Abstract
Helicobacter pylori
(
H
.
pylori
) é uma bactéria Gram-negativos bactéria em forma de espiral que faz com que a crônica mais comum infecção do estômago humano. Cerca de 1% a 3% dos indivíduos infectados desenvolvem câncer gástrico. No entanto, os mecanismos pelos quais
H
.
pylori
induz câncer gástrico não são completamente compreendidos. Os dados disponíveis indicam uma forte ligação entre o fator de virulência do
H
.
pylori
, gene associado a citotoxina A (CagA) e câncer gástrico. Para caracterizar ainda mais
H
.
pylori
virulência, estabelecemos três linhas de células, infectando as linhas celulares de cancro gástrico SGC-7901 e AGS com
cagA
+
H
.
pylori Comprar e transfecção SGC-7901 com um vector que transporta o full-length
cagA
gene. Detectamos 135 proteínas diferencialmente expressas a partir de três linhas de células que utilizam a tecnologia proteoma, e 10 proteínas diferenciais ordinárias para as três linhas celulares foram seleccionadas e identificados por LC-MS /MS, bem como verificada por Western Blot: p-actina, L-lactato desidrogenase (LDH), desidrogenase de di-hidrolipoamida (DLD), pré-ARNm de transformação de factor de 19 homólogo (PRPF19), ATP sintase, da calmodulina (CaM), PCCL p64,-Ran específica de proteína de activação de GTPase (RanGAP), P43 e calreticulina. Detecção da expressão destas proteínas e genes que codificam para estas proteínas em tecidos de cancro gástrico humano por PCR em tempo real (RT-qPCR) e por Western blot revelou que a expressão de
β-actina
,
LDH
,
DLD
,
PRPF19
e
CaM
genes foram regulados positivamente e
RanGAP
foi regulada para baixo em tecidos com câncer gástrico e /ou linfonodos metastático em comparação com tecidos peri-cancerosas. Observou-se alta expressão de gene para a
H
.
pylori
infecção em tecidos de câncer gástrico. Além disso, o
LDH
,
DLD
e
CaM
genes foram desmetilado no promotor -2325, -1885 e -276 locais, respectivamente, e o
RanGAP
gene foi altamente metilado no promotor -570 e -170 sites em
H
.
pylori
infectado e
cagA
células -overexpressing. Estes resultados fornecem novos insights sobre as metas Patogênese e Tratamento moleculares para o câncer gástrico com
H
.
pylori
Citation:. Zhou J, Wang W, Xie Y, Zhao Y, Chen X, Xu W, et al. (2016) Proteomics-Based identificação e análise de proteínas associadas com a
Helicobacter pylori
no câncer gástrico. PLoS ONE 11 (1): e0146521. doi: 10.1371 /journal.pone.0146521
editor: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO
Recebido: 15 Setembro, 2015; Aceito: 19 de dezembro de 2015; Publicação: 08 de janeiro de 2016
Direitos de autor: © 2016 Zhou et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel
Financiamento:. o trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (81260303, 31560326), Guizhou fundação província (QianJiaoHe [2014] 06) e Projeto chave de Ciência e Tecnologia de Guizhou província (QianKeHe SY [2011] 3067, QianKeHe J [2012] 2039). Na versão original, o trabalho foi financiado pelo National Science Foundation Natural da China (81260303, 31560326) e Projeto Chave de Ciência e Tecnologia da província de Guizhou (QianKeHe SY (2011) 3067)
Conflito de interesses:. O os autores declararam que não existem interesses conflitantes.
Introdução
Helicobacter pylori
(
H
.
pylori
) faz com que a maioria a infecção de estômago crônica comum em seres humanos em todo o mundo. Aproximadamente metade da população mundial está infectada com o
H
.
pylori
, e a maioria dos indivíduos colonizados desenvolver gastrite assintomática. Entre os indivíduos infectados, cerca de 10% -20% dos indivíduos a desenvolver doenças de úlcera péptica e 1% -3% desenvolvem câncer gástrico [1,2]. Em 1994,
H
.
pylori
foi classificada como um tipo I carcinógeno para o câncer gástrico pela Agência Internacional de Investigação do Cancro da Organização Mundial da Saúde.
O câncer gástrico é um dos tipos mais comuns de câncer, e mais de 70% dos novos casos e mortes ocorrem nos países em desenvolvimento [3]. Embora a taxa de incidência global tem vindo a diminuir há várias décadas, o câncer gástrico continua a prevalecer na maioria dos países em desenvolvimento, incluindo o Japão, Coréia e China [4-6]. Em 2012, o Relatório Anual de Registro de Câncer chinês indicaram que a morbidade do câncer gástrico e mortalidade são segundo e terceiro lugar entre todos os tumores malignos, respectivamente.
A maioria dos
H
.
pylori
cepas carregam o
cag
ilha de patogenicidade (
cag
PAI), que contém 27 a 31 genes que codificam um sistema de secreção do tipo 4 bacteriana (T4SS) [7] . O gene associado a citotoxina um gene (
cag
), que está localizado na extremidade 3 ‘de
cag
PAI, codifica a oncoproteína bacteriana conhecida apenas, CagA, que é translocado para células hospedeiras por T4SS após a fixação bacteriana para o estômago. Uma vez no interior das células hospedeiras, CagA é tirosina fosforilada por membros da família da cinase Abl e Src e interage com vários efectores intracelulares, conduzindo à activação de moléculas de sinalização a jusante [8]. Em estudos clínicos,
cagA
-positivas têm sido consistentemente associada à inflamação gástrica mais grave e úlceras, e uma pequena fração de indivíduos desenvolvem câncer gástrico [9]. No entanto, os mecanismos subjacentes à associação de CagA com cancro não foram elucidados.
Proteomics emergiu como uma plataforma tecnológica prometedora para a identificação de biomarcadores e racional novos alvos terapêuticos para as doenças e a determinação dos mecanismos subjacentes de carcinogênese [10]. No entanto, a maioria das proteínas importantes detectados por proteómica in vitro não foram confirmados in vivo em amostras clínicas.
a metilação do DNA e a desmetilação desempenha um papel importante no desenvolvimento e progressão de cancros através do bloqueio da ligação de factores de transcrição ao ADN e é ocorre quase exclusivamente no promotor do gene de ilhas CpG [11-13]. Entre os órgãos, o estômago apresenta a maior frequência de anormal metilação ilha CpG, possivelmente,
H
.
pylori
mediada [14-16]. Embora os estudos de metilação do DNA estão aumentando, os estados de metilação do gene induzida por
H
.
pylori
ainda não são claros.
Neste trabalho, o objetivo foi identificar as proteínas específicas relacionadas com a
H
.
pylori
infecção usando proteômica comparativas e caracterizar a expressão do gene e CpG ilha metilação destas proteínas em tecidos de câncer gástrico e células.
Materiais e Métodos
tecidos humanos
Os tecidos humanos foram obtidos a partir de amostras de cirurgia de 30 pacientes com câncer gástrico e combinados tecidos de câncer adjacentes e linfonodos metastáticos em Guiyang Hospital Medical, Guiyang China, entre janeiro de 2009 e junho de 2010. Os diagnósticos foram confirmados por dois patologistas. Entre os pacientes, 23 eram do sexo masculino e 7 do sexo feminino. Os pacientes tinham idades de 38 a 77 anos. Vinte e dois pacientes tiveram tipo intestinal adenocarcinoma, e 8 tinham difusa do tipo adenocarcinoma. O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Guiyang Hospital Medical Ética, e todos os assuntos previstos consentimento informado por escrito.
cultura celular
A linha de células de carcinoma gástrico humano AGS (ATCC CRL-1739TM) e células SGC-7901 foram adquiridos diretamente da American Type Culture Collection (ATCC) e Cell Bank of Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China), respectivamente, e passados por menos de 3 meses em nosso laboratório após o recebimento. As células foram cultivadas em Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino inactivado pelo calor, 100 U /ml de penicilina e 100 ug /ml de estreptomicina (Gibco, Grand Island, NY, EUA) a 37 ° C em uma incubadora umidificada com 5% de CO
2.
H
.
pylori
cultura
H
.
pylori
estirpe NCTC11637 (ATCC 43504, um presente do Centro Chinês de
Helicobacter pylori
estirpe de Gestão e Preservação, Beijing, China), que é
cagA
positivo, foi cultivadas em meio selectivo sobre uma placa de agar de Columbia contendo 10% de soro fetal de vitelo e
H
.
pylori
Selective Supplement (Oxoid Ltd, Inglaterra) a 37 ° C em condições microaer�icas.
infecção celular com
H
.
pylori
AGS e células SGC-7901 (5 × 10
5) foram semeadas em placas de 6 poços por 24 horas e infectadas com o
H
.
pylori
durante 6 h e 12 h, a uma multiplicidade de infecção (MOI) de 1: 100, 1: 500 e 1: 1.000, respectivamente. As células foram infectadas durante 12 horas a um MOI de 1: 1000 com
H
.
pylori
fervido durante 15 min como controles.
Construção do vector pcDNA3.1 expressão /
cagA
O DNA foi extraído a partir de
H
.
pylori, e o de comprimento total
sequência cag
foi sintetizado por PCR e clonados em plasmídeos pMD18-T para construir pMD18-t /
cag
. O
gene cagA
foi identificado por sequenciação (GQ161098). pMD18-T /
cagA
foi digerido com as enzimas de restrição
Pst
I e
Bam
HI, e
cagA
foi ligado em pcDNA3.1 /Zeo (-) (Invitrogen, EUA) para construir o /
cagA
eucariótica vector de expressão pcDNA3.1. As sequências dos iniciadores são apresentados na Tabela 1.
transfecção celular com pcDNA3.1 /
cagA
células SGC-7901 foram incubadas por 12 h em placas de 6 poços para se obter 80% de células confluentes. As células foram então transfectadas de acordo com as instruções do fabricante. Após 48 h, as células foram divididas 1:10 para novas placas de 6 poços e incubadas durante mais 24 h e em seguida mantidas em meio selectivo padrão contendo zeocina (250? G /mL) durante 2 semanas até à formação de clones. As células transfectadas com o vector pcDNA3.1 vazio /Zeo (-) foram utilizadas como controlos
Extracção de proteínas e Western Blot
Os extractos de proteína foram preparados por ressuspensão peletes de células num tampão RIPA ou homogeneizar 200. tecidos mg num tampão RIPA. Um total de 30-50 ug de extracto de proteína foi sujeito a electroforese em gel de SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF) (Millipore, Billerica, MA, EUA) e colocados a hibridar durante a noite com anticorpo anti-CagA monoclonal de ratinho (1: 800, SC-28368), o anticorpo monoclonal de ratinho anti-fosfotirosina (PY99, 1: 300, SC-7020), anticorpo policlonal de coelho anti-beta-actina (1: 500, ab189073), anticorpo anti-LDH policlonal de coelho (1: 350 , ab125683), monoclonal de ratinho anti-DLD (1: 800, SC-376890), anticorpo policlonal de coelho anti-PRPF19 (1: 400, ab27692), anticorpo sintase anti-ATP monoclonal de ratinho (1: 300, ab54880), anticorpo policlonal de coelho anti -calmodulina anbody (1: 250, ab208911), anticorpo anti-RanGAP policlonal de coelho (1: 200, ab92360), anticorpo anti-p64CLCP policlonal de coelho (1: 300, ab28722), anticorpo anti-calreticulina policlonal de coelho (1: 350, AB4) e anticorpo -dehydrogenase-3-fosfato de gliceraldeido anti-rato monoclonal (GAPDH, 1: 8000) de Santa Cruz (CA, EUA), Abcam (Cambridge, Reino Unido) e CangChen (Xangai, China), respectivamente, em 5% solução salina de BSA em Tris-tamponada e 0,01% de Tween-20. Os anticorpos secundários conjugados com peroxidase (1: 5000, SC-2371, Santa Cruz, CA, EUA) foram utilizados e desenvolvidos com o reagente ECL Plus usando quimioluminescência Hyperfilm (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Reino Unido). Quantificação dos Western blots foi realizada utilizando Quantity One Software. Cada experiência foi realizada 3 vezes, e um resultado representativo é mostrado.
Extracção de proteínas e bidimensional electroforese em gel
As pelotas de células foram dissolvidas em tampão de lise celular durante a noite a 4 ° C, e proteínas foi precipitado com três volumes de acetona gelada por incubação a 4 ° C durante 2 h. As amostras foram em seguida centrifugadas a 20.000 rpm durante 30 minutos, e os peletes foram ressuspensas em tampão de lise de células e armazenadas a 4 ° C durante a noite.
Um total de 800 ug de proteína foi ajustada para um volume de 250 uL com uma solução de re-hidratação, e focagem isoeléctrica (IEF) foi realizada utilizando um sistema de focagem isoeléctrica Ettan IPGphor II (Amersham Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. O protocolo para IEF foi de 300 V for1 h, a 500 V durante 2,5 h, 1000 V durante 2 h; 8000 V durante 8 h, 60 KVH (total).
Depois de completar o IEF, as tiras de IPG (Amersham Biosciences) foram equilibradas em tampão de equilíbrio durante 15 minutos e colocadas num gel de SDS-PAGE a 12% para dois electroforese dimensional a 30 mA /gel. O gel de SDS-PAGE resultante foi fixado em 20% TCA, durante 30 min e em seguida corado com Coomassie coloidal G-250 [5].
As manchas de proteínas no gel foram digitalizados e analisados automaticamente. spots de proteínas diferencialmente expressos foram confirmados com exames de imagem Mestre 2D 5.0 software analítico (Amersham Biosciences). teste t de Student foi realizado para a análise quantitativa dos géis 2D. A expressão diferencial de uma proteína específica foi definida como uma alteração ≥2 vezes na densidade óptica local entre os dois conjuntos combinados em duplicados. As manchas diferenciais foram então excisadas a partir dos géis de SDS-PAGE, para posterior identificação por LC-MS /MS.
extracção de ARN e RT-PCR quantitativo
O ARN total foi extraído a partir de 50 mg de tecido e tratado com DNase I (RNase-free). Os genes foram amplificados com SYBR Green (Applied Biosystems, Austrália). Hipoxantina-guanina fosforibosiltransferase (
HPRT) foi utilizada como um controlo de normalização, e os níveis de ARNm relativos foram calculados por um Comparativo C
T método utilizando um software Passo-(Applied Biosystems, Austrália) [8]. Cada amostra foi ensaiada em triplicado, e os resultados são expressos como a média ± DP. Os iniciadores utilizados são listados na Tabela 1.
extracção de ADN e análise de metilação de CpG islands
O ADN foi isolado a partir de células e modificado com bissulfito de sódio usando um DNA Metilação EZ-ouro Kit
™ (Zymo Research, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Promoter CpG ilhas foram previstos utilizando o software Metil Primer Express e amplificado a partir de ADN modificado com bissulfito por PCR utilizando os seguintes procedimentos: desnaturação a 96 ° C durante 10 min, seguido de 40 ciclos de desnaturação a 94 ° C durante 40 seg, emparelhamento a 60 ° C durante 40 seg, e alongamento a 72 ° C durante 40 seg, com uma extensão final a 72 ° C durante 10 min. Os produtos de PCR amplificados foram clonados em vectores de pMD19-T e sequenciados. Além disso, o ADN isolado a partir de tecidos tumorais foi utilizado para detectar
H
.
pylori
16S
rRNA
gene e
cagA
gene. As sequências dos iniciadores estão listadas na Tabela 2.
A análise estatística
Os resultados são expressos como médias ± DP. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o software SPSS 15.0. one-way análise de variância (ANOVA) e teste t de Student foram utilizados para analisar os dados.
P
. 0,05 (dois lados) foi considerado significativo
Resultados
Introdução de CagA em células cancerosas gástricas
Porque CagA de
H
.
pylori é um factor de virulência importante no desenvolvimento e progressão do cancro gástrico, CagA foi detectado em linhas celulares de cancro gástrico por RT-PCR e Western blot após infecção de células AGS SGC-7901 e com
H
.
pylori
e transfecção de células SGC-7901 com
cagA
-vector. A proteína CagA começaram a aparecer em uma proporção de células de bactérias de 1: 500 em células cultivadas em 6 horas, e o conteúdo foi mais elevada a uma razão de 1: 1000 em 6 h (Fig 1A e 1B). No entanto, CagA fosforilado foi observado em células a uma razão de 1: 500 após cultura durante 12 h, e o teor mais elevado foi observado em células a uma razão de 1: 1000 após 6 h de cultura. CagA mRNA e proteína também foram observados em forma estável
cagA
-overexpressing células SGC-7901 (Fig 1C e 1D). Estes dados sugerem que CagA foi introduzido com sucesso em três linhas celulares e fosforilada.
(A e B) Análise de Western blot de CagA e CagA fosforilada em
H
.
pylori
infectado SGC-7901 (A) e as células AGS (B). As células infectadas com a proporção indicada de células
H
.
pylori
durante o tempo indicado foram recolhidas e lisadas, e as proteínas foram separadas por SDS-PAGE. As células infectadas com o
H
.
pylori
fervida durante 15 minutos a uma MOI de 1: 1000 foram utilizadas como controlo. (C e D) de detecção de ARNm e proteína CagA em
cag
-overexpressing células SGC-7901 por RT-PCR (C) e Western blot (D). GAPDH serviu como controlo de carregamento. Os dados são representativos de três experiências independentes.
Hp
,
H
.
pylori
; P-CagA, CagA fosforilada; GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
Identificação de proteínas diferenciais em células cancerosas gástricas
Depois de células foram infectadas com
H
.
pylori
durante 6 horas a um MOI de 1: 1000 ou transfectada com
cag
-vector, uma técnica proteomic foi usada para criar seis electroforese bidimensional (2-dE) mapeia a partir de três linhas celulares e os seus respectivos controlos (Figura 2), e 135 manchas foram detectadas diferenciais, dos quais 73 foram regulados positivamente e 62 foram regulados negativamente. Dez diferencial pontos comuns a todas as três linhas celulares foram identificados por LC- MS /MS e verificados por western blot, incluindo 6 proteínas up-regulamentados: p-actina, LDH, DLD, PRPF19, ATP sintase e calmodulina (CaM), e 4 regulada de proteínas, tais como RanGAP, PCCL p64, P43 e calreticulina (Tabela 3 e Figura 3A).
SGC-7901 e as células AGS infectadas com o
H
.
pylori Compra de 6 h em um MOI de 1: 1000 (. Célula para
H
pylori
) e as células SGC-7901 transfectadas com pcDNA3.1 /
cag
durante 48 h foram recolhidas e lisadas, e as concentrações de proteína foram determinadas utilizando Bradford colorimetria. Um total de 800 ug de proteína foi carregada para a electroforese bidimensional. Células infectadas com fervida
H
.
pylori
ou transfectadas com um vector vazio serviram como controlos para as células infectadas ou transf ectadas, respectivamente. células SGC-7901 (A) infectados com o
H
.
pylori
. (B) células AGS infectados com o
H
.
pylori
. células (C) SGC-7901 transfectadas com o
cagA
-vector. (D) imagem ampliada de 10 pontos diferenciais. B4, B11, C6, C7, C8 e C9 pontos foram up-regulada, enquanto que D12, D16, pontos E2 e E11 foram regulados negativamente. Estas manchas são identificadas na Tabela 3.
(A) análise de transferência de Western das proteínas indicadas nas células de controlo (1),
H
.
pylori
células SGC-7901 infectados (2) e
cagA
-overexpressed células SGC-7901 (3). GAPDH serviu como controlo de carregamento. Os dados são representativos de três experiências independentes. (B) A análise quantitativa por RT-PCR dos genes indicados em 30 tecidos de cancro gástrico. Os valores são representados como Ct média vezes em comparação aos tecidos peri-cancerosas, onde os tecidos peri-cancerosas foram definidos para 1. (C) Análise de Western blot das proteínas indicadas em 30 tecidos de câncer gástrico. 200 mg tecidos foram homogeneizados e as proteínas totais foram recolhidos. Um total de 50 ug de proteína foram extractos submetido a electroforese em gel de SDS-PAGE. GAPDH serviu como controlo de carregamento. (D) Detecção do
H
.
pylori
16S
rRNA
gene e
cagA
gene em tecidos com câncer gástrico por PCR (Superior). M representa o marcador de peso molecular de DNA. Pista 1 é o controlo positivo. A pista 2 é o controle negativo. Lanes 3, 4 e 6 são amostras positivas. As pistas 5 são amostras negativas. A análise por RT-PCR quantitativa dos genes indicados em tecidos de cancro gástrico com e sem
H
.
pylori
infecção (Baixa). Os valores são apresentados como a média Ct vezes em comparação com o grupo sem
H
.
pylori
infecção, que foi definido como 1. A figura apresenta a média de 30 amostras. Os dados estão apresentados como médias ± DP. As barras de erro representam os desvios padrão. LDH, L-lactato desidrogenase. DLD, di-hidrolipoamida desidrogenase. PRPF19, pre-mRNA processamento fator 19 homólogo. RanGAP, proteína de activação de GTPase-Ran específica. CaM, calmodulina. PCCL p64, cloreto nuclear proteína canal iônico. *,
P Art 0,05 em comparação ao tecido peri-cancerosas (B e C) e tecidos, sem
H
.
pylori
infecção (D).
H
.
pylori
promove a expressão de proteínas diferenciais em tecidos com câncer gástrico
porque
H
.
pylori
coloniza seletivamente o estômago humano para ativar um conjunto de processos patológicos, a expressão gênica de 10 proteínas diferenciais em 30 amostras de cancro gástrico humano foi avaliada por RT-PCR quantitativo. Dos 10 genes, a expressão de
β-actina
,
LDH
,
DLD
,
PRP19
e
CaM
em cancros gástricos e /ou linfonodos metastáticos foram supra-regulados em comparação com tecidos peri-cancerosas, ao passo que a expressão de
RanGAP
foi regulada para baixo. Do mesmo modo, as 6 proteínas também foram expressos de forma anormal nos mesmos tecidos (Fig 3B e 3C). Não foram observadas diferenças significativas na expressão de outros genes.
H
.
pylori
a colonização do tecido câncer gástrico foi medida através da detecção 16S
rRNA
gene e
cagA
gene da
H
.
pylori
por PCR.
H
.
pylori
estava presente em 20 das 30 amostras (taxa positiva de 67%), e todos
H
.
pylori
cepas são
cagA
positivo. Os níveis de mRNA de
β-actina
,
LDH
,
DLD
,
PRP19 e CAM
foram maiores no
H
.
pylori
tecidos -positivas do que nas amostras negativas (Fig 3D).
H
.
pylori
induz a metilação do DNA aberrante em células cancerosas gástricas
Em três linhas celulares, produtos de PCR das ilhas CpG dos genes acima foram adquiridos com sucesso após o tratamento com bissulfito e sequenciado. Nestes genes,
LDH
,
DLD
e
CaM
genes foram desmetilado no promotor -2325, -1885 e -276 locais, respectivamente, e o
gene RanGAP
foi altamente metilado no promotor -570 e -170 locais (Fig 4).
(a) a análise eletroforética das ilhas promotor CpG dos genes indicados por bissulfito modificação-PCR. locais (B) de metilação das ilhas CpG nos promotores de genes indicados.
LDH
, L-lactato desidrogenase.
DLD
, di-hidrolipoamida desidrogenase.
RanGAP
, proteína de activação de GTPase específico-Ran.
CaM
, calmodulina. M, marcador de peso molecular. 1, células SGC-7901 não tratados; 2,
H
.
células pylori
infectado SGC-7901; 3,
cagA
-overexpressing células SGC-7901. As setas indicam sítios de metilação anormais.
Discussão
provas Accumulative indica que
H
.
pylori
é um fator importante para o
H
.
pylori
-associated doenças gástricas e que CagA é um factor de promoção de câncer gástrico [17,18]. Foram construídos três linhas de células experimentais, incluindo duas linhas de células de câncer gástrico infectadas com o
H
.
pylori
(
cagA
+) e uma linha de células de câncer gástrico superexpressão
cagA
, e determinou que CagA começaram a aparecer em células 6 h após a infecção e para até 12 h. Posteriormente, CagA fosforilada começaram a aparecer, de acordo com a injeção ea subsequente fosforilação de CagA em células epiteliais gástricas pela T4SS de
H
.
pylori
após a infecção da mucosa gástrica humana. Fosforilada CagA ativa vias de sinalização a jusante e desempenha um papel patológico. Observamos também CagA em células transfectadas estavelmente com o
cagA
-vector. Estes dados confirmam a construção bem sucedida das três linhas de células experimentais.
Proteomics foi usado para estudar a relação entre
H
.
pylori e doenças gástricas, e muitas proteínas diferencialmente expressas, foram identificados [19-22]. No entanto, a associação dessas proteínas com CagA e sua expressão em tecidos de câncer gástrico humano permanecem obscuros. Obtivemos um total de 135 pontos diferenciais das três linhas celulares, dos quais 73 foram up-regulamentados e 62 foram regulados negativamente. Dez pontos diferenciais eram comuns a todas as três linhas celulares, incluindo 6 up-regulamentados proteínas (β-actina, LDH, DLD, PRP19, ATP sintase, e CAM) e 4 proteínas regulada para baixo (PCCL p64, RanGAP, P43 e calreticulina) , expressão e as proteínas 10 ‘foram verificados por western blot nestas linhas celulares. Estas proteínas estão envolvidas no metabolismo de energia, o rearranjo do esqueleto, o processamento de pré-ARNm, transdução de sinal, e outras proteínas estreitamente associada com o desenvolvimento e a progressão de diversos cancros humanos [23,24]. Nós quantitativamente detectada a expressão dos genes que codificam estas 10 proteínas em tecidos de câncer gástrico humano, que revelou que
β-actina
,
LDH
,
DLD
,
PRP19
e
CaM
foram consistentemente altamente expresso e
RanGAP
foi mal expressas em ambos os tecidos de câncer e /ou gânglios linfáticos metastáticos comparação com o tecido peri-cancerosas. A expressão aberrante de estas proteínas também foi verificada por western blot em câncer gástrico e gânglios linfáticos metastáticos. Em seguida, descobriu-se que
cagA
+
H
.
pylori
colonizada em 20 de 30 tecidos de câncer gástrico e promovido ou inibido a expressão desses genes in vivo.
LDH e DLD estão estreitamente correlacionadas com o metabolismo energético. Transtorno do metabolismo energético é considerada um fator importante para o desenvolvimento e progressão do câncer. Em contraste com as células normais, as células cancerosas exibem aumento da dependência da via glicolítica com oxigénio suficiente, denominado glicólise aeróbica. Uma grande quantidade de ácido pirúvico, um produto final da via, é convertido em ácido láctico por LDH, promovendo o metabolismo de energia e via glicolítica desequilíbrio [25]. O ácido láctico pode também diminuir o pH do microambiente celular, aumentando assim a resposta neovascular a factores de angiogénese para promover metástases de células de tumor [26,27]. Consistente com nossos resultados,
LDH
foi altamente expressa em tecidos de câncer em 61,8% dos pacientes com câncer gástrico; pacientes com superexpressão LDH apresentaram sobrevida mais curta em comparação com pacientes com baixa expressão [28]. Kim
et al
. [29] observaram que
DLD
expressão aumenta com a progressão do tumor, proporcionando assim mais energia para o crescimento de células tumorais. Portanto, a alta expressão da LDH e DLD é um factor crucial para o desenvolvimento e progressão do câncer gástrico, e
H
.
pylori
promove a expressão destes dois genes em tecidos de cancro gástrico.
beta-actina, um componente chave do citoesqueleto, mantém a estrutura, movimento e divisão de células sob condições normais.
β-actina
é anormalmente expressa de muitas doenças [30]. Acredita-se que a proteína PRPF19 a funcionar no splicing de pré-mRNA. Ubiquitination de PRPF19 pode levar a danos no DNA e reparo do DNA anormal é uma causa importante de desenvolvimento de neoplasias [31]. A calmodulina é uma proteína de ligação ao cálcio que regula muitas vias de sinalização e assim participa na proliferação celular, mitose e a transcrição de genes. Calmodulina promove a proliferação celular em carcinomas hepáticos em combinação com PI3K e a transição da fase G1 para a fase S em combinação com a ciclina E [32]. Um inibidor das células prisões de calmodulina em fase G1 para inibir a divisão de células [33]. Consistente com estes resultados, concluímos que
H
.
pylori
podem participar no desenvolvimento do câncer dos tecidos gástricos induzindo a alta expressão destes três proteínas.
Além disso, observou-se diminuição da regulação da
RanGAP
gene em tecidos cancerosos com
H
.
pylori
. RanGAP é uma proteína de activação de GTPase. Após a hidrólise de GTP em GDP por uma GTPase, RanGTP activo torna-se RanGDP inactivo, conduzindo ao bloqueio da sinalização celular para inibir a progressão do cancro [34]. Da mesma forma, a diminuição da atividade RanGAP induzida por ubiquitination promove o desenvolvimento de câncer [35].
metilação do DNA podem induzir a expressão do gene anormal.
H
.
pylori
aumenta os níveis de metilação de alguns genes e resultados na carcinogénese da mucosa gástrica [36,37]. metilação do DNA geralmente aparece nas ilhas CpG de promotores de genes. Detectamos o estado de metilação das ilhas CpG desses genes nas linhagens de células construídas e determinou que o
LDH
,
DLD
e
CaM
genes foram desmetilado no promotor -2325, -1885 e -276 locais, respectivamente, e o
gene RanGAP
foi altamente metilado no promotor -570 e -170 locais, de acordo com a expressão elevada do
LDH
,
DLD
e
CaM
genes ea baixa expressão do
RanGAP
gene em tecidos com câncer gástrico com
cagA
+
H
.
pylori
infecção.
Em conclusão, estes resultados sugerem que
H
.
pylori
, via translocação CagA, pode induzir a metilação aberrante destes genes para conduzir a expressão do gene disfuncional em tecidos com câncer gástrico e células. Nossos resultados fornecem uma nova compreensão da patogênese molecular do câncer gástrico com
H
.
pylori
. Estudos futuros irá explorar os efeitos desses padrões de metilação alterados sobre a patogênese do câncer gástrico em amostras clínicas.
Reconhecimentos
Agradecemos ao Centro Chinês de
Helicobacter pylori
Gestão de tensão e Preservação para fornecer
H
.
pylori
NCTC11637 e Dr. Yang Wenxiu e Wu Jiahong para assistência técnica.