Abstract
O mesothelin (
MSLN
) gene codifica uma quilodalton 71 (kDa) da proteína precursora que é transformado em factor de potenciação megacariocítica (MPF), uma proteína de 31 kDa que é segregada a partir da célula, e mesotelina madura (mMSLN), uma proteína da superfície celular kDa 40. O mMSLN se liga a CA125, uma interacção que tem sido implicada na disseminação intra-cavitação de mesotelioma e cancro do ovário. Para definir melhor o papel do MPF e mMSLN, o crescimento da linha de células A549 câncer de pulmão foi avaliada em ratinhos imunodeficientes com inativação do gene
MSLN
. Observou-se que
MSLN viajantes – /- ratos xenoenxerto com tumores A549 intraperitoneal sobreviver significativamente longo de portadores de tumor
MSLN + /+
ratos. Quando portador de tumor
MSLN viajantes – /-
camundongos Quais são suplementadas com MPF recombinante (e, em menor medida mMSLN), a maior parte desta vantagem de sobrevivência é perdido. Estes estudos demonstram que MPF e mMSLN têm um papel importante no crescimento de células de câncer de pulmão
em
vivo
e levantam a possibilidade de que a inativação de MPF pode ser um tratamento útil para pulmão e outro MSLN cancros que expressem
Citation:. Zhang J, Bera TK, Liu W, Du X, Alewine C, Hassan R, et al. (2014) megacariocítica potencializando Factor e mesothelin maduro estimular o crescimento de uma linha celular de cancro de pulmão na cavidade peritoneal de camundongos. PLoS ONE 9 (8): e104388. doi: 10.1371 /journal.pone.0104388
editor: Prasad S. Adusumilli, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Estados Unidos da América
Recebido: 24 Abril de 2014; Aceito: 12 de julho de 2014; Publicação: 13 de agosto de 2014
Este é um artigo de acesso aberto, livre de todos os direitos autorais e pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita. O trabalho é feito disponível sob a dedicação de domínio público da Creative Commons CC0
Data Availability:. Os autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel
Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Investigação Intramural do NIH, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
o mesothelin
(MSLN)
gene codifica um antigénio tumoral linhagem restrita que se expressa em células mesoteliais normais que revestem a pleura, peritônio e pericárdio. É também altamente expresso no mesoteliomas epitelióides, que são derivados a partir de células mesoteliais normais, e de forma aberrante em muitos outros cancros, incluindo o do ovário, do pâncreas, do pulmão, estômago, colangiocarcinoma e cancro da mama negativo tripla [1] – [4]. O
gene MSLN
codifica uma proteína de kDa 71 precursor que é processado em duas proteínas maduras: Fator megacariocítica potenciadora (MPF) e amadurecer MSLN (mMSLN). MPF é uma glicoproteína de 31 kDa que é segregada a partir da célula para o sangue. O mMSLN é um kDa proteína glicoproteína 40, que permanece ligado à membrana celular por fosfatidil-inositol [5], [6], mas derrama a partir da superfície da célula ao longo do tempo através da acção do TNF-α enzima de conversão (Fig. 1) [7 ]. O mMSLN tem sido demonstrado que se ligam a MUC16 (CA125); esta interacção tem sido implicada na disseminação intra-cavitação de mesotelioma e cancro do ovário [8]. Estudos de
gene MSLN
knock out (- /-) ratos indicam que o gene não é essencial para o desenvolvimento normal e reprodução, mas vários estudos recentes levantaram a possibilidade de que
MSLN
pode regular o câncer o crescimento das células [9] – [12]. Em ratos Eker, o desenvolvimento de carcinoma renal induzida por esclerose tuberosa-2 foi significativamente reduzida na ausência de um homólogo de o
MSLN
gene de [13], [14]. Em células de câncer de pâncreas, sobre expressão de
MSLN
tem sido implicado em aumento significativo do crescimento de células tumorais e migração
em
vitro
[11]. Recentemente, o nível de expressão da proteína MSLN correlacionou-se com a agressividade do tumor, bem como diminuiu a sobrevivência global dos doentes com adenocarcinoma do pulmão na fase inicial [15], mas o mecanismo molecular que contribui para estes fenótipos não são bem compreendidos. CA125, um antigénio do cancro do ovário associada à membrana, foi reportado para interagir com MSLN, e tem sido sugerido que esta interacção pode facilitar a metástase do cancro do ovário. Embora a ligação de células que expressam MSLN-a CA125 foi demonstrada em cultura de células [8], [16], não existem experiências em animais mostram que esta interacção é importante em ratinhos portadores de tumor.
GPI, glicosilfosfatidilinositol.
Nós geraram ratinhos nus atímicos em que o
gene MSLN
é inativada, impedindo a produção da proteína mMsln e Mpf. Estes ratos reproduzir normalmente e não foram detectados quaisquer anormalidades no seu crescimento ou outras propriedades. Uma vez que estes ratos não fazem Mpf e não têm MSLN sobre as células que revestem a cavidade peritoneal, temos utilizado para investigar se a ausência de MSLN afecta o crescimento das células do cancro do pulmão inoculados no interior da cavidade peritoneal de nestes ratinhos.
Materiais e Métodos
linhas de células e imuno-histoquímica
A linha de células de cancro do pulmão A549 foi obtido de Dr. Hisataka Kobayashi (Instituto Nacional do câncer, NIH, Bethesda, EUA) e sua identidade foi confirmada por impressões digitais de DNA utilizando o ensaio Tandem Repeats Short. O epidermóide A431 linha celular de carcinoma humano foi adquirido a ATCC (Mananasas, VA) e mantidas em laboratório como recomendado. a coloração imuno-histoquímica para MSLN e CA125 foi realizada por Histoserv, Inc. (Germantown, MD) utilizando um ratinho anti-MSLN 5B2 (Novocastra Reagentes de Leica Bioystems, Buffalo Grove, IL) como previamente descrito [17], e de ratinho anti-CA125 OC125 (Zymed Laboratories) na diluição 1:50.
Experimentação animal
as propostas estudo animal (LMB-053 e LMB-014) foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do NIH animal. Todos os experimentos com animais, incluindo o tratamento e sacrifício foram conduzidos de acordo com as diretrizes institucionais do NIH. ratinhos nus atímicos (NCr-nu /nu) e Nu /
MSLN
– /- ratos obtidos de NCI-Frederick foram alojados em gaiolas micro-isoladoras ao longo do curso do experimento. Todos os ratos utilizados em experiências eram do sexo feminino, peso (15-20 g) e idade (7-10 semanas) combinado. Todas as injecções foram intraperitoneal (IP), a menos que indicado de outra forma. A549 e A431 IP xenoenxertos foram estabelecidas através da inoculação de 2 × 10
6 células em 200 ul de suspensão de células em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Para o modelo subcutâneo, 2 × 10
6 células A549 foram injectadas na coxa direita. Todos os tratamentos de proteínas recombinantes foram realizadas por injecção IP de proteínas do Estudo 25 ug em 200 ul de PBS, três vezes por semana durante um total de três semanas. Para os estudos de sobrevivência, os ratos foram monitorados diariamente e sacrificados por CO
2 inalação quando moribunda
Geração de
MSLN Restaurant -. /- Ratos atímicos
Homem
MSLN
ratos nulo no fundo genético C57 /BL6 (
MSLN viajantes – /-) [9] foram usados para fazer cruzar com a fêmea BALB /c de tipo selvagem (WT) ratos e ninhadas foram selecionados para
MSLN
alelo heterozigoto. camundongos heterozigotos do sexo masculino de cada geração foram usadas para apoiar cruz com WT BALB /c fêmeas e passagem de volta foi realizada por mais de dez gerações. Os machos heterozigotos para
MSLN
em BALB /c antecedentes genéticos foram cruzados com (Fox N) do sexo feminino atímicos nus para gerar Fox N nulos /
MSLN
– /- ratos. Desde Fox N nulo /
MSLN viajantes – /- ratos fêmeas não são bons criadores, que usamos
MSLN viajantes – /- fêmeas /Fox N Het como os parceiros de reprodução de Fox N nulo /
MSLN viajantes – /- machos para manter e gerar Fox N nulo /
MSLN viajantes – /-. fêmeas para nossos experimentos
Geração de MPF-Rabbit (r) Fc, mMSLN- RFC e CD22-RFC proteínas de fusão em células de mamíferos
Para gerar versões recombinantes de mMSLN e MPF, mMSLN-RFC e MPF-RFC foram expressos como proteínas de fusão com IgG de coelho (RFC) em células HEK293T e purificado como anteriormente descrito [18]. proteína de fusão CD22-RFC foi preparado para utilização como um controlo.
Citometria de Fluxo
As células foram colhidas, lavadas e re-suspensas em tampão FACS gelada (PBS com 5% de FBS e 0,1 % de azida de sódio), em seguida, incubadas com anticorpo anti-mesotelina, MN (Rockland Immunochemicals Inc., Gilbertsville, PA) ou Morab-009 (Morphotek Inc., Exton, PA) ou anticorpo anti-MUC16, OC125 (Abcam, Cambridge, MA) na concentração de 5 ug /ml. anticorpo combinado com isótopo foi utilizada como um controlo. A ligação dos anticorpos primários para células tumorais foi detectada utilizando um anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com R-ficoeritrina (PE-R) (Invitrogen) ou com anticorpo de cabra anti-ratinho conjugado com FITC (Biosource). A fluorescência associada às células vivas foi determinado utilizando um FACS Calibur (BD Biosicences). médias geométricas foram expressos como média intensidade de fluorescência (MFI). A MFI das células foi comparada com o IFM a partir de uma curva padrão de grânulos com R-PE-conjugados de calibração (kit BD quantificação QuantiBRITETM PE, BD Biosciences) e o número de sítios mMSLN por célula foi estimado. Os resultados foram semelhantes com MN (n = 2 experiências) ou Morab-009 (n = 3 experiências).
MPF Quantificação
células A549 transfectadas estavelmente com qualquer controle de vetores (A549 /pcDNA) ou vector de expressão de MPF (A549 /MPF) foram plaqueadas em placas contendo uma quantidade igual de meio completo e incubadas durante 48 horas. população total de células foi contada utilizando um contador de células Cellometer Vision (Nexcelom, St. Lawrence, MA) Uma alíquota volume equivalente de meio condicionado foi removido de cada prato e a concentração de MPF na solução foi quantificada usando um MPF imunossorvente ligado a enzima humana proprietária kit de ensaio (Morphotek, Easton, PA).
agar mole ensaio
A549 /A549 ou pcDNA /MPF transfectantes estáveis foram suspensas em 0,35% de agar, plaqueadas em placas de 6 cavidades (2 × 10
3 células /poço), e incubadas durante 15-21 dias a 37 ° C. Após coloração de violeta de cristal Lavaram-se as placas durante 1 hora, em seguida, digitalizado para produzir imagens digitais. As colónias foram contadas num campo quadrado de pré-especificado, centralmente colocado com comprimento de lado igual a um terço do diâmetro do poço. Vários poços (n) foram contados para cada uma das três experiências independentes. O número médio de colónias para cada experiência são apresentados com desvio padrão (SD). células KB foram utilizados como controle positivo para a formação de colónias.
Análise Estatística
Para os estudos de sobrevivência, as curvas de Kaplan-Meier foram construídas e comparadas pelo teste de log-rank. Um teste de Mann-Whitney foi usado para comparação estatística dos dados de sobrevivência. P 0,05 foi utilizado como o limite de significância estatística. Toda a análise estatística foi realizada utilizando Prism (versão 5) para Mac (software GraphPad).
Resultados
Estudos anteriores demonstraram que mMSLN interage com o tumor de câncer antígeno CA125 ovário e que esta interacção pode ser importante na propagação metastática do cancro do ovário, através da cavidade peritoneal [8], [16], [19]. Para avaliar o impacto da MSLN no crescimento IP de células cancerosas humanas, criamos Fox N nulos /
MSLN
– /- ratos. Para garantir que o
gene MSLN
foi inactivado e que os ratos não fazem MSLN que confirmou pela primeira vez a eliminação utilizando a reação em cadeia da polimerase para a tela para os alelos excluídos dos
MSLN
gene (dados não mostrando). A falta de expressão da proteína mMsln foi confirmada por análise imuno-histoquímica de tecidos de ratinho, utilizando anticorpo policlonal de coelho anti-MSLN seguido de detecção de cor, tal como previamente descrito [9] (Fig. 2). A imunossupressão causada pela deleção FoxN permite a experiência com xenoenxerto de células tumorais humanas. Utilizou-se a linha de células A549 câncer de pulmão, que tem muito baixa expressão de MSLN (média de 3,5 × 10
3 locais de ligação mMSLN /celulares), mas expressão robusta de CA125 (Fig. 3). Nós injectados dois milhões de células A549 para a cavidade peritoneal de
MSLN
– /- e
MSLN + /+
ratinhos nus, em seguida, monitorizada a sobrevivência dos animais. Como mostrado na Figura 4A, não havia uma diferença estatisticamente significativa na sobrevivência entre os dois grupos de ratos. A sobrevida média de
MSLN + /+
ratos foi de 31 dias, mas aumentou para 46 dias em
MSLN viajantes – /- ratos (p 0,0001). Quase 25% da
MSLN viajantes – /- ratos sobreviveram ao longo de quatro meses (Tabela 1), enquanto todo o
MSLN + /+
ratos morreram dentro de 50 dias (Fig. 4A). Nenhuma vantagem de sobrevivência semelhante foi observado quando as células cancerosas A431 epidermóide (Fig. 4B), que expressam nem MSLN nem CA125, foram inoculados por via intraperitoneal. O crescimento do tumor foi também avaliada quando as células de cancro do pulmão A549 foram inoculadas por via subcutânea. Neste modelo, os tumores em
MSLN Restaurant –
/Tablet – e, em
MSLN + /+
camundongos cresciam na mesma taxa (Fig. 4C), demonstrando que
MSLN
expressão não tem efeito no crescimento do tumor dentro deste compartimento.
Uma porção dos tecidos pulmonares foram fixadas em paraformaldeído a 4% embebidos em parafina e seccionados de 5 a 6 um de espessura, em seguida, coradas para MSLN. A-C: formar tecido pulmonar
FoxN nulo /MSLN
(+ /+) coradas com anticorpo anti-MSLN (A: 100X; B: uma ampliação de 200X); ou anticorpo secundário única (C: ampliação 100X) como controlo negativo. D-F: Formulário de tecido pulmonar
FoxN nulo /MSLN
(- /-) corado com MSLN anticorpo anti-(D: 100X; E: 200X); ou único anticorpo secundário (F: 100X) como controlo negativo. Como esperado expressão mesothelin forte foi detectada no revestimento celular mesotelial do pulmão de
FoxN nulo /MSLN
ratos (+ /+), mas nenhuma expressão no pulmão de
FoxN nulo /MSLN
(- /-.) ratos
as células foram incubadas com os anticorpos indicados primários ou anticorpos de controle isótopos, e anticorpo secundário apropriado (de cabra anti-IgG de ratinho, R-PE ou de cabra anti-ratinho, FITC). Os resultados são apresentados como gráficos de histograma para a ligação do anticorpo primário (traço negro) ou controlo de isotipo (traço cinzento). As células A431 são negativos para ambos MSLN e CA125. As células A549 mostrar baixa expressão mesothelin (3,5 × 10
3 sites /celulares), mas CA125 altamente expressa
(A) Plot mostra a sobrevivência de ratinhos depois de receber a injeção IP de células A549.; sobrevida média de
MSLN viajantes – /- ratos é de 46 dias e de
MSLN (+ /+)
ratos é de 31 dias (
p Art 0,0001). (B) Plot mostra a sobrevivência de
MSLN
(-
/Tablet -) ou
MSLN
(+ /+) ratos após a injeção IP de células A431. (C) Plot mostra a sobrevivência de
MSLN
(-
/Tablet -) ou
MSLN (+ /+)
ratos após a injeção subcutânea de células A549 (D) Survival of A549 xenotransplante rolamento
MSLN
(- /-). ratos depois de receber proteínas MPF-RFC ou mMSLN-RFC ou CD22-RFC
no modelo intraperitoneal, os abdomens A549 de ratinhos portadores de tumor incharam apenas antes da morte. Na necropsia, massas tumorais foram crescendo na parede peritoneal, sobre o omento, e no intestino grosso e delgado. IHC demonstra que estes tumores A549 não fazem MSLN detectável (Fig. 5A), mas fazem CA125 (Fig. 5B). Estes resultados indicam que MPF, mMSLN ou ambos podem aumentar a agressividade de tumores A549 dentro da cavidade abdominal.
Um ratinho nu atímicos foi sacrificado 26 dias após a inoculação ip com células A549. Os tumores foram imunocoradas com (A) anti-MSLN e (B) anticorpos monoclonais anti-CA125. Estes tumores foram negativos para MSLN mas positivo para a expressão CA125 como mostrado por coloração marrom das células tumorais.
Nossa hipótese é que se a perda de
MSLN
foram responsáveis pela progressão do tumor diminuiu nos
MSLN viajantes – /- ratos, seguida de substituição exógena de seus produtos protéicos, MPF ou mMSLN, pode restaurar o curso mais agressivo da doença visto em
MSLN
(+ /+) camundongos. Portanto, sintetizamos recombinante MPF-RFC, mMSLN-RFC, e uma proteína CD22-RFC controle. A adição estratégica da porção Fc de coelho aumenta significativamente a sua meia-vida destas moléculas, mas não se espera que interfira com a função. As células A549 foram injectados nas cavidades peritoneais de
MSLN
– /- ratos, tal como anteriormente, em seguida, com início no dia da implantação, os ratos foram tratados com uma das proteínas recombinantes de Fc em dias alternados durante um total de seis doses. Conforme resumido na Tabela 1 e mostrado na Figura 4D, a sobrevivência média de
MSLN
– /- murganhos tratados com o péptido de controlo CD22-RFC permaneceu 46 dias. No entanto, a sobrevivência mediana de ratos tratados com MPF-RFC diminuiu para 31 dias, semelhante à sobrevivência de
MSLN
(+ /+) murganhos injectados com células A549 (Fig. 4A). A injecção de mMSLN-RFC também produziu uma diminuição estatisticamente significativa na sobrevivência mediana, embora o efeito foi menos marcado (42 dias, p 0,016). Os resultados desta experiência sugerem que a perda de Mpf em vez de mMsln é principalmente responsável pela sobrevivência prolongada de
MSLN
– /-. Murganhos portadores de células A549 xenoenxertados
Para determinar se MPF actua directamente sobre as células A549 para melhorar o seu crescimento ou a agressividade, que estavelmente transfectadas cDNA do
MPF
em células A549. MPF expressão foi avaliada por ensaio ELISA modificado de meio condicionado e a quantidade produzida por um × 10
6 células foi calculada com base numa curva padrão de recombinante de MPF. Enquanto A549 /MPF clones produziram aproximadamente 400 ng de MPF em 48 horas, não MPF foi detectada no meio condicionado de células A549 transf ectadas com vector de controlo (A549 /pcDNA). Notamos nenhuma diferença óbvia na taxa de crescimento ou morfologia do
MPF
células A549 -transfected quando comparado com o controlo transfectadas com vector (dados não mostrados). o crescimento ancoragem independente destas células em agar mole foi também avaliada. Como mostrado na Tabela 2, não há nenhuma diferença estatística na formação de colónias de entre
MPF
-transfected e a linha de controlo transfectadas com vector. Estas experiências sugerem que o MPF não promove diretamente o crescimento das células A549.
Discussão
Para nosso estudo, nós criamos um modelo de camundongo que não tem o
MSLN
do gene e é permissivo para o crescimento de células cancerosas humanas. A linha celular de cancro do pulmão A549 utilizada para formar tumores IP nas nossas experiências faz apenas quantidades mínimas de mMSLN, de tal modo que todos MPF e mMSLN devem ser fornecidos exogenamente. Observou-se uma diferença estatisticamente significativa 15 dias na sobrevida entre
MSLN + /+ Comprar e
MSLN
– /- ratos com tumores A549 intraperitoneal. Este achado foi linha celular específica e, de forma interessante, não observada no modelo subcutâneo. Estes resultados indicam que um produto da
gene MSLN
desempenha um papel importante na promoção da
em
vivo
crescimento e progressão tumoral para alguns tipos de células cancerosas que crescem dentro do peritoneal cavidade.
MPF e mMSLN são ambos produtos de proteína feitas pela expressão do gene
MSLN
. Ambas as proteínas são altamente expressa por um número de doenças malignas incluindo tumores sólidos mesotelioma, do pâncreas e do ovário [1], [4]. Vários estudos investigaram como as alterações na expressão do gene de
MSLN
pode alterar o crescimento de tumores, progressão ou invasão de produzir um fenótipo tumoral mais agressivo. A sobre-expressão do gene de
MSLN
foi mostrada para aumentar a interleucina (IL) -6 sinalização [11], e para conferir resistência ao factor de necrose tumoral (TNF) -a apoptose mediada em linhas celulares de cancro pancreático [20]. A expressão ectópica do
MSLN
gene em uma linha de células de cancro da mama humano promoveu o crescimento sobrevivência celular e independente de ancoragem
em
vitro
[10]. Outros estudos têm demonstrado um papel vital para o
gene MSLN
na regulação do crescimento e apoptose via ambas as vias-p53 dependentes e independentes em células de câncer pancreático [12]. Em todos eles
em
vitro
estudos, os efeitos pró-tumorigênicos de
MSLN
gene manipulação foram Presume-se ser mediada por mudanças na expressão de mMSLN, embora a genética manipulações nos experimentos deve produzir alterações semelhantes de níveis MPF
para separar as contribuições feitas pelo MPF ou mMSLN para o fenótipo observamos em nosso estudo, fornecemos proteína recombinante exógeno ao
MSLN
. – /- ratos. Verificou-se que a suplementação de MPF diminuiu a sobrevivência dos animais 15 dias, em comparação com os ratinhos tratados com uma proteína de controlo. Enquanto a suplementação com mMSLN fez diminuir sobrevivência estatisticamente significativas a 4 dias, é evidente que MPF é o factor mais potente no nosso modelo.
MPF foi originalmente identificada como um factor de crescimento que poderiam promover a formação de colónias de megacariócitos, quando administrado em combinação com IL-3 [5]. Até à data, nenhum receptor MPF foi identificada em megacariócitos ou quaisquer outras células. Nem têm teorias foram apresentadas para explicar por que uma proteína normalmente expressa exclusivamente por células mesoteliais deve ter uma função primária como um fator megacari�itos estimulante. Curiosamente, em nossos experimentos, enquanto o MPF aumento da agressividade do tumor
em
vivo
, a superexpressão forçada do MPF não produziu nenhuma vantagem de crescimento
em
vitro.
Esta sugere que o efeito de MPF sobre a agressividade do tumor não é mediado por uma acção directa do MPF sobre o tumor, mas talvez por trabalhar indirectamente a outras células. Embora possa ser tentador considerar que MPF pode ter uma função de efector imune, as nossas experiências foram conduzidas em ratinhos de linfócitos-deficiente, o que sugere que um outro mecanismo é mais provável que seja responsável. Identificação do tipo (s) celular responsável por mediar este efeito de MPF é para além do âmbito do presente estudo.
Embora as nossas observações foram feitas utilizando um único tipo de célula, o efeito foi observado na sobrevivência foi profundo e altamente reprodutível. Os nossos dados sugerem que MPF pode ser um importante mediador da agressividade do tumor na cavidade peritoneal, e que a inibição ou o sequestro de MPF pode ser clinicamente útil em retardar o crescimento de alguns cancros que crescem na cavidade peritoneal. Foram iniciados estudos para testar esta hipótese.