Abstract
Fundo
Atualmente, a quimioterapia é limitado principalmente aos medicamentos genotóxicos que estão associados com efeitos colaterais graves devido à segmentação não-seletivo de tecido normal. produtos naturais desempenham um papel significativo no desenvolvimento da maioria dos agentes quimioterapêuticos, com 74,8% de toda a quimioterapia disponível a ser derivada a partir de produtos naturais.
Objectivo
Para avaliar e validar cientificamente o potencial anti-cancro de um extrato etanólico dos frutos da pimenta-longa (PLX), uma planta da
piperáceas
família que tem sido usada na medicina tradicional, especialmente Ayurveda e investigar o mecanismo anticancerígeno de ação da PLX contra as células cancerosas.
Materiais Métodos
Após o tratamento com etanólico extrato de pimenta longa, a viabilidade celular foi avaliada utilizando um sal de tetrazólio solúvel em água; indução de apoptose foi observada após coloração nuclear pela Hoechst, a ligação da anexina V à microscopia de fosfatidilserina e contraste de fase exteriorizada. citometria baseada em imagem foi utilizado para detectar o efeito do extracto de pimenta longa na produção de espécies de oxigénio reactivas e a dissipação do potencial da membrana mitocondrial seguinte tetrametilrodamina ou 5,5,6,6′-tetracloro-1,1 ‘, 3, coloração de cloreto de 3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine (JC-1). Avaliação de PLX
in vivo
foi realizado utilizando ratinhos Balb /C (toxicidade) e ratinhos imunocomprometidos CD-1 nu /nu (eficácia). A análise por HPLC permitiu a detecção de alguns compostos primários presentes dentro de nossa longa extrato de pimenta.
Resultados
Nossos resultados indicaram que uma etanólico extrato de pimenta longa induz selectivamente apoptose independente de caspase em células cancerosas, sem afetar não -cancerous células, segmentação por a mitocôndria, que conduz à dissipação do potencial de membrana mitocondrial e aumento da produção de ROS. Lançamento do FIA e endonuclease G de mitocôndrias isoladas confirma a mitocôndria como um alvo potencial da pimenta longa. A eficácia de PLX em
em estudos in vivo
indica que a administração oral é capaz de parar o crescimento de tumores de cancro do cólon em ratinhos imunocomprometidos, com nenhuma toxicidade associada. Estes resultados demonstram a alternativa potencialmente seguro e não tóxico que é longo extrato de pimenta para a terapia do cancro
Citation:. Ovadje P, Ma D, Tremblay P, Roma A, Steckle M, Guerrero J-A, et al. (2014) Avaliação da Eficácia Mecanismo bioquímico de Indução Cell Death por
Piper longum
seletivamente extrair em
In-Vitro
e
In-Vivo
modelos de células cancerosas humanas. PLoS ONE 9 (11): e113250. doi: 10.1371 /journal.pone.0113250
editor: Stephanie Filleur, Texas Tech University Health Sciences Center, Estados Unidos da América
Recebido: 29 de maio de 2014; Aceito: 21 de outubro de 2014; Publicação: 17 de novembro de 2014
Direitos de autor: © 2014 Ovadje et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados são apresentados sob a forma de figuras e tabelas, que podem ser encontrados no manuscrito
Financiamento:. Este estudo foi financiado pela Windsor Fundação do Condado de Essex Cancer Centre por Seeds4Hope Grant (URL: https://windsorcancerfoundation.org/). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. O co-autor Siyaram Pandey é um membro do Conselho Editorial PLOS. No entanto, isso não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas e critérios editoriais.
Introdução
O contínuo aumento na incidência de câncer significa uma necessidade de mais investigação sobre mais eficaz e menos alternativas tóxicas aos tratamentos atuais. Só no Canadá, estima-se que 267.700 novos casos de câncer surgirão, com 76,020 mortes ocorrendo só em 2012. As estatísticas globais são ainda mais terríveis, com 12,7 milhões de casos de câncer e 7,6 milhões de mortes por câncer decorrentes em 2008 [1], [2]. As características das células cancerosas descobrir a dificuldade em alvejar seletivamente as células cancerosas. As células cancerosas são notórias para sustentar a sinalização proliferativa, evitando a supressão do crescimento, ativando invasão e metástase e resistindo a morte celular entre outras características [3]. Estas características colocam vários desafios no desenvolvimento de terapias anticâncer sucesso. A capacidade das células cancerosas a evadir eventos de morte celular tem sido o centro de atenção de muita pesquisa, com foco centrado na segmentação os vários aspectos vulneráveis de células cancerosas para induzir diferentes formas de morte celular programada (PCD) em células cancerosas, sem Associated toxicidades a células não-cancerosas.
a apoptose (PCD tipo I) foi estudado durante décadas, a compreensão de que irá aumentar o possível desenvolvimento de terapias contra o câncer mais eficazes. Esta é uma forma de morte celular que é necessária para o desenvolvimento normal e a homeostase celular, bem como um mecanismo de defesa para se livrar das células danificadas; As células que sofrem apoptose investir energia na sua própria morte, de modo a não se tornar um incómodo [2]. As células cancerosas escapar apoptose, a fim de conferir vantagem de crescimento adicional e sustento, portanto terapias anticancerígenos atuais esforçar-se para explorar as diversas vulnerabilidades de células cancerosas para acionar a ativação da apoptose, quer através de extrínseco ou vias intrínseca [4], [5]. Os desafios que enfrentam algumas das terapias do cancro disponíveis são as suas capacidades para induzir a apoptose em células cancerosas através da indução de danos no DNA genômico. Embora este é inicialmente eficaz, como a que se dirigem dividem rapidamente células [6], que são geralmente acompanhadas de efeitos secundários graves causados pela segmentação não-selectiva das células não cancerosas normais, o que sugere uma necessidade de outros alvos não comuns para a indução de apoptose sem as toxicidades associadas.
produtos de saúde naturais (PNH) têm mostrado uma grande promessa no campo da pesquisa sobre o câncer. Os últimos 70 anos foram introduzidos vários produtos naturais como a fonte de muitas drogas na terapia do cancro. Aproximadamente 75% das terapias anti-cancerígenos aprovados foram derivados a partir de produtos naturais, uma estatística esperada, considerando que mais de 80% da população do mundo em desenvolvimento é dependente dos produtos naturais para a terapia de [7]. produtos vegetais especialmente conter muitas substâncias químicas bioactivas que são capazes de desempenhar funções específicas no tratamento de várias doenças. Considerando-se as misturas complexas e propriedades farmacológicas de muitos produtos naturais, torna-se difícil estabelecer um alvo e mecanismo de acção de muitos NHPs específica. Com NHPs ganhando impulso, especialmente no campo da pesquisa do câncer, há uma série de novos estudos sobre a eficácia mecanicista e segurança dos NHPs como agentes anticancerígenos potenciais [8].
A pimenta longa, da família Piperaceae, tem sido utilizada durante séculos para o tratamento de várias doenças. Várias espécies de pimenta longa foram identificados, incluindo
Piper longum
(o extrato de que está a ser utilizado neste estudo),
Piper betle
,
Piper retrofactum
, extratos dos quais têm sido utilizados durante anos no tratamento de várias doenças. Uma longa lista de usos e benefícios estão associados com extratos de diferentes
Piper spp
, com relatos indicando sua eficácia como bons agentes digestivos e dores e supressores inflamatórios [9]. No entanto, há pouca ou nenhuma validação científica, única evidência anedótica, para os benefícios associados com o uso de extratos de pimenta longa. Há estudos científicos têm sido levadas a cabo em vários compostos presentes em extractos de pimenta longa, incluindo piperines, o qual foi demonstrado inibir a muitas reacções de transformação da bio drogas enzimática e desempenha funções específicas na activação metabólica dos carcinogénios e a produção de energia mitocondrial [10] – [13], e vários alcalóides de piperidina, com actividade fungicida [9], [14]. Alguns destes compostos têm demonstrado potente atividade antitumoral [15], sugerindo que extratos de pimenta longas poderia representar um novo NHP, com melhor eficácia seletiva contra as células cancerosas.
Neste estudo, examinamos a eficácia de um extrato etanólico a pimenta longa de fruta (PLX) contra várias células de cancro, bem como tentativa de elucidar o mecanismo de acção, a seguir ao tratamento. Os resultados deste estudo demonstram que o PLX reduziram a viabilidade de vários tipos de células de cancro numa dose e forma dependente do tempo, onde foi observada a indução de apoptose, na sequência de direccionamento mitocondrial e à libertação de factores pró-apoptóticos. Devido às baixas doses de PLX necessárias para induzir a apoptose em células de cancro, que era fácil de encontrar a janela terapêutica do presente extracto. A indução de apoptose foi encontrado para ser independente de caspase, apesar de não activação de ambas as vias intrínseca e extrínseca e a produção de ROS não foi essencial para o mecanismo da indução da morte celular por PLX. O extrato polychemical complexo do fruto da longa planta da pimenta, como um produto de saúde natural com atividade anticancerígena sem precedentes, fornece uma maneira de direcionar várias vulnerabilidades de células cancerosas. Mesmo na presença de certos inibidores, PLX foi eficaz na indução de apoptose, sugerindo a aplicação potencial de desenvolver PLX como uma terapia segura e eficaz do cancro.
Materiais e Métodos
Os estudos em animais foram realizados de acordo com o protocolo comissão de cuidados com os animais aprovado pela Universidade do Comitê animal Care Windsor; Este protocolo eo projeto foi aprovado pelo comitê de cuidados com os animais – o número de protocolo:. AUPP 10-17), de acordo com o Conselho Canadense de Animal Care (CCAC) orientações
Cultura de Células
A linha de células de melanoma maligno G-361, humanos linhas celulares de cancro colorrectal HT-29 e HCT116 (American Type Culture Collection, Manassas, VA, EUA Cat No. CRL-1687, CCL-218 . CCL-247, respectivamente) foram cultivadas com 5a meio de McCoy (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canadá) suplementado com 10% (v /v) de FBS (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e 40 mg /ml de gentamicina (Gibco, BRL, VWR). A linha celular de adenocarcinoma do ovário OVCAR-3 (American Type Culture Collection, Cat. No. HTB-161) foi cultivada em meio RPMI-1640 (Sigma-Aldrich Canadá, Mississauga, ON, Canadá) suplementado com 0,01 mg /ml de insulina bovina, 20% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS) padrão (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e 10 mg /ml de gentamicina. A linha celular de adenocarcinoma do pâncreas BxPC-3 (American Type Culture Collection, Cat. N ° CRL-1424) foi cultivada em meio RPMI-1640, suplementado com 10% (v /v) de soro fetal de bovino (FBS) e padrão de 40 mg /gentamicina mL. mucosa linha celular NCM460 cólon normal derivada (Incell Corporation, LLC., San Antonio, TX, EUA) foi cultivada em meio M3Base de Incell (Incell Corporation, LLC., Cat. No. M300A500) suplementado com 10% (v /v) FBS e 10 mg /ml de gentamicina.
Todas as células foram cultivadas em condições óptimas de crescimento de 37 ° C e 5% de CO2. Além disso, todas as células foram passadas para ≤6 meses.
Long pimenta Extração
maduros e secos indianos frutas pimenta longa foram obtidos a partir de Qualidade Alimentos naturais limitados, Toronto Ontario. O material vegetal foi moído e extraiu-se em etanol anidro (100%) numa proporção de 1:10 (1 g de material vegetal em 10 ml de etanol). A extracção foi realizada durante a noite num agitador à temperatura ambiente. O extracto foi passado através de um filtro grosseiro P8, seguido por um filtro de 0,45 um. O solvente foi evaporado usando um RotorVap a 40 ° C e reconstituída em sulfóxido de dimetilo (Me
2SO) a uma concentração final de estoque de 450 mg /ml.
celular Tratamento
As células foram plaqueadas e crescidas a 60-70% de confluência, antes de ser tratada com extractos de pimenta longa (PLX), N-acetil-L-cisteína (NAC) (Sigma-Aldrich Canadá, No. Cat. A7250), e o inibidor de caspase de largo espectro, Z-VAD-FMK (Merck Química, Gibbstown, NJ, EUA) nas doses indicadas e durações. NAC foi dissolvido em água estéril. Z-VAD-FMK foi dissolvido em dimetilsulfóxido (Me
2SO). PLX foi extraído como descrito anteriormente, reconstituída em Me
2 SO. Antes do tratamento, foi preparada uma concentração de trabalho diluída de 10 mg /ml em PBS. As células foram tratadas com a 10 mg /ml para obtidas as concentrações finais indicadas na seção de resultados.
avaliar a eficácia de pimenta longa Extract (PLX) em células cancerosas
WST-1 Ensaio para Viabilidade celular.
Para avaliar o efeito de PLX sobre as células cancerosas, de um sal de tetrazólio solúvel em água ensaio colorimétrico baseado (WST-1) foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, EUA ), para quantificar a viabilidade celular como uma função de metabolismo celular. Igual número de células foram semeadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos de fundo transparente, em seguida, tratadas com os tratamentos indicados nas concentrações indicadas e durações. Após o tratamento, as células foram incubadas com o reagente WST-1 durante 4 horas a 37 ° C com 5% de CO2. O reagente WST-1 é clivada em formazano por enzimas celulares em células que metabolizam activamente. O produto de formazano foi quantificada por tomar as leituras de absorvância a 450 nm num Wallac Victor
3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer, Woodbridge, ON, Canadá). viabilidade celular como uma medida da atividade metabólica foi expressa como percentagens dos grupos de controlo com solvente.
coloração nuclear.
Após o tratamento, os núcleos das células foram coradas com 10 � Hoechst 33342 dye ( molecular Probes, Eugene, oR, USA) ou 1 mg /mL de iodeto de propídio (PI) (Sigma Aldrich, Mississauga, ON. Canadá), para monitorar a morfologia nuclear para indução de apoptose em pontos de tempo designados e morte celular global. As células foram incubadas com 10 uM de corante Hoechst e 1 mg /ml de PI durante 10 minutos e micrografias foram obtidas com um Leica DM IRB microscópio de fluorescência invertido (Wetzlar, Alemanha) a 400 x de ampliação. citometria baseada em imagem foi usada para quantificar a quantidade de morte celular que ocorre com coloração de PI.
Anexina V Ensaio de Ligação.
para confirmar a indução da apoptose, a ligação de anexina V a fosfatidilserina exteriorizada na superfície celular externa, foi avaliada. A seguir ao tratamento com PLX, as células foram lavadas duas vezes em solução salina de tampão fosfato (PBS). Subsequentemente, as células foram ressuspensas e incubadas em tampão de Anexina V (HEPES 10 mM, NaOH a 10 mM, NaCl 140 mM, CaCl2 1 mM, pH 7,6) com Anexina V AlexaFluor-488 (01:50) (Invitrogen, Canadá, gato n vinculativo . A13201) durante 15 minutos. No final de 10 minutos de incubação, 10 uM Hoechst e 1 mg /ml de iodeto de propídio foram adicionados ao tubo de microcentrífuga e incubadas durante os últimos 10 minutos no escuro. As micrografias foram tomadas a 400 x de ampliação em um microscópio invertido Leica DM IRB (Wetzlar, Alemanha) e citometria de base-imagem foi usada para quantificar a percentagem de morte celular programada (anexina V células positivas) que ocorrem após o tratamento.
TUNEL coloração para detectar danos no DNA e quantificar apoptose.
Após o tratamento PLX, células HT-29 foram marcados com o ensaio Terminal desoxinucleotidilo transferase dUTP nick final rotulagem (TUNEL). O ensaio foi realizado de acordo com o protocolo do fabricante (Molecular Probes, Eugene, OR), a fim de detectar danos no ADN. As células foram tratadas com PLX ou VP-16 (como um controlo positivo) nas concentrações indicadas e os pontos de tempo e analisadas para a fragmentação de ADN. Após o tratamento, as células foram fixadas, suspendendo-os em 70% de etanol (v /v) e armazenadas a -20 ° C durante a noite. A amostra foi então incubada com uma solução de marcação de ADN (tampão de reacção de 10 uL, 0,75 mL de enzima TdT, 8 uL BrdUTP, 31,25 mL de dH2O) durante 1 hora a 25 ° C. Cada amostra foi exposta a uma solução de anticorpo (5 mL Alexa Fluor 488 anticorpo marcado com anti-BrdU e 95 ul solução de enxaguamento). As células foram incubadas com a solução de anticorpo durante 20 minutos e as células positivas TUNEL foram quantificadas por citometria baseada em imagem.
Total celular ROS Geração.
A seguir ao tratamento com PLX, as células foram incubadas com 2 ‘, 7’-Dichlorofluorescin diacetato H
2DCFDA (Catálogo N ° D6883, Sigma Aldrich, Mississauga NO. Canada) durante 45 minutos. As células foram recolhidas, lavadas duas vezes em PBS e a fluorescência verde foi observada usando um TALI imagem baseada em citómetro (Invitrogen, Canadá). NAC foi usado para avaliar a dependência da PLX na geração e viabilidade ROS.
Avaliação da função mitocondrial após o tratamento PLX
tetramethylrhodamine Metil Ester (TMRM) Coloração.
Para monitorar potencial de membrana mitocondrial (MMP), éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM) (Gibco BRL, VWR, Mississauga, ON, Canada) ou 5,5,6,6′-tetracloro-1,1 ‘, 3,3’-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine cloreto de ( foram usadas JC-1) (Invitrogen, Canadá). As células foram cultivadas em lamelas, tratadas com as concentrações indicadas de tratamentos nos pontos de tempo indicados, e incubadas com 200 nM de TMRM durante 45 minutos a 37 ° C. As micrografias foram obtidas a 400 x de ampliação num Leica DM IRB microscópio de fluorescência invertido (Wetzlar, Alemanha). Para confirmar os resultados obtidos por microscopia de fluorescência, citometria baseada em imagem foi usada para detectar a fluorescência vermelha. As células foram semeadas em placas de 6 poços e após o tratamento, as células foram incubadas com TMRM durante 45 minutos, lavadas duas vezes em PBS e colocados em TALI desliza. fluorescência vermelha foi obtido utilizando um TALI imagem baseada em citómetro (Invitrogen, Canadá).
Isolamento mitocondrial para Avaliar mitocondrial segmentação.
As células foram recolhidas por tripsina, lavadas uma vez em PBS frio, ressuspenderam-se em tampão hipotónico frio (1 mM de EDTA, 5 mM de Tris-HCl, manitol 210 mM, sacarose 70 mM, 10 ^ M Leu-PEP e PEP-A, PMSF 100 ^ M), e homogeneizada manualmente. A solução de células homogeneizado foi centrifugado a 3000 rpm durante 5 minutos a 4 ° C. O sobrenadante foi centrifugado a 12000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C e o sedimento mitocondrial foi ressuspenso em tampão frio de reacção (malato 2,5 mM, succinato 10 mM, 10 ^ M Leu-PEP e PEP-A, 100 uM de PMSF em PBS). As mitocôndrias isoladas foram tratados com PLX nas concentrações indicadas e incubaram-se durante 2 horas em tampão de reacção frio. O grupo controle foi tratado com solvente (etanol). Após 2 horas de incubação com extracto, amostras mitocondriais foram agitadas e centrifugadas a 12000 rpm durante 15 minutos a 4 ° C. O sobrenadante mitocondrial e peletes resultantes (ressuspensas em tampão de reacção frio) foram sujeitos a análise de Western blot para avaliar para a libertação mitocondrial /retenção dos factores pró-apoptóticos.
As análises Western blot.
Proteína As amostras foram submetidas a SDS-PAGE, transferidas para uma membrana de nitrocelulose e bloquearam-se com leite a 5% v TBST (Tris-Soro Fisiológico tamponado com Tween-20) solução /W durante 1 hora. As membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com um anti-L endonuclease (EndoG) anticorpo (1:1000) criado em coelhos (Abcam, Cat. No. ab9647, Cambridge, MA, EUA), uma subunidade anti-desidrogenase de succinato (A SdhA) anticorpo (1:1000) elevou em camundongos (Santa Cruz Biotechnology, Inc., SC-59687, Paso Robles, CA, EUA), ou um anti-apoptose factor indutor (AIF) anticorpo criado em coelhos (1:1000) (Abcam, Cat. No. ab1998, Cambridge, MA, EUA). Após incubação do anticorpo primário, a membrana foi lavada uma vez durante 15 minutos e duas vezes durante 5 minutos em TBST. As membranas foram incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente com um anti-rato ou um anticorpo de rábano anti-coelho secundário conjugado com peroxidase (1:2000) (Abcam, ab6728, ab6802, Cambridge, MA, EUA), seguido por três lavagens de 5 minutos em TBST. reagente de quimioluminescência (Sigma-Aldrich, CPS160, Mississauga, ON, Canadá) foi usado para visualizar as bandas de proteína e análise de densitometria foi realizada utilizando o software ImageJ.
In-Vivo
Avaliação de Extracto pimenta longa
avaliação de toxicidade.
Seis ratinhos semanas de idade Balb /c foram obtidos a partir de Charles River Laboratories e alojados em condições laboratoriais constantes de uma luz de 12 horas ciclo /escuro, em conformidade com os protocolos animais delineado na Universidade de Windsor Ética em Pesquisa tabuleiro AUPP 10-17). Após aclimatação, os ratos foram divididos em três grupos (3 animais /controlo (não tratadas), 3 animais /controlo gavagem (veículo de tratamento) e 4 animais /grupo de tratamento). O grupo não tratado de controlo foi dada água pura filtrada, enquanto o segundo e o terceiro grupo foi administrado 50 mg /kg /dia de veículo (Me
2SO) ou PLX, respectivamente, durante 75 dias. Durante o período de estudo, a toxicidade foi medida por pesagem ratinhos duas vezes por semana e a urina foi recolhida para análise de urina por vareta de proteínas da urina e ensaios Bradford. Após a duração do estudo, os ratos foram sacrificados e seus órgãos (fígados, rins e coração) foram obtidos para imuno-histoquímica e análise toxicológica pelo Dr. Brooke na Universidade de Guelph.
Eficácia da PLX no tumor xenoenxerto modelos de os ratinhos imunocomprometidos.
de seis semanas de idade macho CD-1 nu /nu foram obtidos a partir de Charles River Laboratories e alojados em condições laboratoriais constantes de uma luz de 12 horas ciclo /escuro, em conformidade com os protocolos descritos em animais da Universidade de Windsor tabuleiro de Ética em Pesquisa AUPP 10-17). Após aclimatação, os ratos foram injectados por via subcutânea no lado direito e esquerdo flancos traseiros com uma suspensão de células do cancro do cólon (em tampão fosfato salino) a uma concentração de 2 * 10
6 células /rato (HT-29, p53
– /-, no flanco esquerdo e HCT116, p53
+ /+, no flanco direito). Os tumores foram deixados a desenvolver (aproximadamente uma semana), após o que os animais foram distribuídos aleatoriamente em grupos de tratamento de 4 ratinhos por grupo, um grupo de controlo, um grupo de controlo gavagem dada água estéril bruto filtrado, assim como regime de gavagem do veículo (5 mL Me
2SO em PBS) duas vezes por semana. O último grupo foi dada água filtrada suplementado com longa extracto de pimenta, a uma concentração de 100 ug /ml, assim como regime de administração por sonda de extracto de pimenta longa (extracto de 5 mL em PBS), duas vezes por semana, o que corresponde a 50 mg /kg /dia . Os tumores foram avaliados a cada dois dias, medindo o comprimento, largura e altura, utilizando um compasso de calibre padrão e o volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula π /6 * comprimento * largura. Os ratos também foram avaliados para qualquer perda de peso em dias alternados durante a duração do estudo, que durou 75 dias, após o que os animais foram sacrificados e os seus órgãos e tecidos (fígado, rins, coração e tumores) foram obtidas e armazenadas em 10 % de formaldeído para análise imuno-histoquímica e toxicológica
hematoxilina Eosina (H E). Coloração
órgãos dos ratos foram fixados em formol a 10%, após o que foram criosseccionada em 10 mm seções e colocado em um SuperFrost /Plus lâminas de microscópio (Fisherbrand, Fisher Scientific). Seções de órgãos foram coradas de acordo com um H padronizado E protocolo [16].
análise fitoquímica do extrato pimenta longa por HPLC
A análise por HPLC do extrato bruto pimenta longa foi realizado na Universidade de Ottawa no laboratório Arnason. Um total de cinco piperamides bem conhecidas foram analisados e comparados ao longo extracto de pimenta bruta. Analisaram-se os padrões e os extractos piperamide numa Luna C18-5u-250 × 4,6 mm a 45 ° C a uma taxa de fluxo de 1,0 mL /min com uma fase móvel constituída por H
2O e metanol como delineado na Tabela 1 . perfis cromatograma foram usadas para detectar as eventuais diferenças entre um padrão de amostra de piperamides conhecidos nos extratos de pimenta longa bruto.
Análise estatística
Todos os experimentos foram repetidos pelo menos três vezes independentes . imagens de fluorescência representativos foram mostrados, se for caso disso. A análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism software 6.0 288. A média e o erro padrão de três experiências independentes foram analisadas para os dados de quantificação. T-teste de Student e ANOVA de duas vias foram utilizados para análise estatística
Resultados
extrato etanólico de pimenta longa (PLX) de forma eficaz e seletivamente reduz a viabilidade de Induz a apoptose em células de câncer em uma Dose Tempo modo dependente
O primeiro passo na compreensão do efeito do extracto de pimenta longa neste estudo foi o de avaliar o efeito de PLX sobre a viabilidade das células cancerosas. A seguir ao tratamento com o aumento da concentração de PLX a aumentar a pontos de tempo, as células foram incubadas com um sal de tetrazólio solúvel em água, que fica metabolizado a um produto de formazano vermelho por células viáveis com o metabolismo activo. Este produto pode, então, ser quantificada por espectrometria de absorvância. Observou-se a eficácia de PLX bruto na redução da viabilidade das células cancerosas, incluindo cólon (HCT116), do cancro do pâncreas (BxPC-3), do ovário (OVCAR-3) e células de melanoma. Este efeito era dependente da dose e do tempo (Figura 1). Para melhor avaliar a atividade anticâncer de PLX, queríamos avaliar o seu papel na morte celular e sua seletividade para células cancerosas. Os nossos resultados demonstram que o PLX é capaz de induzir selectivamente a morte celular em células cancerosas (cólon, pâncreas e leucemia) em uma dose e forma dependente do tempo, conforme caracterizado por o aumento de iodeto de propidio de células positivas em células cancerosas tratadas com PLX (Figura 2) . Além disso, este efeito foi selectivo, tal como células epiteliais do cólon normais permaneceram inalterados por este tratamento, nas mesmas concentrações e intervalos de tempo (Figura 2B). Estes resultados foram quantificadas usando citometria baseada em imagem para determinar a percentagem de células que sofrem apoptose e morte celular total. Observou-se um aumento de 30-40%, em células positivas para anexina V, a seguir ao tratamento e um PLX 80-100% de aumento positivo PI nas mesmas amostras de células, confirmando a indução de apoptose, seguindo por necrose em células cancerosas em cultura (Figura 3).
Colon (HCT116), ovário (OVCAR-3), as células cancerosas do pâncreas (BxPC-3) e melanoma (G-361) foram tratados com um extrato bruto etanólico de pimenta longa (PLX), após o que foram incubadas com corante de viabilidade de células WST-1 durante 4 horas. A absorvância foi lida a 450 nm e expressa como uma percentagem do controlo. Os valores são expressos como média ± DP a partir de quadruplicados de 3 experiências independentes. ** P . 0,0001
(A) A seguir ao tratamento de pâncreas humano (BxPC-3) células de leucemia de células T do cancro e com PLX, em pontos de tempo indicados, as células foram incubadas com iodeto de propídio e avaliada para a indução da morte celular por imagem baseada em citometria. (B) Experiências semelhantes foram realizadas em células humanas de cancro do cólon (HT-29) e células epiteliais do cólon normal (NCM460). A microscopia de fluorescência foi utilizada para avaliar a indução de morte celular, caracterizada pela presença de células positivas iodeto de propídio. As imagens foram tiradas a 400 x de ampliação num microscópio de fluorescência. Barra de escala = 15 uM.
citometria Baseado-A imagem foi usada para quantificar a indução de apoptose (% Anexina V positiva), seguido por necrose (% de PI positivo) em E6-1 e células HT-29 na sequência tratamento PLX. A falta de anexina V ou coloração de PI foi utilizada como uma indicação de células vivas após o tratamento (% anexina V /PI células negativas) (* P 0,05, ** P 0,003, *** P 0,0001). (E) Para confirmar ainda mais a indução de apoptose.
fragmentação de ADN é uma função bioquímica chave da apoptose. Para confirmar ainda mais esta indução da apoptose, rotulagem de TUNEL para detectar a fragmentação do DNA foi utilizada. Quantificação resultados de imagem baseada em citometria de mostrar a eficácia de PLX na indução de apoptose, a seguir a fragmentação do ADN em células HT-29 do cancro do cólon de uma forma dependente do tempo. VP16, um agente quimioterapêutico conhecido com capacidades de ADN prejudiciais, foi utilizado como controlo positivo (Figura 4).
rotulagem TUNEL foi utilizado para detectar a fragmentação do ADN. Seguindo PLX e VP16 (como um controlo positivo para danos de DNA) de tratamento, as células foram marcadas com solução de coloração de ADN e quantificado por citometria baseada em imagem. As células tratadas foram comparados com a amostra de células não tratadas de controlo. (**** P 0,0001).
Para além disso, a indução de apoptose em várias células de cancro, melanoma (G-361), as células, do ovário e cancro do cólon (HT-29), foi confirmada por Anexina -V ensaio de ligação. Esta indução de apoptose foi confirmada como sendo selectivos para células cancerosas, como células normais de cólon (NCM460) não foi afectada pelo tratamento PLX. Isto foi indicado por condensação nuclear, morfologia das células e a externalização de fosfatidilserina para o folheto exterior da membrana celular, tal como indicado por coloração Hoechst, imagens de contraste de fase e de ligação de corante de anexina V, respectivamente (Figura 5A e B). A selectividade de PLX para as células cancerosas foi ainda confirmado pelo ensaio de viabilidade celular WST-1 que mostrou que o PLX foi altamente eficaz em doses tão baixas, uma janela terapêutica foi facilmente observado (Figura 5C). Tratamento de HT-29 com 0,20 mg /ml de forma eficaz a viabilidade reduzida em cerca de 90%, enquanto que as células NCM460 manteve-se em 100% de viabilidade com a mesma dose. Isto indica que o PLX podem ser mais eficazes em doses muito baixas, reduzindo ainda mais as possibilidades de toxicidade associada com o tratamento
Subsequente ao tratamento com PLX, células (ovário;. OVCAR-3, melanoma; G-361 e Normal células de cólon epitélios (NCM460) foram coradas com Hoechst para caracterizar a morfologia nuclear e anexina-V para detectar células apoptóticas (a) e a morfologia celular por microscopia de contraste de fase (B);. As imagens foram tiradas a 400 x de ampliação num microscópio de fluorescência barra de escala = 15 uM. a seguir ao tratamento PLX (C), HT-29, células de cancro colo-rectal e células NCM460 não-cancerosas foram incubadas com corante de viabilidade de WST-1 de células durante 4 horas e a absorvância foi lida a 450 nm e expressa como uma percentagem do controlo . Os valores são expressos como média ± SD de 3 ensaios independentes ** P .. 0,0001
PLX Induz Caspase-Independent apoptose em células cancerosas humanas
As caspases são cisteína proteases aspárticas que desempenham um papel predominante como proteases de morte [17]. os seus papéis em diversos processos de morte celular permanece controverso, como a sua activação ou inibição pode ser essencial para a progressão da inibição das vias de morte celular [18], [19]. Para avaliar o papel das caspases no nosso estudo, após o tratamento com 0,10 mg /ml PLX, em pontos de tempo indicados, as células BxPC-3 foram recolhidos, lavados e incubados com tampão de lise para obter lisado celular. O lisado celular foi incubado com os substratos de caspases, específicas para cada caspase (3, 8 e 9) e incubadas durante uma hora. As leituras de fluorescência foram obtidas utilizando um espectrofluorómetro. Os nossos resultados indicam que o PLX é capaz de activar ambas as vias (extrínsecas e intrínsecas) de apoptose de um modo dependente do tempo. Isto foi observado como a activação rápida de caspases-3, 8 e 9 foram observadas tão cedo quanto uma hora, após o tratamento (Figura 6A)
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Após o tratamento com 0,10 mg /ml PLX, em pontos de tempo indicados, BxPC -3 células foram recolhidos, lavados e incubados com tampão de lise para obter lisado celular.