Abstract

O surgimento da proteína quinase D (PKD) como um potencial alvo terapêutico para várias doenças, incluindo câncer provocou a busca de inibidores de pequenas moléculas potentes, selectivos e de células-permeável. Neste estudo, descrevemos a identificação,

in vitro

caracterização, análise de estrutura-atividade e avaliação biológica de um andaime inibitória romance PKD exemplificado por 1-naftil PP1 (1-NA-PP1). 1-NA-PP1 e IKK-16 foram identificados como inibidores pan-PKD em um ensaio biblioteca inibidor da quinase alvo em pequena escala. Ambas as visitas de rastreio inibida PKD isoformas a cerca de 100 nm e foram inibidores ATP-competitivos. Análise de várias quinases relacionadas indicaram que 1-Na-PP1 foi altamente selectiva para PKD, em comparação com IKK-16. Análise SAR mostrou que 1-NA-PP1 foi consideravelmente mais potente e mostrou efeitos dos substituintes distintas no núcleo pirazolopirimidina. 1-Na-PP1 foi célula-activo, e potentemente bloqueou a proliferação de células do cancro da próstata através da indução de G2 /M de detenção. Também potente bloqueou a migração e invasão das células cancerosas da próstata, demonstrando atividades anticancerígenas promissores em várias frentes. A sobre-expressão de PKD1 ou PKD3 invertida quase completamente a paragem do crescimento e a inibição da invasão de células de tumor causado por 1-Na-PP1, indicando que as suas actividades anti-proliferativas e anti-invasivos foram mediada através da inibição de PKD. Curiosamente, um aumento de 12 vezes na sensibilidade para 1-Na-PP1 pode ser alcançada por engenharia de uma mutação gatekeeper no local activo de PKD1, o que sugere que 1-Na-PP1 pode ser emparelhado com o sensível ao análogo de PKD1

M659G para dissecar funções específicas do PKD e vias de sinalização em vários sistemas biológicos

Citation:. Tandon M, Johnson J, Li Z, Xu S, Wipf P, Wang QJ (2013) New pirazolopirimidina inibidores da proteína quinase D como Anticancer Agents potentes para células cancerosas da próstata. PLoS ONE 8 (9): e75601. doi: 10.1371 /journal.pone.0075601

editor: Makoto Kanzaki, Universidade de Tohoku, Japão

Recebido: 30 Janeiro, 2013; Aceito: 18 de agosto de 2013; Publicação: 23 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tandon et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo National Institutes of Health (R01CA129127-01, R01CA142580-01 e P50-GM067082). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. O co-autor Qiming Jane Wang é um membro do Conselho Editorial PLOS. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Na sequência da descoberta de Gleevec, foi amplamente demonstrado que altamente potente e específica molécula pequena inibidores de cinases apresentam notável eficácia clínica e toxicidade reduzida [1]. As proteína-quinases são reguladores-chave das vias de transdução de sinal e portanto alvos terapêuticos atractivos para muitas doenças. A família da serina /treonina proteína quinase D (PKD) formam um grupo distinto de cálcio /proteína cinases dependentes de calmodulina (CaMK) [2], [3]. As três isoformas conhecidas de PKD (PKD1, PKD2 e PKD3) desempenham papéis importantes em vários processos celulares fundamentais, incluindo a proliferação celular, sobrevivência, migração, regulação gênica, tráfego de proteínas, ea resposta imune [4], [5]. Em particular, de PKD1 tem sido implicada em muitos aspectos do desenvolvimento do tumor, tais como crescimento tumoral, metástase e angiogénese [4]. actividade de PKD aberrante e expressão foram detectados em várias linhas celulares tumorais e tecidos tumorais de pâncreas [5], para a pele [6], [7] e da próstata [8], [9]. PKD medeia as principais vias de sinalização que são essenciais para o desenvolvimento do cancro, incluindo o VEGF e MEK /ERK vias de sinalização [4], apoiando um papel activo de PKD em processos biológicos associados a tumor em diversos tipos de cancro [5], [7], [ ,,,0],9] – [12].

PKD é um componente chave de sinalização do diacilglicerol (DAG) rede de sinalização. É um objectivo primário da DAG e um efector a jusante da proteína quinase C (PKC). Existem vários motivos estruturais conservados em PKD, tais como um domínio que se liga C1 DAG e modula PKD localização, e um domínio PH, que exerce uma função autoinhibitory no domínio de cinase. Em células intactas, PKD está directamente fosforilada por PKC DAG-responsivas em que os dois resíduos de serina conservada na ansa de activação do domínio catalítico, o que conduz à sua activação. PKD geralmente apresenta atividade sustentada após a ativação, que é mantida principalmente através autofosforilação [5].

Nos últimos anos, progressos significativos foram feitos no desenvolvimento de inibidores de PKD pequenas moléculas potentes e específicos. CID755673 e análogos [13], [14], 2,6-naftiridina e bipiridilo inibidores e os seus análogos [15] – [17], 3,5-diarylazoles [18], CRT0066101 [19], e CRT5 [20] demonstraram a inibição específica de PKD

in vitro Comprar e em células intactas. Particularmente, CRT0066101 foi encontrado para bloquear de forma potente o crescimento de xenoenxertos de tumores pancreáticos

in vivo

em ratos [19]. Apesar destes avanços significativos, sem inibidor específico PKD-subtipo está disponível, e os inibidores de PKD ainda têm de avançar para a clínica. Em parte, a ausência de candidatos clínicos pode ser atribuído à seletividade limitada,

in vivo

estabilidade e questões gerais de toxicidade com o conjunto atual de inibidores conhecidos. Portanto, é imperativo continuar a busca de novos quimiotipos inibitórios PKD que demonstram atraente seletividade alvo, melhores perfis farmacocinéticos e maior

in vivo

eficácia.

Temos anteriormente identificada, tanto ATP-competitiva e inibidores de PKD -noncompetitive que são diferentes em estrutura aos outros inibidores relatados [13], [14], [21] – [23]. Estes acessos foram identificados em uma campanha HTS usando grandes, imparciais bibliotecas de moléculas pequenas. Subsequentemente, as estratégias de química medicinal foram utilizados para optimizar a actividade, selectividade, e propriedades físico-químicas de uma estrutura de chumbo, CID755673, resultando em uma série de análogos que mostraram a inibição alvo melhorada

in vitro e em células

, e melhorou metabólica perfis de [13], [14], [21] – [24]. Aqui, descrevemos a identificação e avaliação de um novo chemotype inibitória PKD com base em 1-naftil PP1 (1-NA-PP1), um pirazolopirimidina que foi originalmente concebido para a quinase mutante sensível ao analógico de src [25]. Este inibidor foi identificado em uma pequena biblioteca, alvo de diversos inibidores da quinase. 1-NA-PP1 exibiu excelente seletividade para PKD com atividade inibitória pouca ou nenhuma por duas cinases relacionadas, CaMK ou PKC. Ele inibiu potentemente a proliferação, a migração e a invasão de células cancerosas da próstata. Uma análise posterior revelou SAR determinantes estruturais importantes para este composto de chumbo e posiciona 1-NA-PP1 como uma nova e distinta chemotype inibidor PKD com o potencial para produzir candidatos desenvolvimento para

in vitro

e

In vivo

aplicações.

resultados

a identificação de novos scaffolds inibitórios PKD de uma biblioteca de inibidor da quinase alvo

Oitenta inibidores da quinase quimicamente diferentes foram selecionados a partir de um Tocris Biociências coleção pequena molécula. O

actividade inibidora in vitro

PKD1 destes compostos foi avaliada com base na sua capacidade para inibir a proteína PKD1 recombinante a uma concentração uM num ensaio de cinase de PKD radiométrica. A inibição de PKD1 percentual foi calculada como a percentagem de inibição da actividade total de PKD1 quinase na ausência de inibidores (DMSO). Dezasseis compostos foram identificados como acessos primários (≥50% de inibição da actividade total de PKD1 quinase) no ensaio radiométrico de PKD1 (Tabela 1). Entre estes hits, 1-Na-PP1, um inibidor de quinase Src mutante, e IKK-16, um inibidor da IkB-cinase, suprimiu 77% e 67% da actividade de PKD1 a 1 uM, respectivamente, e foram seleccionados para posterior caracterização com base na sua potência e características estruturais distintas.

1-nA-PP1 e IKK-16 são novos pan-PKD inibidores

O

in vitro

IC

50 de 1-na-PP1 e IKK-16 foi determinada em uma curva de concentração de 10 pontos, utilizando um ensaio de quinase de PKD radiométrica [13]. PKD1 humano recombinante, 2, ou 3 proteínas foram incubadas numa mistura contendo um substrato péptido derivado a partir de um substrato de PKD, HDAC-5, e 10 concentrações diferentes dos dois compostos. Como mostrado na Fig. 1A, 1-NA-PP1 e IKK 16 inibiu todas as três isoformas de PKD com quase igual potência. 1-Na-PP1 inibida PKD1, 2, e 3 com uma IC

50 de 154,6 ± 21,8 nM (N = 3), 133,4 +/- 3,6 nM (n = 3), 109,4 +/- 6,8 nM (n = 3), respectivamente, enquanto que a IKK-16 inibiu de modo semelhante a PKD isoformas com um IC

50 de 153,9 +/- 7,7 nM (n = 2) para PKD1, 115,0 +/- 7,1 nM (n = 2) para PKD2 , e 99,7 +/- 3,0 nM (n = 2) para PKD3. Estes resultados indicam que tanto 1-Na-PP1 e IKK 16 são inibidores potentes pan-PKD.

Inibição de PKD1 humano recombinante, 2 e 3 foi ensaiado na presença de 10 concentrações diferentes de 1-na-PP1 (a) e IKK-16 (B) por um

in vitro

ensaio PKD quinase radiométrica. Os sub

50 valores IC foram calculados como a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes com determinações em triplicado para cada concentração de fármaco em cada ensaio. Os dados foram representados como uma função da concentração de droga e um gráfico representativo é mostrado.

1-Na-PP1 é um inibidor de ATP-competitiva com elevada selectividade para PKD sobre quinases intimamente relacionadas

para obter uma melhor compreensão do modo de ação para 1-nA-PP1 e IKK-16, que examinou os efeitos de concentrações crescentes de ATP na inibição PKD1. lotes de Lineweaver-Burk foram gerados através da representação gráfica do recíproco das velocidades de reacção (1 /v) contra o recíproco da concentração de ATP (1 /[ATP]), em concentrações de compostos diferentes. Os pontos foram ajustados por regressão linear. Como se mostra a Fig. 2A-B, todas as linhas convergentes no eixo Y, o que indica que ambos 1-Na-PP1 e IKK-16 eram inibidores competitivos de ATP.

PKD1 actividade de cinase foi medida como uma função de concentrações crescentes de ATP na presença de várias concentrações de 1-na-PP1 (a) e de IKK-16 (B). lotes de Lineweaver-Burke dos dados são mostrados. Os dados apresentados foram representativos de três experiências independentes.

Em seguida, determinou-se a especificidade de 1-NA-PP1 e IKK-16 para PKD, examinando a sua actividade durante várias quinases funcionalmente ou estruturalmente relacionados, incluindo PKCα , PKCδ e CAMKIIα. Sem actividades inibidoras significativas para as isoformas de PKC foram detectados a 0,1, 1 e 10 uM concentrações de 1-na-PP1, em contraste com a IKK-16, que mostraram uma inibição, dependente da concentração, tanto para PKCα e PKCδ e 50% de inibição a 10 concentração uM (Fig. 3A-B). O potente inibidor de PKC GF109203X foi testado como um controlo positivo e de forma potente e dependente da concentração-inibição e PKCα PKCδ. PKD pertence a um subgrupo da família CaMK quinases e em ambas as famílias partilham elevada homologia de sequência. Isto levou-nos a avaliar a inibição da CAMKIIα por estes compostos. Como ilustrado na Fig. 3C, 1-Na-PP1 mostrou pouca actividade em CAMKIIα até 10 uM, enquanto que a IKK-16 causou inibição dependente da concentração da enzima e quase completamente revogada a sua actividade a 10 uM. Tomados em conjunto, estes dados indicam que 1-Na-PP1 é um inibidor altamente específico para PKD em relação a outras quinases intimamente relacionadas, incluindo PKC e CAMKs, enquanto que a IKK-16 é provavelmente um inibidor da quinase promíscuos.

Inibição da PKCα (a) ou PKCδ (B) foi determinada a 10 nM, 100 nM, 1 pM, e 10 uM. Como controlos, o inibidor de PKC GF109203X potentemente inibida actividade PKCα e PKCδ. Os dados são a média ± SEM de duas experiências independentes. C. Inibição da CAMKIIα foi medida pelo ensaio de quinase CaMK radiométrica. A experiência foi repetida duas vezes e um gráfico representativo é mostrado. A significância estatística foi determinada usando o teste-t não emparelhado. ns, não é estatisticamente significativa; *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01; ***,

p Art 0,001

Novas observações sobre a especificidade do 1-NA-PP1 pode ser adquirida através da avaliação da kinome dados de varredura em 1-naftilmetilo PP1 (. 1-NM-PP1), em que 1-NM-PP1, juntamente com 178 inibidores de quinase conhecidos, foi perfilado contra um painel de 300 proteínas cinases recombinantes humanos numa concentração única [26]. Como 1-NA-PP1, 1-NM-PP1 é também um análogo da PP1 derivatizado-C3 que difere do 1-Na-PP1 por apenas um grupo metilo ligando anéis de pirazol e naftilo. Os nossos dados mostraram que 1-NM-PP1 inibida PKD1 com um IC

50 de 138,7 ± 33,2 nM (N = 3) (Fig. 3D), que foi equivalente ao de 1-na-PP1 (154,6 nM). As suas actividades inibidoras para a maioria do tipo selvagem e mutadas cinases da família Src, também são comparáveis ​​[27], indicando que os dois inibidores não só são semelhantes em estrutura, mas também da actividade biológica. Os dados para uma especificidade-NM-PP1 foram extraídos em um cut-off de actividade de quinase residual de 50% utilizando o inibidor de cinase de Recursos (KIR) ferramenta online (https://kir.fccc.edu/) como descrito (Tabela S1) [26]. Os dados confirmaram a inibição da isoforma de PKD por este composto. Embora tenham sido identificadas metas adicionais de 1-NM-PP1, este inibidor apresentaram uma pontuação relativa alta Gini de 0,67 (a pontuação seletividade para quinases e inibidores da quinase), indicando maior seletividade. Enquanto isso, não há isoformas de PKC foram significativamente inibidas por este inibidor ( a actividade de quinase residual de 90% para todas as isoformas da PKC). Com base nisso e os resultados acima, optamos por concentrar apenas na 1-NA-PP1 em nossos estudos posteriores.

Síntese e SAR análise de análogos 1-NA-PP1

O objetivo da nossos estudos foi sintéticos para modificar os substituintes no 1-na-PP1 pirazolo [3,4-

d

] estrutura do núcleo de pirimidina e determinar a resposta biológica dessas modificações, bem como para identificar potencialmente mais PKD subtipo análogos selectiva. Considerou-se 4 tipos de variações, como mostrado na Fig. 4, e preparou um total de 18 derivados, incluindo o pai resynthesized, 1-NA-PP1.

A. modelo de 4-Zone para síntese analógica 1-NA-PP1. B. Síntese de 1

H

pirazolo [3,4

d

] pirimidinas 1.

Apenas duas variações foram exploradas na zona 1,

t-butilo e metilo

(Tabela 2). Em uma concentração uM, 1-Na-PP1 inibiu a actividade de PKD1 em 80%, ao passo que o seu análogo R

1 = metilo 1F só levou a uma redução de 32% da actividade. Todos os outros análogos com um substituinte metilo na zona 1 e várias substituições em zonas 2-4 foi ainda pior e demonstrou 10% Actividades inibitórias em 1 mM concentrações. A exigência de grupos volumosos em R

1 da pirazolopirimidina foi anteriormente reconhecida e parece ser uma característica geral para a inibição da quinase com este andaime [11]. No entanto, mesmo quando se mantém a

t-butil

grupo na zona 1, variações, tais como a introdução de um grupo metilo na zona 3 (1a), e substituições de o substituinte naftilo com outros anéis arilo (1b-e ) ablated a actividade de PKD1. Dessa forma, nosso SAR limitada em destaque 1-NA-PP1 como o composto mais potente com tolerância muito limitado para modificações estruturais de substituintes no núcleo pirazolopirimidina. Mesmo os derivados electrofílicos com um grupo de cloro na zona 4 e o potencial para a alquilação de enzima irreversível (1j, 1K, 1M, 1p, 1R) não mostraram um aumento na potência. Uma diminuição semelhante íngreme da actividade inibidora da tirosina cinase v-src de derivados de pirazolopirimidina foi observado anteriormente e está provavelmente relacionado com um padrão de ligações de hidrogénio específicas das zonas 2 e 3 na bolsa de ligao de ATP que não devem ser perturbados [25]. Assim, continuamos a nossa investigação do perfil inibidor da pirazolopirimidinas em PKD com o agente mais potente, 1-NA-PP1.

1-NA-PP1 é célula-ativa e provoca a inibição alvo na próstata células cancerosas

neste estudo, nós examinamos se 1-nA-PP1 foi célula permeável e capaz de inibição alvo em células intactas. O efeito de 1-na-PP1 em 12-miristato 13-acetato (PMA) induzida por activação endógena de PKD1 em células de cancro da próstata LNCaP foi analisada como anteriormente descrito [9], [23], [28]. PMA activa através de PKD dependente de PKC-trans-fosforilação de Ser744 /748 (S

744/748) na ansa de activação, seguida por autofosforilação de PKD1 em Ser916 (S

916) na extremidade C-terminal [29], [30]. PKD1 actividade correlaciona-se bem com o nível de fosfo-S

916 (S P-

916) [30]. Por conseguinte, utilizado p-S

916 para monitorizar a actividade de PKD e p-S

744/748 de PKD1 para determinar se o composto interfere com a induzida por PKC trans-fosforilação por possivelmente inibição da PKC. Como mostrado na Fig. 5, o tratamento de células LNCaP com 10 nM de PMA durante 20 min induzida ambos

744 sinais /748-PKD1 p-S

916-PKD1 e P-S. O pré-tratamento com o aumento da concentração de 1-na-PP1 concentração dependentemente da autofosforilação inibida em p-Ser

916-PKD1 com um IC

50 de 22,5 ± 1,5 uM (n = 2). Em contraste, dependente da PKC trans-fosforilação de Ser

744/748 não foi afetada pelo 1-NA-PP1. Assim, 1-NA-PP1 especificamente revogada atividade PKD1 sem bloquear mediada por PKC trans-fosforilação.

A. As células LNCaP foram pré-tratados com diferentes doses de inibidores durante 45 min, seguido de estimulação com PMA a 10 nM durante 20 min. lisados ​​celulares foram submetidas a immunoblotting para p-S

916-PKD1 e p-S

744/748-PKD1. Tubulina foi transferido como controlo de carga. A experiência foi repetida três vezes e os blots representativos são mostrados. B. Determinação do IC

50. As transferências de Western foram quantificados utilizando a análise de densitometria. Os dados foram representados graficamente e IC

50 valores foram derivados das curvas de concentração-resposta utilizando GraphPad. Um dos três curvas concentração-resposta foi mostrado.

1-NA-PP1 potente proliferação blocos de células de câncer de próstata por induzir G2 /M detenção

PKD surgiu como uma terapêutica promissora alvo para o câncer. Aqui, foram examinados os efeitos de inibição do alvo por PKD 1-Na-PP1 sobre a proliferação de células do cancro da próstata, a sobrevivência e a progressão do ciclo celular. A proliferação celular foi determinada por tratamento das células na concentração de 30 uM de agente, e em seguida o número de células foi contado durante seis dias consecutivos, na presença e ausência de inibidor. O crescimento e efeitos citotóxicos de 1-na-PP1 foi avaliada por contagem de número de células e ensaio de MTT. Como mostrado na Fig. 6A, 1-Na-PP1 com 30 uM causada paragem do crescimento drástica de células cancerosas da próstata PC3 a partir de dia 2 e persistiu até ao final da experiência (dia 6). 1-Na-PP1 morte celular induzida também concentração-dependente com um IC

50 de 23,3 ± 5,7 uM (n = 3) (Fig. 6B). Para fornecer uma visão no efeito da 1-Na-PP1 sobre a proliferação celular, foi examinada a consequência do tratamento 1-Na-PP1 sobre a distribuição do ciclo celular por citometria de fluxo. análise do ciclo celular foi realizada após o tratamento de células PC3 com 30 fiM de 1-na-PP1 durante 72 h. Como mostrado na Fig. 6C, 1-Na-PP1 aumentou significativamente a percentagem de células na fase G2 /M do ciclo celular, o que corresponde a uma mudança a partir de células de 5,8% em G2 /M no controle para 28,6% em 1-Na-PP1-tratada células, e implicando assim que a inibição do crescimento causada por 1-nA-PP1 é devido à sua capacidade de induzir G2 /M detenção.

A.1-nA-PP1 bloqueou a proliferação de células PC3. células PC3 foram plaqueadas em triplicado em placas de 24 poços. As células foram deixadas a ligar durante a noite. Uma contagem de células no dia 1 foi feito e, depois, foi adicionado um veículo (DMSO) ou 1-Na-PP1 a 10 uM. As células foram contadas diariamente durante um total de 5 dias. meios frescos e inibidor foram adicionados a cada 2 dias. Os meios de determinações em triplicado foram representados graficamente ao longo do tempo. A experiência foi repetida duas vezes e os resultados de uma experiência representativa são mostrados. B. 1-Na-PP1 induziu a morte celular em células PC3. células PC3 foram semeadas em placas de 96 poços (3000 células /poço) e foram depois incubadas em meio contendo inibidores de 0.3-100 ^ M durante 72 h. solução adicionou-se MTT a cada poço e incubou-se durante 4 h. A densidade óptica foi lida a 570 nm para determinar a viabilidade celular. A IC

50 foi determinado como a média de duas experiências independentes para cada composto. C. 1-NA-PP1 causado /M parada do ciclo celular fase G2. células PC3 foram tratadas com quer veículo (DMSO), ou 10