Abstract
fundo e Aponte
O cálcio tem sido proposta como um mediador da quimioprevenção do câncer colorretal (CRC), mas o mecanismo abrangente subjacente a este efeito preventivo ainda não está clara. Por isso, realizamos este estudo para avaliar os possíveis papéis e mecanismos de prevenção mediada por cálcio de CRC induzida por 1,2-dimetil-hidrazina (DMH) em camundongos.
Métodos
Para análise da expressão gênica , 6 não tumorais tecidos colorrectais de ratinhos do lado + grupo de cálcio DMH e 3 amostras de cada um dos grupos de DMH e de controlo foram hibridados com um 4 × 44 K Agilent todo genoma oligo microarray, e genes seleccionados foram validados por em cadeia da polimerase em tempo real reacção (PCR). A análise funcional dos dados foi realizada utilizando microarrays KEGG e Gene ontologia (GO) analisa. genes Hub foram identificados utilizando software Caminho Studio.
Resultados
As taxas de incidência de tumores no DMH e + de grupos de cálcio DMH foram de 90% e 40%, respectivamente. microarrays análise de expressão gênica mostrou que
S100A9
,
Defa20
,
Mmp10
,
MMP7
,
Ptgs2
, e
Ang2
estavam entre os genes mais reprimidos, enquanto que
Per3
,
Tef
,
Rnf152
, e
Prdx6
foram significativamente upregulated na DMH + grupo de cálcio em comparação com o grupo de DMH. Análise funcional mostrou que as Wnt, do ciclo celular, e as vias do ácido araquidónico foram significativamente regulada negativamente no grupo + cálcio DMH, e que os termos GO relacionadas com a diferenciação celular, o ciclo celular, a proliferação, a morte celular, a adesão e a migração de células foram significativamente afectados .
caixa de forkhead M1
(
FoxM1
) e
fator nuclear kappa-B
(
NF-kB) foram considerados como genes hub potentes.
Conclusão
no modelo de rato CRC-induzida DMH, mecanismos abrangentes estavam envolvidos com complexas alterações de expressão de genes que engloba muitos caminhos alterados e GO termos. No entanto, como cálcio regula estes acontecimentos continua a ser estudada
citação:. Wang J-L, Lin Y-W, Chen H-H, X Kong, H Xiong, Shen N, et al. (2011) Cálcio Impede Tumorigênese em um modelo do rato do cancro colorectal. PLoS ONE 6 (8): e22566. doi: 10.1371 /journal.pone.0022566
editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Estados Unidos da América
Recebido: 13 de novembro de 2010; Aceito: 29 de junho de 2011; Publicação: 17 de agosto de 2011
Direitos de autor: © 2011 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Ministério da Saúde Pública, China (No. 200.802.094), uma bolsa da National Science Encontrado da China (30.830.055) para Jing-Yuan fang; e uma bolsa da National Science Foundation Natural da China (n: 30900757) para Hua Xiong. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
A incidência atual de câncer colorretal (CRC) é alta, e seu prognóstico permanece pobre [1]; portanto, é importante elaborar estratégias para prevenir o desenvolvimento de CRC. Muitos agentes são usados para prevenir CRC [2]; No entanto, não há nenhuma consistência nos efeitos em agentes [3], [4], [5], e alguns agentes podem conduzir a efeitos colaterais graves [6], [7]. Assim, uma abordagem alternativa é necessário para a prevenção da CRC.
Uma avaliação sistémica recente revelou que o cálcio pode ser mais atractiva para a prevenção de CRC em comparação com a aspirina e rastreio [8]. No entanto, a eficácia de cálcio é ainda incerto. resultados combinados de 10 estudos de coorte revelou uma relação inversa entre a ingestão de cálcio e risco CRC [9], mas essa relação não foi confirmada por um ensaio clínico controlado randomizado [10]. No entanto, devido às limitações do ensaio clínico aleatório (ECA), por exemplo, baixa dose de cálcio, curto período de follow-up, e influência da ingestão de estrogênio [11], a conclusão do RCT não era convincente. No entanto, a eficácia de cálcio na prevenção do CRC permanece controverso [12].
De modo semelhante, o mecanismo de prevenção mediada por cálcio de CRC não é ainda claro. Em estudos anteriores, o cálcio foi pensado para reduzir o risco de CRC por ligação a ácidos biliares secundários tóxicos e formar sabões insolúveis no lúmen do cólon [13], ou por redução da proliferação, estimular a diferenciação, e indução de apoptose na mucosa do cólon [ ,,,0],14], [15]. Um estudo recente sugeriu que o cálcio pode revogar hiperplasia no cólon distai através da inibição de um receptor do canal de cálcio, isto é, o receptor transiente potencial canal, V subfamília, membro 6 (TRPV6) [16]. Estes resultados indicam que o cálcio pode reduzir o risco de CRC através de uma variedade de mecanismos, mas o mecanismo específico e abrangente ainda não é clara. Portanto, realizamos este estudo para avaliar os possíveis papéis e mecanismos de prevenção mediada por cálcio de CRC induzida por 1,2-dimetil-hidrazina (DMH) em camundongos. Acreditamos que nossos resultados irão contribuir para a pesquisa sobre a aplicação clínica de cálcio.
Materiais e Métodos
Ética Declaração
O nosso estudo foi aprovado pelo Animal Care e Uso Comissão da Shanghai Jiao Tong University School of Medicine Renji Hospital, Shanghai, China. Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes elaboradas pelo Conselho China on Animal Care e o protocolo aprovado pela Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Hospital Renji, Shanghai, China.
Chemicals
DMH foi obtido a partir de Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO, EUA). alimentação de cálcio normal e alta para os ratos foram obtidos a partir de Xangai SLAC Animais de Laboratório Company (Xangai, China). Os principais componentes do alimento normal e elevado teor em cálcio foram as mesmas: proteína, 22,1%; de gordura, 5,28%; cinzas, 5,2%; de fibra, 4,12%; extrato, 52% livre de azoto; fósforo, 0,92%; e vitamina D3 6818,4 UI /kg. A concentração de cálcio (sob a forma de carbonato de cálcio) na alimentação normal e elevado teor em cálcio foi de 1,24% e 3,0%, respectivamente. A alimentação de elevado teor em cálcio foi ajustado por adição de carbonato de cálcio para se obter um teor de cálcio final de 3%. Porque eu penso que a eficácia controversa da dieta rica em cálcio na prevenção de CRC pode ser parcialmente devido à pequena dose de cálcio em estudos anteriores, por isso, decidimos usar alto teor de cálcio para testar o efeito preventivo exata do CRC e tolerância dos ratos .
animais experimentais
No total, 80 SLAC feminino: ratos ICR [peso, 18-20 g; grau, livre de patógenos específicos (SPF)] foram adquiridos a partir da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China). Eles foram mantidos à temperatura ambiente (22 ° C) com uma humidade relativa de 60% e de 12 horas de ciclos de luz /escuro; eles foram fornecidos uma dieta padrão de laboratório e água potável. Os ratos foram divididos aleatoriamente em 4 grupos (20 ratos em cada grupo): grupo controle, grupo DMH, DMH grupo + Cálcio, e do grupo de cálcio. Os ratos do grupo de controle foram fornecidos alimentação normal e recebeu injeções subcutâneas de solução salina normal; aqueles do grupo de DMH foram fornecidos alimentação normal e receberam uma injecção subcutânea de DMH em uma dose de 20 mg /kg uma vez por semana durante 20 semanas; aqueles do grupo de cálcio + DMH foram fornecidos alimentação de alta cálcio e receberam uma injecção subcutânea de DMH em uma dose de 20 mg /kg uma vez por semana durante 20 semanas; aqueles do grupo de cálcio foram fornecidos alimentação de alta cálcio e receberam injecções subcutâneas de solução salina normal. Os ratos foram mortos no final de 24 semanas, e a incidência de CRC em cada grupo foi examinado. Este método tem sido descrito em pormenor no nosso estudo anterior [17]. Em resumo, as incisões longitudinais foram feitas em tecidos colo-rectais para observar o número de tumores brutas. Depois disso, os tumores foram removidos separadamente brutas e os tecidos colorrectais de espessura total foram cortado em metade por o eixo longitudinal. Algumas das amostras de tumores obtidos de fresco juntamente com a sua meia correspondente não-tecidos de tumores colo-rectais foram congeladas imediatamente em azoto líquido. As demais amostras foram fixadas em formol e incluídos em blocos de parafina para análise patológica e imuno-histoquímica.
A análise histológica
para análise histológica, seções de 4 mm de espessura de fixado em formol e incluídas em parafina Prepararam-se os tumores do cólon incorporados. Depois de hematoxilina e eosina, as secções de cada tumor foram examinadas sob um microscópio de luz (Olympus, Japão). Os resultados foram confirmados pelo patologista Chen XY.
extracção de ARN, a rotulagem, a hibridação, e a análise
ARN total a partir de 12 tecidos colorrectais não tumorais [3 a partir do grupo de controle, 3 do grupo DMH, seis de entre o grupo cálcio DMH + (entre a 6 a partir do grupo de cálcio + DMH, 3 eram de ratinhos com tumores e 3 eram de ratinhos sem tumores)] foram colhidas utilizando TRIzol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. O teor de ARN foi medida usando um espectrofotómetro Nanodrop ND-1000, e electroforese em gel desnaturante foi realizada. Em seguida, as amostras foram amplificadas, marcadas utilizando o kit de marcação rápida Agilent Amp, e hibridado com o genoma inteiro de microarray da Agilent oligo (Agilent Technologies, Palo Alto, CA), utilizando câmaras de hibridação Agilent SureHyb. Após a hibridização e lavagem, as lâminas processadas foram digitalizados com o scanner microarray de DNA Agilent usando as configurações recomendadas pela Agilent Technologies.
Os arquivos de texto resultantes extraídos da Agilent Software Feature Extraction (versão 10.5.1.1) foram importados para o software Agilent GeneSpring GX (versão 11.0) para análise posterior. intensidade de fundo foi cortado antes da normalização. Os conjuntos de dados de microarranjos foram normalizados em GeneSpring GX usando o cenário de uma cor Agilent FE (normalização principalmente mediana). Diferencialmente expressos genes foram identificados por determinação do fold-change (FC) e valores de p do
t
-teste. Genes com um FC de ≥1.5 e um valor de p de ≤0.05 entre dois grupos foram identificados como genes expressos diferencialmente. Análise funcional de genes diferencialmente expressos foi realizada utilizando Gene Ontology (GO) (https://www.geneontology.gov/) [18] e da via Banco de Dados KEGG (https://www.genome.jp/kegg/pathway. html). genes Hub foram identificados utilizando Pathway Studio (Ariadne Genomics) [19].
Real-time polymerase chain reaction
A transcrição reversa foi realizada utilizando iniciadores oligo (dT) e sobrescritos II transcriptase reversa (Takara ). Quantificação da expressão de genes foi realizada utilizando um kit de reacção em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) (Takara). O nível de expressão 18 s rRNA foi usado como um controlo interno. A expressão dos genes seguintes foi analisada:
S100A9
,
Defa20
,
Mmp10
,
Ptgs2
,
Per3
,
Tef
,
Rnf152
, e
Prdx6
. Os iniciadores estão listados na Tabela 1.
A imuno-histoquímica
secções de quatro micrômetros de espessura, de tecidos do cólon não de tumor embebidas em parafina fixadas com formalina foram desparafinizadas e reidratadas. O método de reparação de microondas foi usado para recuperação de antígeno. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada através da incubação das secções com 0,3% de peróxido de hidrogénio durante 10 min. antigénio não específica foi bloqueada através da incubação das secções com soro de ovelha durante 30 min. As lâminas foram incubadas durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada com anticorpo monoclonal de coelho anti-β-catenina (Cell Signaling Technology, # 9562), a uma diluição de 1:200. Anti-IgG de coelho foi usado como anticorpo secundário (30 minutos de incubação). Diaminobenzidina foi utilizada como cromogénio e as secções foram contrastadas com hematoxilina. As amostras incubadas com PBS em vez de anticorpo primário foram usados como controles negativos.
A análise estatística
Os resultados dos experimentos com animais e PCR em tempo real foram analisados usando SAS 9.2 software (SAS Institute Inc. EUA). Os dados são apresentados como médias ± DP. Student
t
-test foi utilizado para comparar valores entre 2 grupos independentes.
Resultados
Experiências com animais
Os principais resultados das experiências com animais são mostrados na Figura 1. Nós induzida com sucesso de CRC em ratinhos usando DMH (Figura 1A). A maioria dos cancros foram identificados como adenocarcinomas por análise histológica (Figura 1B, 1C). Nos + grupos de cálcio DMH e DMH, a incidência do tumor foi de 90% e 40% (Figura 1D), o número médio de tumores por rato foi de 5,39 ± 1,97 e 3,0 ± 1,31 (Figura 1E), e significa o diâmetro máximo dos tumores era 6,44 ± 1,72 e 2,63 ± 1,19 (Figura 1F), respectivamente. Nenhum tumor foi encontrado nos grupos Controle e cálcio. Crescimento e desenvolvimento dos ratos no grupo de cálcio não foram significativamente afetadas, eo exame patológico de seus rins, corações, pulmões, fígados e baços não revelou anormalidades óbvias (dados não mostrados).
A.
Observação de tumores no intestino grosso de ratos após o sacrifício às 24 semanas.
B
(× 200) e
C
(× 400). A maioria dos tumores foram confirmados como adenocarcinomas por exame patológico.
D
. incidência de tumores entre os 4 grupos.
E
. número tumor /ratinhos entre os 4 grupos.
F
. diâmetro tumoral máxima entre os 4 grupos (controle: grupo controle, receberam ração normal e injeção de sódio normal para 20 semanas; DMH: Grupo DMH, recebeu ração normal e injecção de DMH por 20 semanas; DMH + grupo Cálcio: receberam alta de cálcio alimentar e injeção de DMH por 20 semanas; grupo cálcio: receberam ração de alta cálcio e injeção de sódio normal para 20 semanas). *
P
valor. 0,05 entre DMH + grupo de cálcio e de grupo DMH
perfil
expressão gênica por microarrays análise
Todos os 12 tecidos do cólon limpou a etapa de controle de qualidade e foram analisadas tal como descrito na secção de Métodos. A análise microarray foi realizado entre o grupo de controlo (3 amostras), grupo DMH (3 amostras) e DMH + grupo de cálcio (6 amostras). Também comparamos os níveis de expressão gênica entre as amostras com ou sem tumores entre o grupo + Cálcio DMH.
A análise de agrupamento hierárquico dos 12 dados de expressão de matriz mostrou um perfil de expressão homogênea entre as amostras de cada grupo (Figura S1 ). Ao definir o filtro para a FC de ± 1,5 e o valor de p em ≤0.05, descobrimos que a expressão de genes 12395 foi alterado significativamente no grupo de DMH em comparação com os do grupo de controlo (ver Tabela S1), e que de 1508 genes foi alterado significativamente no grupo de cálcio DMH + em comparação com os do grupo de DMH (ver Tabela S2). Em comparação com a Tabela S1 e S2 Tabela, verificou-se que a expressão de 549 genes cuja alterações devido ao tratamento DMH podia ser revertida por cálcio da dieta (ver Tabela S3). Na Tabela 2, os 30 genes mais diferencialmente expressos são mostrados, a maioria dos quais estão estreitamente relacionados com a tumorigénese, tal como o
S100A9
(S100 proteína de ligação ao cálcio A9 [calgranulina B]),
Defa20
(alfa defensinas 20),
Mmp10
(metaloproteinase matriz 10),
Ang2
(angiogenin, ribonuclease A família, membro 2),
Per3
(período homólogo 3) ,
Tef
(tirotróficos fator embrionária), e
Ptgs2
(sintase da prostaglandina-endoper�ido 2). Para os 8 genes selecionados, ou seja,
S100A9
,
Defa20
,
Mmp10
,
Ptgs2
,
Per3
,
Tef
,
Rnf152
, e
Prdx6
, os resultados obtidos a partir da análise de microarray foram confirmadas por PCR em tempo real (Figura 2). Nós selecionamos esses genes para a confirmação PCR, porque eles estão intimamente relacionados com tumorigênese e mais pesquisas a pena.
Foram utilizados 18 s rRNA como um controlo interno. a expressão de ARNm relativa foi calculada de acordo com o método -ΔΔT 2
. Os dados são a média de 10 amostras ± DP. De controlo, a expressão do gene no tecido do cólon normal dos ratos no grupo de controlo; DMH, o nível de expressão do gene no tecido do cólon não-tumor dos ratinhos no grupo de DMH; DMH + cálcio, o nível de expressão do gene no tecido do cólon não-tumor dos ratinhos no grupo de DMH + cálcio; Cálcio, a expressão do gene no tecido do cólon não-tumoral de ratos no grupo de cálcio. *
P
valor 0,05 entre DMH + grupo de cálcio e de grupo DMH; §
P
valor. 0,05 entre o grupo de cálcio e grupo Controle
Para determinar se caminhos biológicos específicos ou grupos de genes funcionais foram diferencialmente afetadas pela dieta rica em cálcio, que analisados nosso conjunto de dados de microarray (na base dos resultados mostrados na Tabela S3) utilizando o software de GO e KEGG. Os resultados detalhados são mostrados na Tabela S4 e S5 Tabela. Ao definir o valor p no ≤0.05, encontramos a regulação negativa significativa de 39 vias de sinalização, incluindo algumas vias relacionadas com o tumor, tais como o percurso do ciclo celular, via de sinalização Wnt, do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) via de sinalização, e factor de crescimento de transformação ( TGF-β) via de sinalização. As vias mais enriquecidas são mostrados na Tabela 3. Foi utilizado imuno-histoquímica para detectar a expressão da proteína e distribuição de β-catenina, a molécula de núcleo na via Wnt, e descobriu que a sua expressão foi significativamente mais elevada no não-tumoral mucosa do cólon do grupo DMH do que em que a partir do grupo de controlo, no entanto, a sua expressão no grupo de cálcio + DMH foi marcadamente reduzido em comparação com o grupo de DMH (Figura 3). Ao todo, 703 termos GO, incluindo termos GO relacionadas com tumores, tais como a diferenciação celular, proliferação celular, apoptose, angiogénese, a adesão celular, o ciclo celular e divisão celular, foram significativamente alteradas
de controle, o grupo de controlo.; DMH, grupo DMH; DMH grupo + Cálcio, DMH + Cálcio; O cálcio, o grupo de cálcio.
Nós também utilizado software do estúdio do pathway para filtrar genes cubo que podem desempenhar papéis importantes na prevenção mediada por cálcio de CRC (Tabela 4). Destes, foram selecionados 2 genes para construir redes de genes (Figura 4). Com base das redes, poderíamos determinar claramente os papéis principais dos genes hub
Os genes diferencialmente expressos regulados pelos genes 2 cubo (A,
FoxM1
;. B,
NF-kB) são exibidos na forma de um diagrama de rede. coloração verde ou vermelho, sequências que são regulados negativamente ou regulados positivamente no grupo de cálcio DMH + em comparação com o grupo de DMH, respectivamente. A intensidade da cor é proporcional à extensão da mudança.
Além disso, nós ainda compararam os níveis de expressão de genes entre os ratos do grupo + Cálcio DMH com /sem tumores e descobriu que os níveis de expressão do gene da maioria dos genes acima seleccionadas em ratinhos do grupo de cálcio + DMH com tumores foi de entre aqueles do grupo de cálcio + DMH sem tumores e os do grupo DMH (ver Tabela S6 e Figura S1). Descobrimos também que a expressão de alguns transportadores de cálcio foi diferente entre os ratos do grupo + Cálcio DMH com /sem tumores. Por exemplo, a expressão de TRPV6 e TRPV3 foi significativamente regulada positivamente em ratinhos do grupo de cálcio DMH + com tumores, em comparação com aqueles sem tumores; no entanto, a expressão de plasmalemmal Ca
2 + -ATPase (PMCA) foi significativamente reprimidos.
Discussão
Neste estudo, foi utilizado o modelo de rato CRC-induzida DMH, que mostra fenotípica e características genotípicas semelhantes aos observados em humanos CRCs esporádicos e, assim, pode ser aplicado para estudar a prevenção de CRC [20]. Neste estudo, verificou-se que a incidência de CRC diminuiu significativamente nos ratos alimentados com uma dieta rica em cálcio, indicando um papel claro de cálcio na prevenção do CRC. Os nossos resultados são compatíveis com muitos outros estudos. Pence [21] verificaram que os ratos na dieta de elevado teor em cálcio têm uma incidência CRC diminuiu em comparação com a dieta com baixo teor de cálcio (86% vs. 53%), Salas [22] também observada uma diminuição significativa no número de tumores e uma diminuição na incidência CRC no grupo alimentado com dieta de elevado teor de cálcio (97% vs 64%). No entanto, alguns estudos têm observado resultados diferentes. Sitrin [23] descobriu que nem a suplementação de cálcio sozinho, nem conjunto suplemento de cálcio com deficiência de vitamina D alterou a incidência de CRC induzida por DMH, Mølck [24] até encontrou uma incidência aumentada nos ratos alimentados com dieta rica em cálcio. Nós pensamos que as diferenças na estirpe animal, idade do animal, ambiente de criação, dieta base, as doses de DMH e duração da injecção, a concentração de cálcio, o tempo de intervenção de cálcio pode ser explicada pelas diferenças na o resultado de vários estudos usando elevada de cálcio. A eficácia preventiva confirmado de CRC com dieta rica em cálcio ainda não pôde ser contido a partir desses estudos. Achamos que é pode ser devido a pequenas doses de cálcio nesses estudos. Assim, utilizou-se maior teor de cálcio (3%) no alimento para animais para testar o efeito preventivo de CRC e tolerância dos ratinhos. Na verdade, esta alimentação elevada de cálcio mostrou um bom efeito preventivo da CRC em nosso experimento e sem efeitos adversos evidentes foi encontrado em camundongos. Além disso, não foi encontrado tumor nos grupos de cálcio. Crescimento e desenvolvimento dos ratos no grupo de cálcio não foram significativamente afetadas, eo exame patológico de seus rins, corações, pulmões, fígados e baços não revelou anormalidades óbvias, a expressão da maioria dos genes selecionados confirmada por PCR em tempo real no grupo de cálcio foi igual à do grupo de controlo. Estes resultados indicam que esta dieta rica em cálcio é seguro para os ratinhos.
Em seguida, utilizou-se análise de microarray gene perfil de expressão para determinar o mecanismo de prevenção mediada por cálcio da CRC. Para o melhor de nosso conhecimento, esta é a primeira investigação a usar a tecnologia de microarrays para estudar o papel da dieta rica em cálcio na prevenção do CRC.
Quando o FC foi definido para ≥1.5, as mudanças em 549 genes que são o resultado de tratamento de DMH pode ser invertida com o cálcio da dieta.
S100A9
é o gene mais reprimidos; seu produto é um Ca citoplasmática
2 + proteína liga�o ao. Embora extracelular S100A9 poderia induzir a apoptose ligando-se a um receptor e causa a dimerização ainda desconhecida de Bax e Bak e a sua translocação para a mitocôndria que levam a lesões mitocondriais [25], a sua expressão em células epiteliais pode efectivamente induzir a proliferação celular através da activação do fosfoinositido 3- quinase via de sobrevivência (PI3K) -Akt-NF-kB, que está associada com a tumorigénese [26]. Além disso, S100A9 é uma citocina pró-inflamatória importante envolvido na imunidade inata, e a sua expressão foi encontrado para ser elevado em numerosas condições patológicas associadas com a inflamação [27]. Muitas outras citocinas inflamatórias, tais como Defa, também foram significativamente reprimidos [membros da família de defensinas foram reprimidos em diferentes níveis:
Defa-rs2
(FC = -9,88),
Defa20
(FC = -8,16)]. fator de necrose tumoral (
Tnf
) e seus receptores também foram reprimidos em diferentes níveis:
Tnf
(FC = -1,87),
TNFRSF11B
(FC = -5,98),
Tnfrsf19
(FC = -2,27). Vários outros estudos realizados utilizando o DMH ou azoximetano (OMA) induzida modelo CRC também encontrou níveis de expressão elevados de S100A9 e Defa em tecidos tumorais [28], [29]. citocinas inflamatórias desempenham papéis importantes na imunidade inata e adaptativa; No entanto, essas citocinas elevados também estão envolvidos na iniciação do tumor, promoção e invasão [30], [31], [32], [33], e assim, desempenhar um papel importante na carcinogénese associada à inflamação [34].
as MMPs são uma família de metaloproteinases de matriz que podem desempenhar papéis importantes no microambiente tumoral [35]. Muitos membros da família MMP foram significativamente regulada negativamente na + grupo de cálcio DMH [
MMP10
(FC = -9,47),
MMP13
(FC = -9,1),
MMP7
(FC = -7,07), e
MMP11
(FC = -1,56)]. Outros metaloproteinases também foram reprimidos, como
Adam8
e
ADAM10
, que foram reprimidos por 2,08 e 1,6 vezes, respectivamente. Estudos recentes têm mostrado que muitos membros da família MMP e ADAM poderia desempenhar vários papéis na tumorigênese. Por exemplo,
MMP7
poderia decompor ligando Fas, diminuindo assim o impacto da quimioterapia sobre o tumor mediante a anulação do apoptose [36].
ADAM10
pode desencadear a liberação de fator de crescimento epidérmico solúvel (EGF), mediar o derramamento de E-caderina, translocação β-catenina para o núcleo, e, portanto, dirigir a proliferação celular [37]. No entanto, o papel mais importante dos membros da família MMP e ADAM é promover a invasão tumoral e metástases através da degradação da matriz extracelular [38], [39]. Estes resultados indicam que uma dieta rica em cálcio pode desempenhar um papel importante na inibição de invasão e metástases de CRC. Porque
In vitro
estudos mostraram que, em CRC células, expressão de E-caderina pode ser induzida pelo aumento do Ca extracelular
2+ [40], o cálcio pode ser considerado para suprimir a transição epitelial-mesenquimal (EMT) para inibir metástases CRC.
Per3
era o gene mais regulada positivamente em nosso estudo, pertencentes aos genes de época. Esses genes são elementos centrais dos loops de feedback de translação de transcrição /que geram o ritmo circadiano endógeno e
Per3
participa de cronometragem na hipófise e pulmão [41]. Estudos recentes têm sugerido que os genes circadianos participar no crescimento e desenvolvimento de vários cancros, e os genes de época agora têm sido associados a vias de resposta ao dano de ADN, inibição do crescimento de células cancerosas, e o aumento da taxa de apoptose [42]. O estudo de Oshima demonstrou que a expressão de
Per3
CRC nos tecidos foi significativamente mais baixa do que na mucosa normal adjacente, sugerindo que
Per3
pode funcionar como um gene supressor de tumores [43].
Tef
foi o segundo gene mais regulada positivamente em nosso estudo. Pertence à PAR-domínio de fecho de leucina de base (PAR Bzip) factores de transcrição e está envolvido na desintoxicação e metabolismo de drogas [44] e na manutenção da forma da célula em fibroblastos [45]. Ele também funciona como um gene pró-apoptótico através da promoção da expressão de Bcl-gs ou Bik [46], [47]. Muitos outros genes também foram regulada, por exemplo,
Rnf152
e
Prdx6
.
Rnf152
é uma proteína de dedo de novo no anel e tem sido demonstrado que possuem actividade pró-apoptótica [48].
Prdx6
é um membro da família PRDX, associados a funções tais como a proliferação celular, a diferenciação e a apoptose, executando, assim, actividade anti-cancro [49].
Utilizando a análise de via, nós descobriu que a via Wnt foi significativamente afectada. Embora a expressão do factor de inibição de Wnt
wif1
foi significativamente regulada negativamente, que de muitos genes associados com a via de sinalização Wnt e seus genes alvo foi regulada negativamente [isto é,
Tcf7
,
Myc
,
ciclina D1
(
CCND1
), e
MMP7
no FC de -1,53, -1,61, -1,62 e -7,07, respectivamente]. A expressão da proteína de β-catenina foi significativamente reduzida no grupo de DMH + cálcio, sugerindo que a via Wnt foi regulada negativamente neste grupo. Isto é consistente com resultados anteriores [28], [50]. Curiosamente, o percurso do ciclo celular foi também inibida de forma significativa no grupo de cálcio + DMH, com muitos genes nesta via a ser consistentemente regulada negativamente, isto é, as ciclinas
CCNB1
e
CCND1
foram reprimidos por 1,79 e 1,62 vezes, respectivamente, e a expressão da quinase dependente de ciclina
Cdk1 foi reduzida em 1,66 vezes.
Entre as vias metabólicas, as vias de ácido araquidónico foram significativamente inibida na DMH + grupo de cálcio. Muitas enzimas neste percurso mostraram redução da expressão, por exemplo, Ptgs2, também conhecida como ciclo-oxigenase-2 (COX-2), foi reduzida em 3 vezes. A via do ácido araquidónico é activado durante a inflamação, levando à síntese de prostaglandinas e tromboxano, que desempenham um papel importante na resposta inflamatória [51]. Além disso, a enzima chave nesta via, Ptgs2 (COX-2), desempenha um papel importante na iniciação da CRC. COX-2 sobre-expressão foi demonstrada estar correlacionada com a carcinogénese em mais de 80% de CRCs [52]. Em modelos animais, a expressão de COX-2 foi encontrado para ser suficiente para induzir a tumorigénese [53]. O mecanismo pode ser relacionada com a activação de sintase de óxido nítrico induzível (iNOS) e VEGF sinalização para promover a formação de novos vasos sanguíneos [54]. Com base na descoberta de que a expressão de citoquinas inflamatórias S100A9, Defa, TNF e receptores de TNF também foi regulada negativamente de forma significativa na + grupo de cálcio DMH, especulamos que o cálcio pode desempenhar um papel importante na redução da tumorigénese relacionadas com a inflamação.
Entre os genes hub Pathway Studio-derivados, que podem desempenhar papéis importantes na prevenção mediada por cálcio de CRC,
FoxM1
,
NF-kB
, etc., eram também envolvido. FoxM1 pertence a uma família de reguladores da transcrição evolutivamente conservados que foram caracterizados pela presença de um domínio de ligação de ADN conhecidos como a caixa de domínio forkhead. maior expressão de FoxM1 foi observado em muitos tipos de cancros humanos [55]. FoxM1 podem desempenhar papéis importantes na proliferação celular e apoptose [56]. O mecanismo molecular subjacente a indução FoxM1 sinalização mediada do crescimento do tumor não foi completamente elucidado. No entanto, vários caminhos oncogénicos, tais como PI3K /Akt, NF-kB, extracelular quinase regulada por sinal (ERK), proteína quinase activada por mitogénio (MAPK), VEGF, espécies reactivas de oxigénio (ROS), c-myc, e hypoxia-inducible fator (HIF) -1 têm sido relatados para interagir com FoxM1 sinalização; isto sugere que a interacção entre FoxM1 sinalização e outras vias de sinalização podem desempenhar papéis importantes na tumorigénese [57]. Deve notar-se que a expressão de vários genes regulados pelo NF-kB mostraram expressão alterada no grupo DMH + cálcio, por exemplo,
TNF
,
PTGS2
,
MYC
,
CCND1
,
relacionados com o ETS gene 1 | (
ERG1
),
S100A9
, e
fator linfóide potenciador de 1 | (
LEF1
), sugerindo que o NF-kB também pode servir como um gene cubo na prevenção mediada por cálcio da CRC. Embora a expressão de NF-kB não se alterou de forma significativa ao nível da transcrição, que pode ter mudado ao nível da tradução ou pós-tradução. O padrão de NF-kB na + grupo de cálcio DMH e seu mecanismo específico de expressão precisa ser mais bem investigado.
Nós também descobrimos que os níveis de expressão do gene da maioria dos genes selecionados acima em camundongos a partir da DMH + grupo de cálcio com tumores foi de entre aqueles pertencentes ao mesmo grupo, sem tumores e os do grupo DMH, assim, confirmou a importância destes genes na prevenção do cálcio de CRC.