Abstract

pâncreas adenocarcinoma ductal é caracterizada por extensa invasão local do tumor, metástase e disseminação sistêmica precoce. A grande maioria de câncer pancreático (PACA) pacientes já têm complicações metastática no momento do diagnóstico, ea taxa de mortalidade deste tipo letal de câncer tem aumentado nas últimas décadas. Assim, os esforços para identificar novos molecularmente direcionados terapias são prioridades. Estudos recentes têm sugerido que a serotonina (5-HT) contribui para o crescimento do tumor numa variedade de cancros, incluindo próstata, cólon, bexiga e cancro do fígado. No entanto, há falta de evidências sobre o impacto dos receptores 5-HT na promoção de câncer pancreático. Tendo em consideração o papel dos receptores 5-HT-1, especialmente 5-HT

1B e 5-HT

subtipos 1D em diferentes tipos de tumores malignos, o objetivo deste estudo foi investigar o papel da 5-HT

1B e 5-HT

1D no crescimento PACA e de progressão e analisar o seu potencial como alvos citotóxicos. Descobrimos que knockdown de 5-HT

1B e 5-HT

1D expressão dos receptores, usando pequeno RNA interferente específico (siRNA), inibição significativa da proliferação induzida e clonogenicidade de células de PACA. Além disso, ele suprimiu significativamente paca células invasão e reduziu a actividade de uPAR /MMP-2 e sinalização /sinalização Src /Fak mediada por integrina, como vias de células tumorais integrais associadas com a invasão, migração, adesão e proliferação. Além disso, visando 5-HT

1B e 5-HT

1D down-regula ZEB1 dedo de zinco e proteínas do caracol, os fatores principais características de transcrição que regulam a transição epitelial-mesenquimal (EMT), concomitantemente com up-regulação da claudin- 1 e e-caderina. Em conclusão, os nossos dados sugerem que o 5-HT

1B- e 5-HT

sinalização mediada pelo 1D desempenhar um papel importante na regulação do fenótipo invasivo e proliferativa da paca. Ele também destaca o potencial terapêutico da segmentação de 5-HT

receptores 1B /1D no tratamento da paca, e abre um novo caminho para a identificação de biomarcadores e valiosos novos alvos terapêuticos para o gerenciamento de câncer pancreático.

citação: Gurbuz N, Ashour AA, Alpay SN, Ozpolat B (2014) Down-Regulamento de 5-HT

1B e 5-HT

1D Receptores inibe a proliferação, clonogenicidade e invasão das células do cancro do pâncreas humano. PLoS ONE 9 (8): e105245. doi: 10.1371 /journal.pone.0105245

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 13 Março, 2014; Aceito: 21 de julho de 2014; Publicação: 29 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Gurbuz et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Texas Center for Cancer Nanomedicine (TCCN), do National Cancer Institute (NCI) Centro de Nanotecnologia (454CA151668), e por siRNA Centro do projeto, MD Anderson Cancer Center, UT, Houston, Texas, EUA. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas (PACA), que tem uma forte capacidade invasiva com metástases frequentes e recorrência, é conhecido por ser um dos cancros humanos mais letais com 5% de taxa de sobrevida em 5 anos [1]. Embora só ocupa o décimo na incidência entre os cânceres humanos mais comuns, a paca é a quarta principal causa de mortes por câncer nos países ocidentais e sua taxa de mortalidade não tem diminuído ao longo das últimas décadas [2], [3]. No geral, a paca tem mortalidade de cerca de 100% porque é geralmente detectado em estágios avançados, uma vez que normalmente não causam quaisquer sintomas em estágios anteriores [4]. PaCa é intrinsecamente resistente à apoptose e mal responde a agentes terapêuticos existentes, incluindo regimes quimioterapêuticos de combinação [5]. Para superar este problema de saúde global, as investigações estão focadas na identificação de novos alvos moleculares para desenvolver novas estratégias de tratamento.

O neurotransmissor mitogênica, a serotonina (5-HT) foi previamente conhecido por atua como um fator de crescimento [ ,,,0],6] para vários tipos de células não tumorais (por exemplo, células do músculo vascular liso, fibroblastos de pulmão e células mesangiais renais) [7], [8], e as células de tumor (por exemplo, células carcinóides pancreáticas, células de carcinoma de células pequenas do pulmão e carcinoma colorrectal) [9], [10], [11]. Recentemente, o 5-HT tem emergido como uma importante regulador da proliferação celular e o crescimento do tumor numa variedade de tipos de cancro [12], [13], [14], [15]. Durante a progressão tumoral, a tirosina hidroxilase, a enzima limitante da velocidade na via de biossíntese de serotonina, é muitas vezes supra-regulados [16]. Mais importante, os receptores 5-HT diferentes foram identificados (5-HT 1-7) com base nas suas características estruturais, funcionais e farmacológicas [17], [18]. Seis das famílias de receptores de 5-HT são G-protein-coupled, incluindo Gi: 5-HT-1, GS: 5-HT-4,6,7, e Gq /11: 5-HT-2,5. Apenas 5-HT-3 é exclusivamente um canal de catião dependentes de ligandos, relacionadas com o receptor de acetilcolina nicotínico [16]. Os receptores 5-HT são ainda divididas em subtipos diferentes, e.g. 5-HT 1-família tem cinco subtipos [18], que compreende o 5-HT-1A, 1B, 1-D, e -1E -1F receptores e casais preferencialmente a Gi /o para inibir a formação de cAMP [19], [20 ]. Em particular, o ser humano 5-HT

1B e 5-HT

1D são especialmente semelhantes na sequência apesar de ser codificada por dois genes distintos. A função precisa destes receptores permanece indefinida, eo progresso em direção a esse tem sido dificultada pela falta de ligantes seletivos [21]. anteriormente foi indicado que os receptores 5-HT-1 são amplamente expresso no cancro da mama humano [22], o cancro da próstata [23] e células de cancro da bexiga [18], o que pode explicar os efeitos mitogénicos dos agonistas destes receptor in tais cancros. pesquisa sobre o câncer pancreático tem mais focado no estudo de mutações de genes e vias de transdução de sinal em adenocarcinoma ductal pancreático células (PDAC), ao passo que o papel potencial dos receptores de neurotransmissores no desenvolvimento e na progressão da doença neoplásica letal tem sido largamente ignorado [4]. Dado o envolvimento potencial de 5-HT-1 de receptores de sinalização para a proliferação de vários tipos de cancros, com implicações desconhecidos destes receptores na progressão PaCa, nós investigamos aqui o papel do 5-HT

1B e 5-HT

1D na proliferação e o fenótipo invasivo de PACA.

invasão local pode ser considerada como um passo inicial e essencial na malignidade de carcinomas, que conduz à geração de metástases distantes geralmente fatal. Para as células de cancro para invadir tecidos distantes, eles têm que penetrar circundante matrizes extracelulares. Tais interacções célula cancerosa /ECM são facilitadas pela família das integrinas de moléculas de adesão celular, incluindo substratos de tirosina-fosforilada (a tirosina-quinase Src e quinase de adesão focal) [24]. As integrinas são trans-membranosas a /p receptores heterodiméricos que medeiam as interacções célula-célula e a ligação de células à matriz extracelular (ECM) [25], e que servem como receptores para algumas proteínas de ECM (por exemplo, fibronectina, vitronectina, laminina e colagénio) [ ,,,0],26]. actividade alterada de integrina ou afinidade para o substrato pode contribuir para o fenótipo neoplásico. Normalmente, Src celular é realizada em um estado inativo, mas em vários tipos de cancro, eventos anormais levar a elevada actividade de quinase da proteína e causar respostas celulares pleiotrópicos induzindo transformação e metástase [27].

Como carcinomas progredir, os tumores podem perder morfologia epitelial e mesenquimal adquirem características que contribuem para o potencial metastático. Um epitelial para mesenquimal (EMT), um processo crítico semelhante ao processo de desenvolvimento embrionário, é pensado para ser um mecanismo importante para promover a invasão e metástase [28] do cancro. Nos últimos anos, a família de factores de transcrição ZEB de dedo de zinco tem sido documentada como agentes essenciais de EMT [29]. A proteína de adesão epitelial, E-caderina, é um supressor activa de invasão e crescimento de muitos cancros epiteliais, e a sua infra-regulação é considerado uma indicação de EMT [30], [31]. E-caderina é um importante gene alvo dos repressores de transcrição da família ZEB. mediadores de indução de EMT, como TCF8, desencadear desdiferenciação do epitélio, ao alterar a expressão /função da caderina-E [32]. Os repressores E-caderina pode regular os programas de transcrição de desenvolvimento da EMT em células tumorais que os predisponham a invasão e metástase [33]. Assim, mutações em genes que codificam ZEB vincular esses fatores para a progressão do tumor maligno [29].

O presente estudo focado em investigar o papel da 5-HT

1B e 5-HT

1D sobre proliferação PACA e invasão. Nossos dados demonstram reduções significativas da paca crescimento células, invasão e correlacionados sinalização a jusante em resposta a infra-regulação destas expressões receptores de serotonina, sugerindo o envolvimento significativo destes receptores na promoção do câncer pancreático.

Materiais e Métodos

linhas celulares, condições de cultura e reagentes

As linhas de células de cancro pancreático humano foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA). células PANC-1 e MiaPaCa-2 foram cultivadas em DMEM /F12 suplementado com FBS a 10%. Todos os meios contêm penicilina e estreptomicina (100 unidades /ml). As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2/95% de ar, e foram usadas entre as passagens 4 e 15. As células humanas do pâncreas conduta epiteliais (HPDE) foram gentilmente cedidas pelo Dr. Kapil Mehta, Departamento de terapêutica experimental, MD Anderson Cancer Center, como um presente generoso. HPDE células foram mantidas em queratinócitos meio isento de soro (de queratinócitos-SFM, 1X) contendo L-glutamina, e suplementado com pré-qualificado humano recombinante Factor de Crescimento Epidérmico 1-53 (1-53 EGF) e 25 mg /500 ml de pituitária de bovino extracto ( BPE) (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA). NF-kB activação inibidor II, JSH-23 (4-Metil-N

1- (3-fenilpropil) benzeno-1,2-diamina) (Merck Billerica, MA), foi dissolvido em DMSO a uma inventário final concentração de 10 mM e adicionado directamente a culturas de células em 25 e 50 uM concentrações, que bloqueia selectivamente translocação nuclear de NF-kB P-65 e a sua actividade de transcrição.

transfecções com ARNsi

exponencialmente o crescimento de células não tratadas PANC-1 e MiaPaCa-2 foram semeadas 24 h antes da transfecção. células plaqueadas foram transfectadas com ARNsi de cadeia dupla como alvo o ARNm dos receptores serotoninérgicos (5-HT-1) ou subtipo -B-D (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ou transf ectadas com o controlo (não-silenciamento) siRNA; (5′-AAUUCUCCGAACGUGUCACGU-3 ‘) [34], [35] (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). siRNA segmentação transglutaminase tecidular (TG2) (Qiagen, Valencia, CA) também foram empregados [35]. As células foram transfectadas com ARNsi, a uma concentração final de 25-50 nM, durante 72 h, utilizando HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. As concentrações de ARNsi foram escolhidos com base em estudos de dose-resposta. As células transfectadas com ARNsi de controlo não-silenciamento foram usadas como controlos negativos. Após o tratamento, as células foram colhidas /processados ​​para análise posterior e ensaios.

A viabilidade celular e ensaios de proliferação /crescimento

A viabilidade e /ou a proliferação de células foram detectados por ensaio de MTS (Promega, Madison, WI, EUA), após o tratamento de células, para medir o crescimento celular. As células foram contadas utilizando um hemocitómetro e as células viáveis ​​foram identificadas por exclusão do azul de tripano. As células viáveis ​​foram semeadas em placas de 96 poços (1,5 × 10

3 células /cavidade), e transfectadas com ARNsi indicados. Depois de 72 h de tratamento, uma solução contendo MTS (3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -5- (3-carboxi-metoxifenil) -2- (4-sulfofenil) -2H-tetrazólio) e PMS ( metossulfato de fenazina) (20:01 v /v) foi adicionado às células. Após 2-3 h de incubação a 37 ° C, as células em crescimento viáveis ​​foram estimados por monitorização da absorção do produto a 490 nm, com base na geração de formazano por células vivas. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e os resultados foram relatados como média da absorção ± desvio padrão.

sobrevivência clonogênica ensaio

Paca células foram semeadas em 6-poços placas (1,5 × 10

3 células /poço), transfectadas com o controlo não-silenciamento ARNsi, ou ARNsi contra 5-HT

1B ou 5-HT

1D (uma vez /semana), e cultivadas durante 2 semanas. Os formados-colónias foram coradas com violeta de cristal e as regiões de distribuição de colônias de área foram medidos densitometricamente [36]. Cada experiência foi efectuada em triplicado e os resultados foram registados como média de absorção ± desvio padrão.

Matrigel invasão ensaio

PaCa células foram transfectadas com 50 nM de ARNsi indicados, e 72 h mais tarde, igual número de células viáveis ​​tratadas (4 × 10

4 células), foram semeadas em Transwells Matrigel-revestidas (com 8- filtros uM de tamanho de poro) em câmaras de invasão de Matrigel (BD Biosciences, San Jose, CA). O número de células que invadiram o lado inferior da membrana após 24 horas foi determinada por contagem de células num mínimo de quatro áreas seleccionadas aleatoriamente. Os experimentos foram realizados em triplicado e os resultados foram relatados como média das percentagens de invasão ± desvio padrão.

Migration Assay

In-vitro

foi usado ensaio de cicatrização para avaliar a motilidade celular e a capacidade para migrar. células PANC-1 foram plaqueadas em placas de 6 poços (5 x 10

5 células /poço) e cultivadas em meio contendo FBS a 10% para atingir uma monocamada de células quase confluentes. Um zero foi então cuidadosamente feita sobre a camada de células utilizando uma mistura 10 mL estéril ponta da micropipeta, e quaisquer detritos celulares foram removidos por lavagem com PBS para remover as células flutuantes. As monocamadas foram, em seguida, feridas transfectadas com 50 nM de ARNsi indicados. Imediatamente após os tratamentos, as células foram fotografadas usando um microscópio de contraste de fase (Nikon), para determinar a largura da ferida no tempo 0. As culturas foram continuadas, e as células foram novamente fotografadas após 12 h e 24 h depois da ferindo a célula camada. A cicatrização de feridas foi visualizado por comparação de fotografias tiradas a 0 h, com as tomadas em 12 h e 24 h mais tarde e analisaram-se para a distância migrada pelo bordo de ataque da ferida em cada ponto de tempo. A distância percorrida pelas células foi determinada através da medição da largura da ferida em tempo de 12 h e 24 h, e subtraindo-a da largura da ferida ao tempo 0. Os valores obtidos foram, então, expresso como% de migração, definindo a largura do intervalo h a 0 como 100%. Três experimentos foram realizados em triplicado.

Western blot análise

As células foram semeadas em 25 cm

2 frascos de cultura (0,5 × 10

6 células /frasco). Após os tratamentos, as células foram recolhidas, centrifugadas, lavadas duas vezes em PBS gelado e lisados ​​de células completas foram obtidas por suspensão das células num tampão de lise a 4 ° C. Os lisados ​​foram centrifugados a 13.000 g durante 10 min a 4 ° C, e as fracções de sobrenadante foram recolhidos. A concentração total de proteína em cada amostra foi determinado por um kit de ensaio de proteína compatível detergente (Bio-Rad, Hercules, CA), e transferência de Western foi realizada como se 40 ug de proteína /pista em gel de SDS-PAGE a 4-15%. As proteínas foram transferidas para membranas de PVDF-electro e foram primeiro incubadas com os anticorpos primários seguintes; p-Src (Tyr-416), Src, integrina β1, uPAR, MMP-2, caracol, TCF8 /ZEB1, NF-kB (P-105 /P-50), e Claudina-1 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA); p-FAK (Tyr-397), FAK (BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ); 5-HT

1B (Sigma Chemical, St. Louis, MO); TG2 e α-SMA (Abcam, Cambridge, MA); Fibronectina e 5-HT

1D (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), e depois com peroxidase de rábano conjugado com anti-coelho ou anti-anticorpo secundário de murganho (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). β-actina (Sigma Chemical, St. Louis, MO), ou α-β-tubulina (Cell Signaling Technology, Danvers, MA) foram usados ​​como controlos de carga. Todos os anticorpos foram diluídos em TBS-Tween 20 contendo 5% de leite seco. detecção quimioluminescente foi realizada com reagentes de detecção Chemi-brilho (Alpha Innotech, San Leandro, CA), e as manchas foram visualizadas com um gerador de imagens FluorChem 8900, e quantificados por um densitómetro utilizando o programa de análise de imagem (software de processamento de ImageJ 1.48s, National Institutes de Saúde, Bethesda, MD, EUA). Todos os experimentos foram independentemente repetidas pelo menos duas vezes.

matrizes de proteína de fase reversa (RPPA)

As células PANC-1 transfectadas com siRNA (0,5 × 10

6 células /2 ml de mídia) foram semeadas em placas de 6 poços. Após 72 h de incubação, as células foram lavadas duas vezes com PBS, e 150 uL do tampão de lise [1% de Triton X-100, 50 mM de Hepes (pH 7,4), NaCl 150 mM, MgCl 1,5 mM

2, 1 mM de EGTA , NaF 100 mM, sod a 10 mM. pirofosfato, 1 mM de Na

3VO

4 e 10% de glicerol, contendo inibidores da proteinase e da fosfatase (Roche Applied Science, Indianapolis)] foram adicionados a cada poço. Os lisados ​​de células foram recolhidos, e RPPA foi processado tal como descrito anteriormente [35].

Isolamento de ARN e inverter reacção em cadeia com transcriptase-polimerase (RT-PCR), análise

O ARN total foi isolado a partir da células recolhidas com Reagente TRIzol (Invitrogen /Life Technologies, Carlsbad, CA) e o ADNc foi obtido a partir de 1 ug de ARN total utilizando o kit RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Thermo Scientific). O ADNc para o 5-HT

1B, 5-HT

1D, integrina β1, TG2 e GAPDH foram amplificadas utilizando o kit Platinum Taq ADN polimerase (Invitrogen /Life Technologies), com os iniciadores específicos. Resumidamente, 2 mL do total de 20 uL de produto transcrito reversamente foram usadas para PCR em 1 × tampão de PCR contendo 1,5 mM MgCl

2, 200 trifosfatos uM de desoxinucleótidos (dNTPs), 1 unidade de Taq Platinum polimerase e 0,2 uM de cada um dos iniciadores indicados (tecnologias de ADN integradas, IDT), ou primers específicos de GAPDH (Thermo Scientific). As sequências de sentido e anti-sentido 5-HT

1B iniciadores são 5′-TGCTGGTTATGCTATTGGCG-3 ‘; e 5’-GATGACACAGAGGTGCAGGATG-3 ‘, respectivamente. As sequências de sentido e anti-sentido 5-HT

primers 1D são 5′-TGCCGTGGTCCTTTCCGTC-3 ‘; e 5’-GGTGATGGTATAGGCGATGCTG-3 ‘, respectivamente. As sequências de sentido e anti-sentido b1 primers integrina são 5’-CCTACTTCTGCACGATGTGATG-3 ‘; e 5’-CCTTTGCTACGGTTGGTTACATT-3 ‘, respectivamente. As sequências do sentido e anti-sentido primers TG2 são 5’-TAAGAGATGCTGTGGAGGAG-3 ‘; e 5’-CGAGCCCTGGTAGATAAA-3 ‘, respectivamente. As amostras de cDNA foram incubadas a 94 ° C (2-5 min.) Para desnaturar o molde e activar a enzima. Este passo foi seguido por 35 ciclos de amplificação por PCR (como 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 60 s com 5-HT

1B iniciador; 94 ° C durante 30 s, 60 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 60 s com TG2 iniciador; 94 ° C durante 30 s, 58 ° C durante 45 s e 72 ° C durante 60 s com 5-HT

1D e b1 integrina iniciadores, em cada ciclo). A reacção de PCR foi terminada com um passo final de extensão de 5 min. a 72 ° C. Os produtos de reacção amplificados foram analisados ​​num gel de agarose a 1,2% contendo brometo de etídio. A síntese de cDNA foi verificada por detecção do transcrito de GAPDH, que foi utilizado como um controlo interno.

A análise estatística

Os dados foram expressos como a média ± DP de três experiências independentes, e estatística a análise foi realizada por meio de Student

t

-teste, para determinar a significância estatística. Os valores de P inferiores a 0,05 foram considerados estatisticamente significativos e são indicados por um asterisco.

Resultados

5-HT

1B e 5-HT

1D são sobre-expressos em câncer de pâncreas células

Aumento da capacidade biossintética 5-hidroxitriptamina, bem como alterações graves nos padrões dos receptores 5-HT de expressão, foi relatado anteriormente durante a progressão do câncer de mama [16]. Aqui, avaliou-se a expressão da 5-HT

1B e 5-HT

1D receptores em células paca diferentes, bem como em células normais epiteliais do ducto pancreático humano (HPDE). Verificou-se que estes receptores são regulados positivamente em todas as células paca testados, em comparação com a sua expressão baixa em condições normais epitélio pancreático (Fig. 1A), sugerindo que a dis-regulação destes receptores poderia promover a sinalização progressão tumoral favor em células PACA.

(a) 5-HT

1B e 5-HT

1D são altamente expressa em várias linhas de células do cancro do pâncreas. Os lisados ​​de células de várias linhas celulares PACA e as células normais epiteliais do ducto pancreático humano (HPDE) foram sujeitos a análise de Western blot, conforme indicado. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. (B-C) 5-HT

1B e 5-HT

1D receptores níveis de expressão em PANC-1 (B) e células de MiaPaCa-2 (C), após o knockdown da expressão dos receptores com os seus correspondentes ARNsi. As células foram transfectadas com 50 nM de ARNsi indicados, e 72 h mais tarde, lisados ​​de células foram submetidas a análise de mancha de Western. p-actina foi utilizado como controlo de carga. Os histogramas mostram a quantificação relativa dos níveis de proteínas indicadas. (D-E) a expressão de ARNm de 5-HT

1B e 5-HT

1D em PANC-1 (D) e células MiaPaCa-2 (e) após o knockdown da expressão dos receptores com os seus siRNAs correspondentes. As células foram transfectadas com 50 nM de ARNsi indicados, e 72 h mais tarde, o ARN total foi extraído e os níveis de transcrição de 5-HT

1B e 5-HT

1D foram determinadas pelo padrão de RT-PCR como descrito em Materiais e métodos. GAPDH foi usada como controlo de carga. (F-G) siRNA mediada por 5-HT

1B e 5-HT

1D knockdown inibe a proliferação de células de PACA. PANC-1 (F) e células MiaPaCa-2 (G) foram transfectadas com 50 nM de ARNsi indicados, e, após 72 h, a proliferação foi detectada por um ensaio de MTS. Os dados são representados como média ± DP. * P 0,05 versus as células de controlo. Todos os experimentos foram realizados de forma independente por três vezes.

Knockdown de 5-HT

1B e 5-HT

1D expressão dos receptores inibe a proliferação /viabilidade das células Paca

teve como objetivo investigar a participação desses receptores na proliferação e crescimento das células paca. Para este fim, nós derrubado a expressão de cada subtipo de receptor na PANC-1 e células MiaPaCa-2, utilizando pequeno RNA específica interferência (siRNA). Apesar de ser codificada por dois genes distintos, o ser humano 5-HT

1B e 5-HT

1D são especialmente semelhantes na sequência [21]. Por conseguinte, como mostrado na Figura 1B e C, 5-HT

tratamentos 1B siRNA levou a uma expressão relativamente mais baixa de nível

proteína 1D 5-HT, com um

os níveis de proteína 1B semelhantes inferiores de 5-HT induzido por 5-HT

1D siRNA. Isto poderia ser atribuído ao facto de tanto a 5-HT

1B e 5-HT

1D subtipos partilham uma identidade de sequcia de alta amino (~68% de homologia de sequência de aminoácidos), têm propriedades de ligação ao ligando e semelhantes são farmacologicamente quase indistinguíveis [37]. interacções induzidas Tais semelhanças entre os dois tipos de receptores ao nível da proteína poderia ter ocorrido após a expressão do gene (por exemplo, durante a maturação de proteínas ou dobragem). Portanto, a detecção da expressão da proteína receptores por Western blot não era completamente suficiente para distinguir esses subtipos de receptores estreitamente relacionados-estabelecer a sua respectiva relevância fisiológica. Para superar tais problemas, a fim de investigar os efeitos biológicos de segmentação cada subtipo individualmente, utilizou-se análise de RT-PCR e examinaram o efeito de tratamentos de ARNip sobre os níveis de transcrição do gene correspondente subtipo. Os nossos resultados mostram claramente que a 5-HT

1B siRNA específico e 5-HT

1D siARN específicas foram confirmadas para inibir a expressão do mRNA correspondente, sem qualquer efeito significativo sobre o outro subtipo transversal análogo em ambos PANC-1 e linhas celulares de MiaPaCa-2 (Fig. 1D e e). A seguir, analisadas a proliferação após 72 h de tratamento siRNA por ensaio MTS. Como mostrado na Figura 1F e G, os nossos resultados demonstraram que o knockdown de 5-HT

1B e 5-HT

1D expressão inibiu significativamente a proliferação de ambas as células PANC-1 e MiaPaCa-2. O combinado sub-regulação de ambas a 5-HT

1B e 5-HT

subtipos 1D prejudica a proliferação mais do que a sub-regulação de sozinha qualquer um dos receptores (Figura S1), sugerindo que os benefícios biológicos fornecidos a partir simultânea segmentação ambos os receptores.

Segmentação 5-HT

1B e 5-HT

1D inibe clonogenicidade celular de células Paca

Para verificar o papel da 5-HT-1 serotonérgicos-receptores em PaCa proliferação celular e formação de colónias, foi avaliada a capacidade de clonogênica de células Paca seguinte knock-down de 5-HT

1B e 5-HT

1D expressão dos receptores. Este ensaio é um

In-vitro

ensaio de sobrevivência de células com base na capacidade de uma única célula crescer e formar focos em colónia [36]. Knockdown de 5-HT

1B e 5-HT

1D, utilizando os siRNAs específicos, inibe marcadamente a capacidade de PANC-1 e células MiaPaCa-2 para formar colónias (Fig. 2A e B, respectivamente). No geral, estes resultados sugerem que o 5-HT

1B- e 5-HT

sinalização mediada pelo 1D está envolvida na proliferação e capacidade de células clonogénicas PACA.

PANC-1 (A) e células MiaPaCa-2 (B) foram transfectadas (uma vez /semana) com ARNsi indicados. As células foram incubadas durante 14 dias, as colónias foram coradas com violeta de cristal e as regiões de distribuição colónias da área foram medidos densitometricamente no final dos 14 dias. Os histogramas mostram as percentagens das colônias formadas, após 14 dias da primeira transfecção. Os dados são expressos como média das percentagens de formação de colónias ± desvio padrão de três experiências independentes. * P . 0,05 vs. células controle

Segmentação 5-HT

1B e 5-HT

1D prejudica a invasão de células /migração de células Paca

pâncreas adenocarcinoma ductal é caracterizada pelo fenótipo altamente invasivo e metastático forte capacidade [38]. Uma vez que a expressão da 5-HT

1B e 5-HT

1D é elevada em células de Paca, avaliou-se a estes receptores estão envolvidos na promoção dessa fenótipo invasivo. Portanto, nós derrubado esses receptores em PANC-1 e MiaPaCa-2 células por siRNAs e avaliadas as mudanças em sua capacidade invasiva por

in-vitro

ensaio de invasão usando câmaras de Boyden Matrigel-revestidas. Este ensaio imita o

in-vivo

processo de invasão e mede o número de células de câncer que passam por uma matriz de membrana basal em direção meios contendo quimio-atrativos [39]. A descoberta mais surpreendente foi a de que knockdown de 5-HT

1B e 5-HT

1D reduziu significativamente a invasão de células PANC-1 em cerca de 76% e 66%, respectivamente (Fig. 3A), e reduzida a invasão de células de MiaPaCa-2 em cerca de 75% e 71%, respectivamente (Fig. 3B). A seguir, examinado o envolvimento de 5-HT

1B e 5-HT

1D em mediar a motilidade celular PANC-1 utilizando o ensaio de zero a 12 h e 24 h de tempo de pontos. A análise revelou que a distância percorrida pelas células que migram foi significativamente reduzida quando as células transfectadas com 5-HT

1B ou 5-HT

1D ARNic em comparação com as células expostas à testemunha não-silenciamento siRNA (Fig. 3C ). Estes resultados demonstram uma correlação entre o comportamento motilidade celular PACA e 5-HT

1B expressão /1D. No geral, estes dados indicam que a 5-HT

1B e 5-HT

1D receptores desempenham um papel na mediação PaCa células migração e invasão.

células PANC-1 (A) e MiaPaCa-2 células (B) foram transfectadas com 50 nM de ARNsi indicados (por 72 h), e um número igual de células viáveis ​​foram cultivadas em filtros Transwell revestidas com Matrigel em câmaras de invasão de Matrigel. O número de células que invadiram após 24 h foi determinada como no protocolo. Ampliação, 100 ×. Os histogramas mostram a média das percentagens de invasão ± DP de três experiências. * P 0,05 versus as células de controlo. (C) O envolvimento de 5-HT

1B e 5-HT

1D na regulação da motilidade celular PANC-1, tal como analisada pelo ensaio de cicatrização da ferida. Um único zero foi feito no centro da monocamada de células confluentes, e as monocamadas foram feridas transfectadas com ARNsi indicados. O reparo de feridas foi monitorado durante 24 h e visualizados microscopicamente com ampliação original × 100. As imagens foram tiradas imediatamente (0 h), e após 12 h e 24 h de riscar as culturas. O histograma mostra as percentagens da migração de células, e os dados são expressos como média da percentagem de migração ± DP de três experiências independentes. * Representa diferença significativa entre os grupos indicados (P 0,05).

5-HT

1B e 5-HT

1D estão envolvidos na regulação da β1 integrina expressão em células Paca

Depois de encontrar que o 5-HT

1B e 5-HT

1D são sobre-expressos em células Paca, sugestivo de alterações significativas no crescimento de promoção da sinalização a jusante, o próximo investigou alguns efeitos moleculares jusante de knockdown destes receptores. A família da integrina dos receptores de trans-membrana liga da matriz extracelular (ECM) para o citoesqueleto de actina intracelular em pontos de interacção adesões focais. Em adição a este papel estrutural, integrina agrupamento pode iniciar sinalização intracelulares eventos que promovem a proliferação celular, migração e sobrevivência em ambos os contextos de células normais e tumorigénicas [40]. Da família integrina, β1-subtipo é conhecida por induzir Src e actividade FAK através do recrutamento e ativação de Src /FAK dupla complexo quinase [41]. Porque, para baixo-regulação de 5-HT

receptores 1B /1D suprime células Paca migração /invasão (Fig. 3), examinamos se esses receptores regulam a expressão de integrina β1. Utilizou-se transferência de Western e análise de RT-PCR para determinar a expressão da proteína de integrina β1 e os níveis de ARNm, respectivamente, após o silenciamento estes receptores. Verificou-se que 5-HT

1B e 5-HT

1D knockdown induzem significativamente a infra-regulação da expressão de integrina β1 em ambas as proteínas e o nível de ARNm em ambas as células PANC-1 e MiaPaCa-2 (Fig. 4A e B).

(A-B) O efeito de siRNAs mediada por 5-HT

1B e 5-HT

1D para baixo-regulação em β1 integrina /sinalização a jusante mediada por ECM em PANC -1 (A) e MiaPaCa-2 células (B). (Painel superior) As células foram transfectadas com 50 nM de ARNsi indicados, e, após 72 h, o ARN total foi extraído e os níveis de transcrição de 5-HT

1B e 5-HT

1D foram determinados por RT-padrão PCR como descrito em Materiais e Métodos. GAPDH foi usada como controlo de carga. (Painel inferior) As células foram transfectadas com 50 nM de ARNsi indicados, e, após 72 h, os lisados ​​celulares foram sujeitos a análise de Western blot. p-actina foi utilizado como controlo de carga. (C-D) O efeito do 5-HT

1B e 5-HT

1D infra-regulação no processo de EMT em PANC-1 (C) e as células MiaPaCa-2 (D). p-actina foi utilizado como controlo de carga. Tubulina foi utilizada como controlo de carga.