos subjacentes surpreendentemente revelado que 1-D-MT aumentou a produção de células cancerosas Kyn com actividade IDO1 (Fig. 4, 6), devido a sobre-regulação de ARNm IDO1 e a expressão de proteína (Fig. 5, 6). A regulação positiva da expressão IDO1 e a actividade foi observada apenas em células de cancro com expressão IDO1 constitutiva ou induzida por IFN-γ (Fig. 5, 6). A sobre-regulação de IDO1 por 1-D-MT em muitas células de cancro foi mais proeminente em concentrações moderadas de IFN-γ que são susceptíveis de se assemelhar a concentrações fisiológicas (Fig. 6c). Baixas concentrações de IFN-γ pode não ter expressão induzida IDO1 suficiente (Fig. 6C), o que poderia explicar por que 1-D-MT não aumentou IDO1 a estas concentrações, enquanto que a estimulação com concentrações muito elevadas de IFN-γ pode ter resultado em máxima indução IDO1 (Fig. 6C), o que explica por que outro aumento de 1-D-MT não foi observado. Em todas as células IDO1-expressam examinados um aumento na IDO1 expressão e Kyn de libertação foi observado em resposta ao tratamento com 1-D-MT, indicando um mecanismo geral envolvido na indução IDO1 1-D-MT-mediada (Fig. 4, 5, 6).

Num estudo anterior, a mistura racémica de 1-MT tem sido relatado para modificar a polarização de células dendríticas (DC) através da modulação de MAPK [31]. A inibição da fosforilação de p38 MAPK preveniu o aumento em ARNm e produção IDO1 Kyn por sinalização 1-D-MT (Fig. 8B), o que sugere que a p38-MAPK participa em 1-D-MT mediada. Em linha com este resultado, a p38 MAPK foi anteriormente mostrado para contribuir para a indução de IDO1 numa linha celular de leucemia e em DC [37], [38]. Além disso a inibição da sinalização de JNK atenuado a indução de ARNm IDO1 e libertação Kyn, na presença de 1-D-MT (Fig. 8C). A inibição da fosforilação de JNK foi recentemente descrito para diminuir IDO1 expressão induzida por LPS em microglia de ratinho [39]. 1-D-MT modulação mediada pelo p38-MAPK e JNK sugere que 1-D-MT pode ter mais efeitos do que apenas a regulação positiva de IDO1.

Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório de 1-D- efeitos sobre a expressão do gene em células humanas MT-mediada. O estereoisómero de 1-D-MT, 1-L-MT foi recentemente relatado para suprimir a expressão induzida por IFN-γ IDO1 de rato em células de carcinoma retal [40]. Além disso, tem sido descrito anteriormente que o 1-MT influencia a maturação de DC, independentemente da IDO [31]. No entanto, a mistura racémica de 1-MT foi utilizado neste estudo e que, portanto, não é conhecido qual estereoisómero era responsável pelos efeitos observados [31]. Ele continua a ser elucidado se 1-D-MT exerce mais efeitos na expressão do gene do que a regulação da IDO1. Em contraste com IDO1, a enzima IDO2 Trp-catabólicos não foi induzida por 1-D-MT. Este achado sublinha a noção de que IDO1 e IDO2 são diferencialmente regulada em um nível de transcrição [27]. Possíveis outros efeitos de 1-D-MT sobre a expressão do gene pode contribuir para a elevada eficácia anti-tumor de 1-D-MT observada em modelos de tumor de rato [35]. Existem diferenças significativas na expressão IDO e regulação entre humanos e ratos [29], [41], o que poderia explicar as discrepâncias observadas refere à acção 1-D-MT em modelos de ratos e células humanas. Em um estudo utilizando 1-D-MT na SIV-infectados macacos rhesus, um modelo mais parecida com os humanos do que os modelos de mouse, Boasso e colegas observaram que os níveis de Kyn plasma não foram reduzidos, mas sim induzida durante o tratamento com 1-D-MT [42 ]. O aumento da expressão de mRNA IDO1 em gânglios linfáticos de macacos após tratamento 1-D-MT foi interpretado como um mecanismo contra-reguladora compensatório activado por 1-D-MT, o que pode ter contribuído para a falta de efeito sobre Kyn plasma [42]. Os nossos dados mostram que a sobre-regulação de IDO1 e Kyn ocorrer também em células humanas isoladas, em que um mecanismo de contra-reguladora que medeia a imunossupressão é improvável.

Como não há evidências de que IDO1 pode restringir o crescimento do tumor como um mediador de tumoricida IFN -γ em modelos experimentais e pacientes [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22] e, como expressão IDO1 em tumores positivamente correlacionada com sobrevida livre de progressão e longo sobrevivência a longo prazo em alguns estudos [23], [24] é tentador especular que a indução de IDO1 por 1-D-MT pode realmente explicar alguns dos efeitos anti-tumorais de 1-D-MT.

em conclusão, nós identificamos a regulação positiva da expressão IDO1 em células de cancro humano como um profundo efeito de 1-D-MT, um composto actualmente utilizados em estudos clínicos em pacientes com tumores sólidos reincidente ou refractária, com o objectivo de inibir (IDO ) tumor de escape imune mediada. IDO1 expressão é conhecida por ser imunossupressora e podem aumentar a fuga imunitária do tumor, mas que tem também sido implicado em efeitos directos anti-tumorais. Mais estudos são necessários para entender melhor o papel da IDO na biologia do câncer e o uso potencial de 1-D-MT como um agente anti-cancro.

cultura celular Materiais e Métodos Comprar e reagentes

SKOV-3 e NIH: OVCAR-3 células de carcinoma do ovário foram cultivadas em meio de McCoy 5A (BioConcept, Allschwil, Switzerland) suplementado com L-Trp, tal como indicado (Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha), 300 mg /L Glutamina (Carl Roth, Karlsruhe, Alemanha), FBS a 10% (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, EUA) e 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (PAA Laboratories, Pasching, Austria). HeLa de carcinoma cervical, células de melanoma maligno A375, células de glioma maligno LN18, LNT229, T98G e U251 foram mantidas em meio modificado de Dulbecco de Eagle (DMEM, PAA) contendo 10% de FBS (Thermo Fisher Scientific Inc) e 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (PAA Laboratories). As células mononucleares de sangue periférico (PBMC) foram isoladas a partir de cinco, não-relacionadas com doadores de sangue saudáveis, por centrifugação em gradiente de densidade usando separação de linfócitos LSA médio 1077 (PAA Laboratories) e cultivadas em meio RPMI 1640 (PAA Laboratories) contendo 10% de FBS (Thermo Fisher Scientific Inc) e 100 U /mL de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (PAA Laboratories). Todas as células foram rotineiramente testadas quanto à contaminação pela célula Multiplex contaminação de teste [43]. As culturas foram incubadas a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera

20 mM de soluções de reserva de 1-metil-D-triptofano (1-D-MT, números de lote: 09315BH, 08007EJ). e 1-metil-L-triptofano (1-L-MT, números de lote: 08023HE, 15399MJ) (Sigma-Aldrich) foram preparadas por dissolução dos inibidores em NaOH 0,1 N. O pH foi ajustado para 7,5 utilizando ácido clorídrico. Para evitar a contaminação das culturas celulares, as soluções de estoque foram filfotered através de filtros de 0,2 um. IFN-γ foi comprado de Immunotools (Friesoythe, Alemanha). ERK fosforilação foi inibida usando o inibidor PD98059 MEK1 (Cell Signaling Technology, Beverly MA, EUA). A quinase c-Jun N-terminal (JNK) SP600125 inibidor e o inibidor de quinase p38 fosforilação SB203580 foram adquiridos a Life Sciences Enzo (Lorrach, Alemanha).

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC)

cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) foi realizada de acordo com [44] utilizando um Beckman HPLC com fotodíodos (PDA) de detecção e Lichrosorb RP-18 de coluna (250 mm x 4 milímetros ID, 5 um, Merck, Darmstadt, Alemanha ). libertação Kyn e degradação do trp foram medidos na forma de 3 * 10

5 células em 2 Meio de mL McCOY 5A (BioConcept) contendo 10% de FBS (Perbio), 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (PAA Laboratories ) suplementado com 0-125 uM de L-Trp (Sigma-Aldrich). O meio foi recolhido a partir de placas de 6 cavidades nos pontos de tempo indicados, centrifugado e congelado até análise posterior. Após descongelação, as amostras foram suplementadas com ácido tricloroacético para a precipitação de proteínas, centrifugadas e 100 ul de sobrenadante foi analisada por HPLC. As curvas padrão foram geradas com L-Kyn e L-Trp (Sigma-Aldrich) no mesmo meio. Desde FBS contém Kyn, baixas concentrações de KYN (~ 1 | iM) foram detectadas em todas as amostras e meio sem células foi sempre medida para comparação.

quantitativa (Q) por RT-PCR

O ARN total foi isolado com o kit de isolamento de ARN RNAeasy da Qiagen (Hilden, Alemanha) e o ADN foi sintetizada com o Applied Biosystems transcrição reversa-kit (Foster City, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. QRT-PCR foi executada em um termociclador ABI 7000 com SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) de acordo com protocolos padrão. As reações de PCR foram verificados pela inclusão de não-RT-controles, por omissão de modelos e tanto pela curva de fusão e análise de gel. As curvas padrão foram geradas para cada gene. A quantificação relativa da expressão do gene foi determinada por comparação de valores de limiar. Todos os resultados foram normalizados para GAPDH, que variou nem com o IFN-γ nem tratamento 1-D-TA

sequências de iniciadores foram (5′-3 ‘para a frente, reverso):.

CTCTCTGCTCCTCCTGTTCGAC, TGAGCGATGTGGCTCGGCT (GAPDH),

TTCAGTGCTTTGACGTCCTG, TGGAGGAACTGAGCAGCAT (IDO1),

TGCTTCATGCCTTTGATGAG, GAAGGCCTTATGGGAAGGAG (IDO2),

ACTGCCTCAAGGACAGGATG; AGCCAGGAGGTTCTCAACAA (IFN-β),

TCGGTAACTGACTTGAATGTCCA; TCCTTTTTCGCTTCCCTGTTTT (IFN-γ),

AGGAAAAGCAAGCGTAATCTTCA; TATTCCCCGACTGAGCCTGAT (STAT1),

GGTTCCTCAGGCTATCACTACC; CAGTGTCGGGGAATCAGGT (TDO)

experimentos de siRNA

Para knockdown IDO1 (INDO) e STAT1 ON-TARGETplus SMART-piscina siRNA por Dharmacon RNA Technologies (Lafayette, CO, EUA) foi utilizado.

As sequências foram as seguintes:

INDO Humano, NM_002164

, sentido, 5′-UCACCAAAUCCACGAUCAUUU-3 ‘, antisense, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′; sentido, 5’-UUUCAGUGUUCUUCGCAUAUU-3 ‘, anti-sentido, 5′-PUAUGCGAAGAACACUGAAAUU-3′; sentido, 5’-GUAUGAAGGGUUCU GGGAAUU -3 ‘, anti-sentido, 5′-PUUCCCAGAACCCUUCAUACUU-3′; sentido, 5’-GAA CGGGACACUUUGCUAAUU-3 ‘, anti-sentido, 5′-PUUAGCAAAGUGUCCCGUUCUU-3’

STAT1 humano, NM_139266

, sentido, 5′-GCACGAUGGGCUCAGCUUUUU-3 ‘, anti-sentido, 5 ‘-PAAAGCUGAGCCCAUCGUGCUU-3′; sentido, 5’-CUACGAACAUGACCCUAUCUU-3 ‘, anti-sentido, 5′-PGAUAGGGUCAUGUUCGUAGUU-3′; sentido, 5’-GAACCUGACUUCCAUG CGGUU-3 ‘, anti-sentido, 5′-PCCGCAUGGAAGUCAGGUUCUU-3′; sentido, 5’-AGAAAGAG CUUGACAGUAAUU-3 ‘, antisense, 5′-PUUACUGUCAAGCUCUUUCUUU-3’.

ON-TARGETplus siCONTROL não-alvo Exterior (D-001810-10-05, Dharmacon) e uma transfecção sem siARN foram usadas como controlos negativos.

Para a transfecção de ARNsi, foi utilizado o Amaxa Nucleofector Kit V (Amaxa Biosystems, Koeln, Germany). Resumidamente, 3 * 10

5 células foram ressuspensas em 100 ul da solução de Nucleofector V e misturou-se com 1,5? G de siRNA, então electroporadas utilizando o programa V005. O meio foi mudado após 24 h, a análise do conteúdo Kyn do meio por meio de HPLC, a colheita das células para a extracção de RNA ou a geração de lisados ​​e análise imunocitoquímica foram realizadas após 48 h.

análise de Western Blot

lisados ​​celulares totais foram preparados de gelo frio de tris (hidroximetil) aminometano (TRIS-HCl, 50 mM, pH 8,0; Carl Roth) contendo NaCl 150 mM (JT Baker, Deventer, Países Baixos), 1% de Triton X-100 (Applichem, Darmstadt, Alemanha), 10 mM de EDTA (Gerbu Biotechnik, Gaiberg, Alemanha), ditiotreitol 200 mM (Carl Roth), 3% de 2-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich), 100 uM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 10 ug /mL de aprotinina e 5 ug /ml de leupeptina (Carl Roth) e centrifugado a 4 ° C (10 min, 13 000 rpm).