Abstract
Fundo
O câncer de esôfago foi o quinto câncer mais comumente diagnosticado ea quarta principal causa de morte relacionada ao câncer na China em 2009. carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) é responsável por mais do que 90 por cento dos cancros esofágicos. Fatores genéticos, provavelmente, desempenhar um papel importante na carcinogênese CICAc
Métodos
Foi realizado um estudo caso-controle de base hospitalar para avaliar funcional
hTERT
rs2736098 G . A e
TERT-CLPTM1L
rs401681 C polimorfismos de nucleotídeo único T (SNPs) sobre o risco de ESCC. Seiscentos e vinte e nove casos CICAc e 686 controles foram recrutados. Seus genótipos foram determinados pelo método de reacção de detecção de ligação (LDR).
Resultados
Quando o
TERT-CLPTM1L
genótipo homozigoto CC rs401681 foi usado como grupo de referência, o CT genótipo foi associado com uma significativa diminuição do risco de ESCC (OR ajustado = 0,74, 95% CI = 0,58-0,94,
p
= 0,012); as variantes CT /TT foram associados com um 26% de risco de ESCC diminuiu (OR ajustado = 0,74, 95% CI = 0,59-0,93,
P
= 0,009). O risco significativamente reduzido de ESCC associada ao
TERT CLPTM1L-
rs401681 C polimorfismo T foi associado ao sexo masculino, idade jovem ( 63 anos em nosso estudo) eo consumo de álcool. Não houve associação entre o
hTERT
rs2736098 G . Observou-se um polimorfismo eo risco CICAc
Conclusão
TERT-CLPTM1L
CT rs401681 e CT /TT genótipos foram associados com diminuição do risco de ESCC, particularmente entre os homens, pacientes jovens e aqueles relatados para ser bebedores. No entanto, nossos resultados são conclusões preliminares. estudos maiores, com desenhos de estudos mais rigorosos são necessários para confirmar os resultados atuais
Citation:. Yin J, Wang L, Zheng L, Wang X, Y Shi, Shao A, et al. (2014)
TERT-CLPTM1L
Rs401681 C T polimorfismo foi associado com uma diminuição do risco de câncer de esôfago na população chinesa. PLoS ONE 9 (7): e100667. doi: 10.1371 /journal.pone.0100667
editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América
Recebido: 31 Julho, 2013; Aceito: 29 de maio de 2014; Publicação: 09 de julho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Yin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiado em parte pela National Natural Science Foundation da China (81101889, 81000028), província de Jiangsu Natural Science Foundation (BK2010333, BK2011481), Fundação para o Desenvolvimento social da Zhenjiang (SH2010017), talentos Changzhou Jovens e Ciência-Tecnologia Fundação de Serviços de Saúde (QN201102 ), e os “333” Programa de Formação Elitista de Jiangsu (BRA2013135). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o câncer de esôfago foi o quinto câncer mais comumente diagnosticado ea quarta principal causa de morte relacionada ao câncer na China em 2009 [1]. O câncer de esôfago é muito agressivo e está associado a um mau prognóstico [2]. carcinoma epidermóide de esôfago (CEE) responde por mais de 90 por cento dos cânceres de esôfago [3]. Fumar e beber pesado são os principais fatores de risco ambientais para CICAc [4]. No entanto, apenas um subconjunto de indivíduos expostos a esses fatores de risco ambientais desenvolve ESCC, sugerindo que fatores genéticos, tais como polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), também podem contribuir para CICAc carcinogênese.
Recentemente, vários associação do genoma estudos (GWAS) informou que polimorfismos comuns de telomerase transcriptase reversa-fissura lábio e palato transmembrana 1 como, CLPTM1L (
TERT-CLPTM1L), que está localizado no lócus 5p15.33, foram associados com o risco de muitos tipos de cancro [5], [6]. O 5p15.33 local, o qual está associado com a função da telomerase, contém dois genes fundamentais: a
gene eo
CLPTM1L
gene TERT
. O
TERT-CLPTM1L
SNP, rs401681 (C T, localizado no intron 13 do
CLPTM1L
, 27 kb do
gene TERT), é um dos mais SNPs estudados extensivamente. Duas variantes em 5p15 (rs401681 e rs2736098) estão significativamente associados com cancro da bexiga em pessoas de ascendência europeia. Estas variantes estão em desequilíbrio de ligação (LD) com
CLPTM1L
e
TERT
, e ambas as variantes estão também associados a [6], o cancro do pulmão Carcinoma de células basais [7], glioma [8] e outros tumores [6]. O
TERT-CLPTM1L
rs401681 C alelo também está associada com menor comprimento dos telômeros média de linfócitos [9]. A telomerase é expressa em linhas de células estaminais e é inactivo em células somáticas [10]. TERT é a subunidade catalítica da transcriptase inversa da telomerase, cuja indução, em conjunto com a activação da telomerase, são passos críticos durante a imortalização e transformação [11] celular. Os telómeros podem tornar-se disfuncional por razões de uma variedade, tais como encurtamento gradual causadas pela replicação dos cromossomas incompleta, lesões oxidativas do ADN ou mutações em proteínas estruturais, tais como terc [12]. As mutações nas regiões de codificação de TERT pode afectar a actividade da telomerase e o comprimento dos telómeros, resultando em fenótipos clínicos graves, incluindo síndromes de insuficiência da medula óssea e um aumento substancial na frequência do cancro [13].
O papel de CLPTM1L foi inicialmente descrito em células de cancro do ovário, em que a sobre-expressão do gene de apoptose induzida em células sensíveis a cisplatina [14]. CLPTM1L também está envolvido em apoptose mitocondrial em células normais, e foi relatada a ser sobre-expressos em células de cancro do pulmão [15]. O
CLPTM1L
gene pode desempenhar um papel na resposta apoptótica. Superexpressão de
CLPTM1L
mRNA tem sido observada em muitos tipos de câncer, incluindo câncer de pele não-melanoma [13]. Embora a função do gene de
CLPTM1L
é em grande parte desconhecida, estudos demonstraram que ela pode induzir apoptose. Por exemplo, CLPTM1L, como uma proteína transmembranar prevista, é regulada positivamente em linhas celulares de cancro do ovário resistentes à cisplatina, e pode estar envolvido na resposta apoptótica de células ao stress genotóxico induzida por cisplatina.
CLPTM1L
variantes são hipoteticamente para aumentar a activação metabólica de metabolitos reactivos e /ou a formação e a persistência de aductos de ADN [6]. Jiang et al. descobriu que
TERT-CLPTM1L
rs401681 era uma variante genética associada com o risco de câncer de pulmão [16].
O significado biológico e patológico de hTERT e TERT-CLPTM1L sugere que as variações genéticas funcionais em
hTERT
e
TERT-CLPTM1L
genes podem contribuir para o desenvolvimento de ESCC. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre o
hTERT
rs2736098 G A e
TERT-CLPTM1L
rs401681 C polimorfismos T e CICAc susceptibilidade em um estudo caso-controle de base hospitalar estude. Foram realizadas análises genotipagem de
hTERT
rs2736098 G e
terc-CLPTM1L
rs401681 C . T SNPs em 629 casos CICAc e 686 controles em uma população chinesa
Os pacientes e Métodos
a aprovação ética do protocolo do estudo
Este estudo de caso-controle de base hospitalar foi aprovado pelo Conselho de revisão da Universidade de Jiangsu (Zhenjiang, China). Nós cumpriram com a Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinki em relação à conduta ética da pesquisa envolvendo seres e /ou animais [17] humanos. Todos os indivíduos forneceram consentimento informado por escrito para ser incluído no estudo.
Os sujeitos do estudo
629 indivíduos com câncer de esôfago foram consecutivamente recrutados Hospital Popular afiliada da Universidade de Jiangsu e Affiliated Hospital da Universidade de Jiangsu ( Zhenjiang, China) entre outubro de 2008 e dezembro de 2010. Todos os casos de câncer de esôfago foram diagnosticados como CICAc por meio patológicas. Os critérios de exclusão foram pacientes que anteriormente tinham: câncer; qualquer metástase de câncer; radioterapia ou quimioterapia. Os 686 controles foram pacientes sem frequência correspondida câncer para os casos em relação à idade (± 5 anos) e sexo recrutados de dois hospitais mencionados acima durante o mesmo período de tempo. A maioria dos controles foram admitidos em hospitais para o tratamento de trauma.
Cada sujeito foi pessoalmente questionada por entrevistadores treinados, utilizando um questionário pré-testado para obter informações sobre dados demográficos (idade, sexo) e afins fatores de risco (incluindo tabagismo e consumo de álcool). Depois da entrevista, de 2 ml de amostras de sangue venoso foram recolhidas de cada sujeito. Indivíduos que fumavam um cigarro por dia para 1 ano, foram definidos como “fumantes”. Os indivíduos que consumiram ≥3 bebidas alcoólicas por semana durante 6 meses foram considerados “consumidores de álcool”
Isolamento de DNA e genotipagem por reacção de detecção de ligação e previsão função on-line SNP
Sangue. As amostras foram coletadas de pacientes em uso de Vacutainers e transferido para tubos alinhados com ácido tetra-acético etilenodiamina (EDTA). O ADN genómico foi isolado a partir de sangue total com o DNA QIAamp sangue Mini Kit (Qiagen, Berlim, Alemanha) [18]. As amostras foram genotipados usando o método de reacção de detecção de ligação (LDR), com o apoio técnico do Shanghai Biowing Applied Biotechnology empresa, como descrito anteriormente [19]. Os SNPs foram genotipados utilizando o ensaio de LDR reacção em cadeia da polimerase (PCR), pela ABI 9600 sistema (Applied Biosystems, EUA). As sequências de ADN alvo foram amplificadas por themultiplex método de PCR. A sonda comum é marcada na extremidade 3 ‘com 6-carboxi-fluoresceína e fosforilado na extremidade 5’. LDR parâmetros foram como se segue: 94 ° C durante 2 min, 20 ciclos de 94 ° C durante 30 s e 60 ° C durante 3 min. Após a reacção LDR, misturou-se 1 ul do produto LDR-reacção com 1 mL ROX e tampão de carga de 1 mL. Depois disso, a mistura foi desnaturada a 95 ° C durante 3 min e arrefecidas imediatamente em água com gelo. Os produtos fluorescentes de LDR foram diferenciados por ABI sequenciador 377 (Applied Biosystems, EUA). Para controle de qualidade, análises repetidas foram feitas por 160 (12,17%) amostras selecionadas aleatoriamente com alta qualidade DNA
Nós usamos ferramenta de previsão on-line:. https://www.regulomedb.org/and http: //snpinfo .niehs.nih.gov /snpinfo /snpfunc.htm para prever
hTERT
rs2736098 G
TERT-CLPTM1L
rs401681 C . função T SNPs
Análises estatísticas
as diferenças entre as distribuições de características demográficas, variáveis selecionadas, e genótipos do
hTERT
rs2736098 G a e
TERT-CLPTM1L
rs401681 C T variantes entre os casos e os controles foram avaliados usando o
χ
2 de teste. As associações entre
hTERT
rs2736098 G A e
TERT-CLPTM1L
rs401681 C genótipos T e risco de ESCC foram estimadas calculando as RUP e os seus ICs de 95% usando análises de regressão logística para o petróleo bruto RUP e RUP ajustados quando o ajuste para idade, sexo, tabagismo e estado de beber. O equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE) foi testado por um goodness-of-fit
χ
2 teste para comparar as freqüências genotípicas observadas aos esperados entre os indivíduos do grupo controle. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o SAS 9.1.3 (SAS Institute, Cary, NC, EUA).
Resultados
características da população de estudo
Características de casos e controles incluídos no estudo estão resumidos na Tabela 1. os casos e controles parecia ser adequadamente compensada na idade e sexo, conforme sugerido pelo
χ
2 testes (
P
= 0,541 e
P
= 0,185, respectivamente). Como mostrado na Tabela 1, foi detectada diferença significativa no grau de tabagismo entre os casos e os controles (
P Art 0,001), e a taxa de beber foi maior nos pacientes CICAc que nos indivíduos controle (
P
0,001). A informação primária para dois SNPs genotipados estava na Tabela S1. Para o
hTERT
rs2736098 G A, a genotipagem foi bem sucedido em 600 (95,39%) casos CICAc e 651 (94,90%) controles em todas as 1315 amostras, e por
TERT-CLPTM1L
rs401681 C T, a genotipagem foi bem sucedido em 604 (96,03%) casos CICAc e 664 (96,78%) controles. As taxas de concordância de análises repetidas foram de 100%. freqüência do alelo menor (MAF) em nossos controles foi similar ao MAF para o chinês no banco de dados para todos os dois SNPs (Tabela S1). As freqüências genotípicas observadas para estes dois polimorfismos nos controles estavam todos em HWE (Tabela S1).
Associações entre dois polimorfismos e risco de ESCC
A distribuição dos genótipos de
hTERT
rs2736098 G a e
TERT-CLPTM1L
rs401681 C T nos casos e os controles são apresentados na Tabela 2. no único locus análises, as freqüências genotípicas de
TERT-CLPTM1L
rs401681 C T foram 47,68% (CC), 41,72% (CT), e 10,60% (TT) nos pacientes-casos e 40,06% (CC), 47,74% (CT), e 12,20% (TT) em os indivíduos do grupo controle, ea diferença foi estatisticamente significativa (
P
= 0,024). Quando o
TERT-CLPTM1L
alelo rs401681 C foi utilizado como grupo de referência, o alelo T foi associado com uma redução significativa do risco de ESCC (T
vs
C: OR ajustado = 0,81, 95 CI% = 0,69-0,96,
P
= 0,014). Quando o
TERT-CLPTM1L
genótipo homozigoto CC rs401681 foi usado como grupo de referência, o genótipo CT foi associada com uma redução significativa do risco de ESCC (CT
vs
CC: OR ajustado = 0,74, IC95% = 0,58-0,94,
P
= 0,012). Quando o
TERT-CLPTM1L
genótipo homozigoto CC rs401681 foi usado como grupo de referência, o genótipo TT não foi associado com o risco de ESCC (TT
vs
CC: OR ajustado = 0,75, 95 CI% = 0,51-1,09,
P
= 0,126). No modelo dominante,
TERT-CLPTM1L
CT rs401681 /variantes do TT foram associados com um 26% de risco de ESCC diminuiu, em comparação com o
TERT-CLPTM1L
genótipo rs401681 CC (OR ajustado = CI 0,74, 95% = 0,59-0,93,
P
= 0,009). No modelo recessivo, quando o
TERT-CLPTM1L
rs401681 CC /genótipos CT foram utilizados como grupo de referência, o genótipo homozigoto TT não foi associado com o risco de ESCC (OR ajustado = 0,87, 95% CI = 0,61-1,24,
P
= 0,447) (Tabela 2)
hTERT
rs2736098 G . a não foi mostrou uma diferença significativa nas distribuições genotípicas entre casos e controles (
P
= 0,727). A análise de regressão logística revelou que o
hTERT
rs2736098 G . Um polimorfismo não foi associado com o risco de ESCC (Tabela 2)
Usando Poder e Tamanho da Amostra Cálculo (PS, versão 3.0 de 2009 , https://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize) e considerando
TERT-CLPTM1L
rs401681 C T alelos mutantes no grupo de controle, RUP, amostras CICAc e amostras de controlo, o poder da nossa análise (α = 0,05) foi 0,708 em 604 casos CICAc e 664 controles, com um OR de 0,74
analisa Estratificação na TERT-CLPTM1L rs401681 C . polimorfismos T eo risco de ESCC
para avaliar os efeitos do
TERT-CLPTM1L
rs401681 C genótipos T sobre o risco CICAc de acordo com diferentes idades, sexo, tabagismo e estado de consumo de álcool; realizamos as análises de estratificação (Tabela 3). Um risco significativamente reduzido de ESCC associada ao
TERT CLPTM1L-
rs401681 C polimorfismo T era evidente entre os pacientes do sexo masculino (CT
vs
CC:
P
= 0,0003; CT /TT
vs
CC:
P
= 0,0002), os pacientes mais jovens ( 63 anos em nosso estudo) (CT /TT
vs
CC:
P
= 0,049) e os pacientes que estavam em estado de beber (CT
vs
CC:
P
= 0,012; CT /TT
vs
CC:
P
= 0,016) (Tabela 3).
Discussão
neste estudo caso-controle de base hospitalar, foi investigada a associação do
hTERT
rs2736098 G a e
terc-CLPTM1L
rs401681 C T SNPs com o risco de CICAc numa população chinesa. análise logística multivariada revelou que o
TERT-CLPTM1L
CT rs401681 e genótipos CT /TT foram associados com diminuição do risco de ESCC, enquanto que nenhuma associação significativa entre o
hTERT
rs2736098 G Um polimorfismo eo observou-se o risco de CICAc. A redução significativa do risco de ESCC associada ao
TERT CLPTM1L-
rs401681 C . Polimorfismo T, particularmente entre os homens, pacientes jovens e aqueles relatados para ser bebedores
A função de CLPTM1L e seu papel na tumorigênese é em grande parte desconhecido. No entanto, um estudo recente relatou que CLPTM1L era um factor anti-apoptótico geralmente sobre-expresso em cancro do pulmão [15]. Isto sugere um papel inibitório na apoptose induzida pelo estresse genotóxico, e identificou CLPTM1L como um fator importante que afeta a sobrevivência do DNA danificado células tumorais e potencialmente suscetibilidade ao câncer de pulmão [20].
O
CLPTM1L
gene é regulado positivamente em linhas celulares resistentes à cisplatina, e está ligada à apoptose induzida por cisplatina; Além disso, a sobre-expressão de
CLPTM1L
ARNm tem sido observado em muitos cancros [6], [14], [21], [22]. Variantes neste locus são hipoteticamente para regular o comprimento do telómero e ser associado a várias malignidades, incluindo os cancros do pulmão, próstata, bexiga, colo do útero e pâncreas. Rs401681 está localizado no intrão 13 da
CLPTM1L
em 5p15.33, e é um dos SNPs mais estudados. Embora pouco se conhece sobre a função deste SNP, a nossa análise de bioinformática indicado que poderia afectar a regulação de transcrição e afectar ainda mais a expressão do gene. Para mostrar que essas alterações podem contribuir efectivamente para o cancro propriedades, estudos de validação in vitro com linhagens de células in vitro específico de ESCC que abrigam essas alterações genéticas são warrented. Tais como culturas de células, transfecções transitórias, ensaio de luciferase, ensaios de desvio da mobilidade electroforética, análise de Western blot, PCR transcriptase, ensaios de imunoprecipitação da cromatina e quantitativa Real-Time PCR reversa.
Diversos estudos abordam a associação entre o
CLPTM1L
polimorfismo rs401681 e câncer foram publicados, com resultados inconsistentes [6], [15], [19], [23], [24], [25]. Um estudo de associação, que incluiu 2.396 casos de câncer de pulmão e 3.001 controles mostrou que o
CLPTM1L
T alelo foi associado com uma redução significativa do risco de cancro do pulmão [15]. Nan e colaboradores observaram uma relação positiva entre o alelo sugestivo rs401681 C e menor comprimento dos telômeros relativo [7]. Rafnar et ai. sugeriu que o alelo rs401681 C pode ser associado com a aceleração do encurtamento dos telómeros gradual com a idade [6]. Possíveis ligações entre telômeros mais curtos e diminuição do risco de melanoma têm sido relatados. Isto poderia ser atribuído ao tempo de vida mais curto replicativa de melanócitos conferidas por um comprimento de telómeros mais curto, o que proporciona uma barreira mais rigorosas para a divisão celular ilimitado. Uma diminuição do risco de melanoma também pode estar associada com a redução de tamanho nevos e contar em indivíduos com telómeros mais curtos. Rs401681 também está associada com o risco de cancro do pâncreas, tal como mostrado pela presença de sequências de extremidades do cromossoma falta repetição telomérica neste cancro [26]. Jiang et al. descobriu que
TERT-CLPTM1L
rs401681 T alelo foi associado à diminuição do risco de câncer de pulmão [16]. E em ESCC coorte, a tendência de
TERT-CLPTM1L
alelo rs401681 T é protetora, mas não chegar significativa (OR = 0,935, IC 95% = 0,800-1,093 no aditivo modelo) [16], indicando necessários para repetições em outras cohors.
As frequências dos polimorfismos genéticos muitas vezes variam entre os grupos étnicos. No presente estudo chinês, a freqüência do alelo de
rs401681 TERT-CLPTM1L
T foi 0,361 em 686 indivíduos de controle, o que é consistente com os valores reportados na base de dados SNP para o Han Chinese (0,305) e populações japonesas ( 0,343); no entanto, a freqüência foi menor do que a de um (0,642) população subsaariana Africano (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP).
Este estudo de caso-controle tinha várias limitações . Primeiro, os pacientes e controles foram inscritos de hospitais e pode não ser representativo da população em geral; as informações do histórico de câncer familial dos casos e controles não foi obtido, este viés inerente pode ter resultado em resultados espúrios. Em segundo lugar, os polimorfismos investigados em nosso estudo foram baseadas em considerações funcionais e não pode fornecer uma visão abrangente da variabilidade genética de
TERT-CLPTM1L
, como rs402710 e rs2736100 et al. Mais estudos são necessários para esclarecer o mecanismo genético de carcinogênese esofágica pelo bem-mapear a região de susceptibilidade das variantes. Em terceiro lugar, o poder estatístico do nosso estudo foi limitado por causa do tamanho da amostra moderado e ausência de uma coorte de validação. Maior, bem concebida estudos são necessários para confirmar as associações observadas no presente estudo. Finalmente, nós não obter informações detalhadas sobre metástases e sobrevivência do cancro, que restringiu ainda mais a análise dos papéis do
hTERT
rs2736098 G A e
TERT CLPTM1L-
rs401681 C polimorfismos T . na progressão CICAc e prognóstico
em conclusão, nosso estudo fornece fortes evidências de que o
TERT CLPTM1L-
rs401681 C polimorfismo T pode contribuir para o risco de ESCC. No entanto, a relevância funcional exata do
CLPTM1L
rs401681 SNP permanece obscuro. Ele pode estar em forte LD com outros SNPs funcionais ou causais potenciais, contribuindo para o risco de ESCC. Adicionais estudos, maiores e in vitro ou biológica específica de tecido são necessários para confirmar os resultados preliminares atuais.
Informações de Apoio
Tabela S1.
informações primário para
hTERT
rs2736098 G A e
TERT-CLPTM1L
rs401681 C polimorfismos T
doi:. 10.1371 /journal.pone.0100667.s001
(DOCX)
dados S1.
Dados de
hTERT
rs2736098 G A e
TERT-CLPTM1L
rs401681 C polimorfismos T
doi:. 10.1371 /journal.pone.0100667.s002
( SAV)
Reconhecimentos
Agradecemos a todos os pacientes que participaram deste estudo. Queremos agradecer Dr. Yiqun Chen (Biowing Applied Biotechnology Company, Xangai, China) para suporte técnico.