Sistemas

Sumário

Os microRNAs (miRNAs) são curtas (± 22 nucleotídeos) RNAs regulatórios que podem modular a expressão do gene e são aberrante expressa de muitas doenças, incluindo câncer. Estudos anteriores têm mostrado que inibem a tradução miARNs e facilitar a degradação das suas RNAs mensageiros (mRNAs) orientadas tornando-os candidatos atraentes para utilização em terapia do cancro. No entanto, o potencial utilidade clínica dos miRNAs na terapia do cancro depende muito da nossa capacidade de compreender e prever com precisão as consequências das flutuações nos níveis de miRNAs no contexto das células tumorais complexos. Para avaliar o poder preditivo dos modelos atuais, níveis de miRNAs e seus mRNAs alvo foram medidos em (LCM), as células de laser capturado microdissecadas câncer epitelial de ovário (CEPI) e comparados com os níveis presentes nas células epiteliais da superfície do ovário (OSE). Descobrimos que a correlação inversa entre previu mudanças nos níveis de miRNAs e os níveis de seus alvos de mRNA detidas por apenas -11% de mRNAs alvo previstos. Nós demonstramos que esta baixa correlação inversa entre as alterações nos níveis de miRNAs e de seus mRNAs alvo

in vivo

não é meramente um artefato imprecisas previsões alvo de miRNA mas a consequência provável de processos celulares indirectos que modulam os efeitos reguladores de miRNAs

in vivo.

Nossos resultados sublinham a complexidade da regulação miRNA-mediada

in vivo

ea necessidade de compreender a base dessas complexidades em células cancerosas antes que o potencial terapêutico dos miRNAs possam ser plenamente realizados .

Citation: Shahab SW, Matyunina LV, Mezencev R, Walker LD, Bowen NJ, Benigno BB, et al. (2011) Evidência para a complexidade da regulamentação Mediada por MicroRNA no câncer de ovário: Sistemas de uma abordagem. PLoS ONE 6 (7): e22508. doi: 10.1371 /journal.pone.0022508

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de março de 2011; Aceito: 27 de junho de 2011; Publicação: 21 de julho de 2011

Direitos de autor: © 2011 Shahab et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Instituto do cancro do ovário, a Fundação ovário ciclo, a Fundação família de Robinson, The Nash Endowment Fund Willingham Deborah, a Fundação Cachoeira e Saúde da Mulher OBNET. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

os microRNAs (miRNAs) são membros de uma classe abundante de pequeno porte (± 22 nts) RNAs regulatórios acredita desempenham papéis importantes em uma variedade de processos biológicos e doenças em plantas e animais [1]. De interesse recente, é a possível contribuição de miRNAs expressos de maneira aberrante do início do câncer e desenvolvimento [2], [3]. Numerosos

In vitro

estudos demonstraram que miARNs são capazes de inibir a tradução e /ou facilitar a degradação [4], [5], [6], [7] dos seus mRNAs segmentados tornando-os candidatos atraentes para uso potencial na terapia do cancro [8], [9]. No entanto, o potencial utilidade clínica dos miRNAs na terapia do cancro depende muito da nossa capacidade de compreender e prever com precisão as consequências das flutuações nos níveis de miRNAs no contexto das células tumorais

in vivo

. A expectativa geral de que alterações nos níveis de miRNAs será inversamente correlacionada (IC), com mudanças nos níveis de seus alvos de mRNA [10], [11], [12], [13], [14] ainda não foi conclusivamente testados dentro no contexto de células tumorais

in vivo.

Por exemplo, estimativas independentes anteriores de níveis de miRNA relativas em cancros do ovário controles vs. muitas vezes têm sido inconsistentes, possivelmente devido a diferenças no tipo de amostra (

por exemplo

., amostras de tecido grosso contra células dissecadas-micro, etc.), variabilidade biológica entre diferentes câncer sub-tipos e amostras de pacientes individuais (

por exemplo

. [15], [16], [17], [18], [19], [20]) ou devido a imprecisões na previsão dos alvos de mRNA [21], [22].

em um esforço para reduzir a variação que pode obscurecer as tendências biologicamente significativas, microarray temos realizado (Affymetrix) as análises dos miRNAs e mRNAs das células mesmos epitelial do ovário (CEPI) isoladas a partir de amostras de pacientes por captura de laser micro-dissecção (LCM). Foram monitoradas as diferenças nos níveis de expressão miRNA entre as células epiteliais da superfície do ovário (OSE) CEPI e (recolhidos de ovários de pacientes normais) com níveis de seus alvos de mRNA putativos de expressão como determinado por vários algoritmos de previsão e pela validação experimental. Enquanto cancros do ovário pode resultar de um ou outro epitélio fimbrial do oviduto ou OSE, recentemente, tem sido demonstrado que ambas as classes de células são parte de um epitélio transicional de origem comum e, assim, ou pode servir como um precursor para a CEPI [23]. Desde OSE pode ser colhida a partir da superfície dos ovários com contaminação mínima, que foram seleccionados como controlos apropriados no nosso estudo

Descobrimos que apenas -11% de alvos de ARNm exibindo significativo. (P 0,005) alterações nos níveis de expressão em CEPI em relação ao normal foram IC com alterações nos níveis de miARN seus reguladores (p 0,01). Os níveis da maioria (~79%) de mRNAs alvo permaneceram inalterados em CEPI enquanto o restante (~ 10%) dos alvos de ARNm apresentada alterações nos níveis correlacionados positivamente (PC) com as respectivas miARNs regulação. Concluímos que a baixa previsibilidade de miRNA efeitos regulamentares em CEPI isolado a partir de amostras de pacientes é atribuível à complexidade da função miRNA

in vivo

.

Resultados

A maioria dos miRNAs diferencialmente expressos em CEPI em relação ao OSE está regulado para cima

agrupamento hierárquico não supervisionado dos perfis de miRNAs detectados no miRChip (Asuragen Inc, Austin, TX) expressão foi realizada em três CEPI e três amostras de pacientes OSE (Figura 1; ver Tabela 1 para informação clínica sobre amostras). O miRChip contém um total de 13.349 sondas incluindo 467 miRNAs humanos anotados (Sanger miRBase V9.2 [24], [25], [26]), 455 miRNAs anotados em várias outras espécies e 12.894 (exploratória) sondas de previsto, mas como ainda não validada /miRNAs anotados. Usando um limiar de mudança de 2-vezes ou superior, 42 sondas de miARN foram encontrados para ser diferencialmente expressos (p 0,01) entre as amostras de cancro e de controlo. Destes, 33 foram sobre-regulada e 9 sub-regulada na CEPI em relação ao OSE, incluindo 12 miRNAs humanos anteriormente anotados (9-regulada e 3 regulada para baixo). Um mapa de calor das 42 sondas de miRNA diferencialmente expressos é apresentado na Figura 2a (as sequências de miRNA dessas 42 sondas, faça o login

2 diferença entre CEPI e OSE, e p-valores de t-teste são fornecidos na Tabela S1). Para testar a validade de forma independente do diferencial de miARN padrões de expressão determinados por microarranjo, conduzimos medições dos níveis de miARN utilizando quantitativa (em tempo real) de reacção em cadeia da polimerase (qPCR). Cinco (

miR-141, o miR-429, o miR-205, o miR-383 e miR-320

) dos 12 miARNs humanos previamente anotados mostrado para ser expresso diferencialmente por microarranjo foram selecionados para análise de qPCR em três cancro e três amostras de controlo. Os resultados confirmaram os qPCR diferenças detectadas no estudo de microarray (Figura 2b).

Um agrupamento hierárquico sem supervisão das amostras CEPI e OSE foi realizada utilizando todos os conjuntos de sondas detectados na matriz Ambion miRChip, independentemente da expressão diferencial. Conjuntos de sondas com desvio padrão 0,5 em todas as amostras foram removidas antes do agrupamento. O agrupamento mostra que as amostras CEPI e OSE aglomerar em grupos separados, o que sugere a variação entre os grupos é maior do que dentro dos grupos.

(A) de agrupamento hierárquico de amostras normais e de pacientes de câncer de base em miRNAs diferencialmente expressos entre as células CEPI e células OSE (p 0,01, ≥2fold mudar). O dendograma do lado esquerdo mostra que as sondas de agrupar em dois grupos correspondentes aos miARNs regulado para cima e para baixo-regulados diferencialmente expressos entre o normal e o cancro. IDs de sondas selecionadas são dadas à direita (incluindo os miRNAs humanos anotados, consulte a Tabela S1 para uma lista completa). Key: hsa-miR-x: miRNAs humanos anotados; HSA-asg /cand-x: candidato previu miRNAs humanos; ppy-:

Pongo pygmaeus

miRNA; cele-:

C. elegans

miRNA. (B) A confirmação de padrões de expressão de miRNAs selecionados por qPCR. A expressão relativa de cada miARN em unidades logarítmicas nas células de 3 pacientes com cancro é mostrado em comparação com células normais a partir de 3 ovários após a normalização para RNU6B (método ΔΔCt). Estes foram encontrados para ser estatisticamente significativa pela ferramenta de software expressão relativa (Rest®) por um método de randomização. A randomização foi realizada 5000 vezes. Consistente com os resultados de microarray, o miR-141, o miR-205 e miR-429 foram confirmadas como sendo significativamente sobre-regulada no cancro, enquanto que o miR-320 e miR-383 verificou-se ser significativamente regulada negativamente. As barras de erro representam o erro padrão da média.

Em contraste com alguns estudos anteriores [15], [16], [18], [19], [20], nossos resultados indicam que a maioria dos miRNAs exibem diferenças significativas nos níveis de expressão entre CEPI e OSE são regulados positivamente no cancro do ovário. A base de esta discrepância é desconhecida mas pode ser devida a diferenças no tipo de amostra (por exemplo, amostras de tecidos a granel versus células micro-dissecadas, etc.) e /ou variabilidade biológica entre amostras individuais do paciente. A nossa constatação de que a maioria dos miRNAs são regulados positivamente no cancro do ovário é consistente com o fato de que alvos de miRNA são significativamente enriquecido (distribuição hipergeométrica, p 0,05) entre mRNAs regulada para baixo em nossas amostras de câncer, enquanto genes up-regulamentados têm relativamente alguns alvos de miARN (Figura S1; mapas de calor que mostram agrupamento hierárquico das amostras utilizando todos os conjuntos de sondas é apresentado na Figura S2 e usando mRNAs expressos diferencialmente em única Figura S3; uma lista de todos os ARNms diferencialmente expressos é apresentada na Tabela S2). A explicação biológica possível de por que miRNAs são regulados positivamente em CEPI pode estar no fato de que, em contraste com outros tipos de câncer [27], [28], a transição do OSE para CEPI é postulada para envolver as alterações de um menos diferenciado a um mais estado diferenciado [29], [30], [31].

Entre as 12 miRNAs anteriormente anotados exibindo uma mudança significativa nos níveis nas amostras CEPI, miR-205, miR-141 e miR-429 são todos significativamente sobre-regulada consistente com estudos anteriores que ligam estes miARNs com a manutenção de células no estado epitelial diferenciada [32]. Dos miRNAs que são regulados negativamente em CEPI em relação ao OSE, miR-320 e miR-383 estão localizadas em regiões associadas com DNA freqüentes perdas no número de cópias em câncer de ovário [19]. miR-320 foi anteriormente identificada como um inibidor da proliferação de carcinoma pulmonar [33]. Sua infra-regulação no CEPI sugere que pode atuar como um supressor de tumor no ovário também.

Apenas -11% das metas de mRNA previstos de miRNAs diferencialmente expressos entre o CEPI e OSE exibir o padrão inverso esperado de mudança na expressão do gene

estudos anteriores estabeleceram que miARNs humanos reprimir a expressão do gene por emparelhamento com sequências complementares localizadas dentro “regiões não traduzidas (3 ‘UTR) a 3 de ARNm-alvo, resultando na repressão translacional e degradação de ARNm [6 ], [7]. Com base nestes resultados, as alterações nos níveis de expressão são geralmente miARNs previu estar inversamente correlacionado com alterações nos níveis de seus mRNAs segmentados [10], [11], [12], [13], [14] expressão. Para testar esta hipótese, no contexto de células isoladas a partir de amostras de pacientes, compararam-alterações nos níveis dos miARNs humanos anteriormente anotado com os níveis dos seus mRNAs alvo previstos nas nossas amostras CEPI em relação aos controlos OSE. Os alvos de ARNm putativas destas miARNs humanos previamente anotados foram inicialmente identificados utilizando o algoritmo miRanda [34], [35], [36]. Os resultados indicam que apenas -11% das alterações na expressão de ARNm entre CEPI e OSE foram inversamente correlacionados (IC) com as alterações observadas nos níveis de miARN (Tabelas 2 S3). Estudos anteriores sobre os níveis de miRNAs e de seus mRNAs alvo em uma série de linhas celulares relataram resultados semelhantes [13], [37], [38]. A expressão da maioria (nenhuma mudança, NC: ~79%) dos alvos de mRNA previsíveis não foi significativamente diferente (p 0,005 e /ou dobrar mudança 2) entre as amostras CEPI e OSE, enquanto ~ 10% do mRNAs alvo exibidos mudanças positivamente correlacionada (PC) com os miRNAs regulação putativamente.

para determinar se a inesperada baixa percentagem de mudanças IC pode ser um artefato computacional de nosso uso do algoritmo miRanda para prever mRNAs alvo , repetiu-se a análise utilizando de forma independente os PicTar (www.pictar.org) e TargetScan (www.targetscan.org) miRNA algoritmos de previsão de destino. Em ambos os casos, os resultados foram consistentes com a nossa conclusão inicial de que apenas uma minoria das alterações na expressão de mRNA entre CEPI e OSE estão inversamente correlacionados (IC) com as alterações observadas nos níveis de miRNA (PicTar: IC 9,4%, PC 10,1%, NC 80,5%; TargetScan: IC 10,4%, PC 10,3%, NC 79,3%; ver quadros 3, S4 S5). Para aumentar o rigor das previsões alvo, nós reanalisados ​​os dados usando apenas alvos miRNA que eram comumente preditos por todos os três algoritmos (interseção). Descobrimos que através da sobreposição dos três algoritmos de previsão independentes, cada um miRNA tinham menos metas previstas, ainda com estes alvos normalmente previstos, apenas a ~ 7% das mudanças de mRNA entre CEPI e OSE foram encontrados para ser inversamente correlacionados (IC), com as alterações observadas em miRNA níveis (Tabela 4). Também analisamos nossos dados utilizando intersecções das previsões de dois algoritmos em um momento de (Miranda + TargetScan, Miranda + PicTar e PicTar + TargetScan), e novamente descobrimos que mudanças nos níveis de única 6-9% das metas de mRNA previstos foram inversamente correlacionada com alterações nos níveis de miRNA (Tabelas S6, S7 e S8).

validação experimental é atualmente considerado o método mais rigoroso para validar alvos de miRNA [39], [40]. Assim, para testar a possibilidade de que a baixa correlação inversa entre as alterações dos níveis de miARN e mRNAs alvo observadas nas amostras de tecido foi meramente um reflexo de a precisão limitada de algoritmos de previsão alvo, foi conduzida uma série de experiências de transfecção utilizando dois miARNs que eram significativamente up-regulamentada em CEPI (miR-7 e miR-128) para identificar alvos experimentalmente validadas destes miRNAs no CEPI.

Uma série de experiências de transfecção independentes foi realizada com miR-7, miR-128 e um conjunto combinado de miRNAs de controlo negativo em uma linha de células de cancro do ovário bem estabelecida (HEY) [41]. Para determinar a eficácia das nossas transfections (controlos positivos), nós monitoramos os níveis de dois alvos de mRNA da confirmação prévia de miR-7 (receptor do factor de crescimento epidérmico, EGFR [42] e miR-128 de expressão (linfoma B Mo-MLV região de inserção 1 homólogo .., BMI1 [43]) regulação os resultados confirmam a eficácia de ambas as transfecções (Figura S4) RNA foram recolhidos a partir de células após a transfecção e os níveis relativos de mRNAs presentes foram determinados pela Affymetrix microarrays análises (HG-U133 mais 2,0; Tabelas S9 e S10).

de acordo com os resultados a partir de amostras de tecido CEPI, apenas uma minoria dos alvos de ARNm previstos foram encontrados para ser significativamente reduzida (IC) após o miR-7 ou o miR-128 transfecção (Tabela 5). O previu alvos de ARNm que foram significativamente regulada para baixo nestas experiências de transfecção foram tomados como “validada experimentalmente” alvos de ARNm de miR-7 e miR-128, respectivamente. Usando apenas estes objectivos, que reanalisados ​​os dados de microarray de as amostras de tecido e descobriu que apenas -8% (gama de 0-18%) dos alvos de ARNm de “validada experimentalmente” exibido alterações na expressão de IC com alterações em miR-7 e a expressão de miR-128 em CEPI (Tabela 6). Colectivamente nossos resultados indicam que a baixa correlação inversa entre as alterações nos níveis de miRNAs e seus mRNAs alvo

in vivo

não é meramente um artefato das previsões alvo imprecisos, mas sim um reflexo da complexidade da função miRNA em células cancerosas.

Discussão

é bem sabido que os genes e seus produtos de mRNA estão sujeitos a uma vasta gama de controles regulamentares. A contribuição relativa de avarias nesses controles para o aparecimento e progressão de doenças, como o câncer, pode ser variada e complexa [44]. miARNs e outros pequenos RNAs não-codificantes foram recentemente mostrado ser reguladores importantes da expressão do gene, e a interrupção da expressão de miARN tem sido implicada em muitas doenças, incluindo o cancro [3], [45], [46], [47], [ ,,,0],48]. Embora seja bem estabelecido que miARN pode servir biomarcadores como úteis para o diagnóstico e estadiamento de uma variedade de cancros humanos (por exemplo, [2], [49], [50]), a maneira e extensão a que miARNs contribuir para os processos cancro subjacente apenas está começando a ser entendido [2], [45]. Por exemplo, a função reguladora de miARNs se acreditava inicialmente a operar exclusivamente ao nível da tradução [51], [52], mas descobertas mais recentes demonstraram que estes pequenos RNAs reguladores também desempenhar um papel na modulação da estabilidade do mRNA e que estes dois modos de controle pode ser inter-relacionados [7], [53]. Nós ainda não descarta a possibilidade de que a regulamentação de alguns genes alvo pode ocorrer ao nível da tradução, sem mudanças significativas no nível de mRNA e, portanto, pode ter sido ignorado em nossas análises.

Extensa

in vitro

e

in vivo

estudos já demonstraram que os miRNAs humanos podem reprimir a expressão do gene por emparelhamento com sequências localizadas dentro de regiões 3 ‘não traduzidas de RNAs mensageiros-alvo (mRNAs), resultando em repressão translacional e subsequente mRNA degradação [1 ], [6], [7]. Até agora, existem poucos exemplos de miARNs aumentando a transcrição ou tradução de genes alvo [54], [55], resultando em correlações positivas entre miARNs e mRNAs alvo. Portanto, uma expectativa geralmente realizada é que as alterações nos níveis de ARNm de expressão será inversamente correlacionadas com as mudanças nos níveis de seus miARNs segmentação [56]. No entanto, o facto de miARNs individuais pode ter como alvo vários mRNAs e que os ARNm individuais podem ser alvo de várias miARNs cria o potencial para uma rede complexa de interacções de células cancerosas repletos com uma variedade de ciclos de feedback positivo e negativo [57], [58] . Além disso, o facto de miARNs são bem conhecidos para segmentar os mRNAs que codificam uma variedade de factores de transcrição celular e outras proteínas reguladoras, aumenta a probabilidade de que os efeitos reguladores directos de miARN pode ser modulada pelos efeitos indirectos ou “a jusante” no contexto de células cancerosas. Isso não quer dizer que os mecanismos demonstrou ser a base regulação miRNA

in vitro

estão inoperantes

in vivo

, mas sim que as consequências funcionais destes mecanismos podem ser mascaradas e /ou modulada pela complexidades reguladoras que caracterizam as células cancerosas. A medida em que estas complexidades podem reduzir nossa capacidade de prever com precisão o resultado molecular de mudanças nos níveis de miRNAs no contexto de células cancerosas tem relevância para o uso potencial de miRNAs na terapia do câncer.

O objectivo da nossa estudo foi avaliar a medida em que as consequências moleculares de alterações nos níveis de miARN em células cancerosas isoladas a partir de tecidos de pacientes pode ser previsto a partir de modelos atuais de função miARN. O facto de que os esforços anteriores para a obtenção de perfis de miARNs e os seus alvos de ARNm de expressão foram tipicamente efectuados em amostras obtidas de diferentes pacientes e /ou a partir de (a granel) tecidos mistos têm contribuído para resultados inconsistentes (por exemplo, [15], [16], [17], [18], [19], [20]). Num esforço para reduzir a variação experimental, foram analisadas as alterações nos níveis de miARN e seus mRNAs alvo em células de cancro do ovário isolados a partir dos mesmos doentes por LCM. Os nossos resultados indicam que apenas -11% das alterações nos níveis de ARNm são IC com alterações nos níveis de seus miARNs reguladora na mesma cancro do ovário (CEPI) células. Para eliminar a possibilidade de que os resultados são meramente um artefacto de alvos de ARNm identificados de forma incorrecta de regulação miARN, repetimos as nossas análises usando objectivos previstos por uma variedade de algoritmos de previsão, bem como, alvos validada experimentalmente em uma série de experiências de transfecção realizadas em um linha de bem documentado ovário célula cancerosa (HEY). Nossos resultados consistentemente apoiar a conclusão de que a IC esperada entre as mudanças nos níveis de miRNA e níveis de seus mRNAs alvo ocorre com pouca frequência em células de cancro do ovário isoladas de amostras de pacientes e que esta baixa correlação inversa não é meramente um artefato imprecisas previsões alvo de miRNA. Em vez disso, nossos resultados indicam que a baixa correlação inversa entre as alterações nos níveis de miRNA e níveis de seus mRNAs alvo é a consequência provável de processos celulares indirectos que modulam ou mascarar os efeitos reguladores de miRNAs

in vivo

. Nossos resultados sublinham a complexidade da regulação miRNA-mediada

in vivo

ea necessidade de compreender melhor a base dessas complexidades em células cancerosas antes que o potencial terapêutico dos miRNAs possam ser plenamente realizados.

Materiais e Métodos

As amostras de tecido

amostras de tumores ovarianos foram coletadas em Northside Hospital (Atlanta, GA) durante a cirurgia e congelados em nitrogênio líquido dentro de 1 minuto após a remoção de pacientes. Todas as amostras do tumor dos ovários utilizados neste estudo eram de pacientes diagnosticados com carcinoma de ovário epitelial papilar seroso. Escovações de células epiteliais da superfície do ovário normais (OSE) foram preservados imediatamente em RNAlater (Ambion, Austin, TX). foram obtidos consentimento do paciente e aprovação dos Institucionais Review Boards de Georgia Institute of Technology e Hospital Northside. A autorização por escrito e nosso protocolo (# H09227) foram aprovadas pelo IRB. informação clínica detalhada para cada paciente utilizado neste estudo é apresentado na Tabela 1.

captura de laser micro-dissecção (LCM)

tecidos congelados frescos de tumores foram cortados em secções de sete mícrons, aplicada a slides não cobrado, então fixado em 75% de etanol por 30 segundos, manchado e desidratados utilizando o HistoGene LCM congelado Seção coloração Kit (Arcturus, mountain View, CA). LCM foi realizada com um sistema de captura de Microdissecção AutoPix Automated Laser usando a tecla Caps Macro CaPSURE (Arcturus). Aproximadamente 10000 células foram capturados em cada um dos tampões 5-6 por amostra. miARN foi extraído a partir de células capturadas utilizando o kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion). mRNA foi isolado a partir de células dos mesmos pacientes utilizando o kit de isolamento PicoPure RNA (Arcturus).

extração de RNA a partir de células epiteliais da superfície do ovário

Para miRNA qPCR e microarray, células epiteliais da superfície do ovário normal foram centrifugadas e ressuspensas em tampão de lise a partir do kit de isolamento de miRvana miARN (para enriquecimento de RNA pequeno), seguindo o protocolo recomendado do fabricante (Ambion). cDNA para qPCR foi sintetizado a partir de RNA (10 ng), utilizando o TaqMan miARN Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Para ARNm qPCR e microarrays de extracção de RNA total a partir de OSE foi levada a cabo usando o RNA PicoPure kit de isolamento, seguindo o protocolo recomendado pelo fabricante (Arcturus). Devido ao número limitado de células colhidas a partir de escovagens epiteliais superfície, OSE ARN foi extraído a partir de 5 pacientes com ovários não-malignas de microarray e ARNm a partir de dois

diferentes conjuntos de três pacientes com ovários não-malignas de miARN (um definido para miRNA microarray, outro para qPCR) (Ver Tabela 1 para obter mais detalhes sobre as informações do paciente).

quantitativa (em tempo real) PCR

RNA total (10 ng) extraído da LCM capturado ovário células tumorais e células normais OSE foi convertido em ADNc amplificado por qPCR. TaqMan miARN Ensaios (Applied Biosystems) foram realizadas seguindo o protocolo do fabricante para HSA-miR-141, HSA-miR-429, HSA-miR-205, HSA-miR-320, HSA-miR-383 e para o controle endógeno RNU6B usando o StepOnePlus real-Time máquina de PCR (Applied Biosystems). As especificidades de iniciadores para estes miARNs ter sido previamente demonstrado [58] – [63] e RNU6B é um controlo anteriormente estabelecido para o tecido do ovário humano (https://www.ambion.com/techlib/tn/151/3.html; https://www3.appliedbiosystems.com/cms/groups/mcb_marketing/documents/generaldocuments/cms_044972.pdf). A significância estatística foi determinada utilizando a ferramenta em relação Expressão Software (REST; [59])

Para mRNA qPCR, RNA total (1-5 g) extraído de células foi convertido em cDNA usando a síntese Superscript III First Strand. sistema (Invitrogen). o ADNc foi então purificado utilizando o kit de purificação QIAGEN de PCR (Qiagen) seguindo as instruções do fabricante. experimentos qPCR foram realizadas para o EGFR, BMI1 e GAPDH genes utilizando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA). os primers específicos de sequência usados ​​para ensaios verde SYBR são os seguintes: EGFR-forward: GGAGAACTGCCAGAAACTGACC, EGFR-reverse: GCCTGCAGCACACTGGTTG, GAPDH-forward: GGTCTCCTCTGACTTCAACA, GAPDH-reverse: AGCCAAATTCGTTGTCATAC, BMI1-forward: ACTTCATTGATGCCACAACC, BMI1-reverse:. CAGAAGGATGAGCTGCATAA A EGFR iniciadores foram concebidos como por [60] e os iniciadores GAPDH foram concebidos como por [61]. BMI1 iniciadores foram obtidos da base de dados qPCR iniciador RTPrimerDB [62]. as eficiências de iniciadores GAPDH foram calculadas para ser ~ 1. a especificidade da outra primers pode ser obtido a partir da publications /banco de dados relevante. Todas as reações de qPCR (por mRNA e miRNA) foram otimizados com controles não-modelo e -RT (menos transcriptase reversa) controla antes de experimentar. GAPDH foi escolhida como controlo endógena tal como apresentado alteração mínima entre as células transfectadas com o miR-NC e miR-7/128 em microarrays.

Todas as reacções foram realizadas qPCR com, pelo menos, 2 replicados e biológicas para cada réplica biológica pelo menos 3 repetições técnicos.

cultura celular e celular transfec�es

HEY células foram fornecidos por Gordon B. Mills, do Departamento de Biologia de Sistemas, da Universidade do Texas, MD Anderson Cancer Center. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Mediatech, Manassas, VA) suplementado com 10% v /v de soro fetal de vitelo inactivado pelo calor (Invitrogen, Carlsbad, CA), 2 mM de L-glutamina (Mediatech), 10 mM de tampão HEPES (Mediatech ), penicilina (100 U /ml) e estreptomicina (100 ug /mL). Aproximadamente 12 horas antes da transfecção, estas células (duplicados ou triplicados por transfecção, 1,5 x 10

5 por po) foram semeadas em placas de seis poços em meio de crescimento e deixadas a aderir durante a noite a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO

2 atmosfera. No dia seguinte, após lavagem dos poços com PBS e substituindo o meio de crescimento com Opti-MEM (Invitrogen), as células foram transfectadas com o miARN [HSA-miR-7 miRIDIAN imitar, miRIDIAN miARN imitar controlo negativo # 1 (miR-NC, uma

C. elegans

miRNA, cel-miR-67, com identidade de sequência mínima confirmados em seres humanos) ou HSA-miR-128 miRIDIAN mímica (Thermo Fisher Scientific, Lafayette, CO)] usando Lipofectamine 2000 agente de transfecção ( Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante, a uma concentração final de 25 nM. As células foram incubadas durante quatro horas neste meio de soro reduzido para optimizar a transfecção, lavou-se com PBS, e depois incubaram-se a 37 ° C e 5% de CO

2 durante 44 horas (total de 48 h) após a adição de meio de crescimento fresco aos poços . eficiência de transfecção foi estimada a partir do knock-down relativa de metas previamente validados (EGFR para miR-7 e IMC-1 para miR-128 [42], [43]), com base nas recomendações do fabricante do reagente siRNA /miRNA (Thermo Fisher Científico). experimentos de cultura de células foram realizados utilizando pelo menos dois e três repetições biológicas independentes.

Microarray

microarray mRNA Tissue.

A biotina marcado cRNA foi sintetizado, hibridizado com Affymetrix HG U133 mais 2,0 matrizes de oligonucleotídeos e analisadas com um Scanner GeneChip 3000 (Affymetrix, Santa Clara, CA).

HEY isolamento do RNA celular e mRNA microarray.

o RNA total foi isolado utilizando o RNeasy Mini RNA kit de isolamento (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com as instruções do fabricante. A integridade do ARN foi verificada usando um Agilent Bioanalyzer 2100 (1,8-2,0; Agilent Technologies, Palo Alto, CA). ARNm foram convertidas em cadeia dupla (ds) -cDNA e amplificado utilizando aplauso 3′-Amp Sistema (NuGen, San Carlos, CA). Este cDNA foi então marcado com biotina e fragmentado, utilizando Codificação Biotina Módulo (NuGen). O cDNA marcado foi hibridizado com Affymetrix HG-U133 Mais de matrizes 2.0 de oligonucleotídeos e analisadas com um Scanner GeneChip 3000 (Affymetrix).

análise de dados Microarray

Tissue miRNA análise de dados microarray.

as amostras para os nossos miRNA perfis estudo foram processados ​​pelos Serviços Asuragen (Austin, TX), de acordo com os procedimentos operacionais padrão da empresa. Um fabricado por encomenda Affymetrix GeneChip® de Ambion foi concebido para sondas derivadas da miARN Sanger miRBase e relatórios publicados [24], [25], [26], [63], [64], [65]. sinal de fundo foi estimada a partir de sequências de sondas antigen�ico fornecidos pela Affymetrix e derivados a partir de um conjunto maior de controlos utilizados na matriz humana exão Affymetrix. Pico-nos controlos de referência externos foram baseados em sondas de controlo não-miARN que não possuem homologia com o genoma humano. Matrizes dentro de um experimento análise específica foram normalizados de acordo com o método de estabilização descrito na variância [66]. Um teste de soma de postos de Wilcoxon foi utilizado para determinar as chamadas de detecção do sinal da sonda miRNA em comparação com a distribuição de sinais de GC-conteúdo correspondente sondas anti-genômicos.

A t de duas amostras-teste, com assunção de igualdade de variância, foi aplicado para testes de hipóteses. Este teste definido, que as sondas são considerados significativamente expressos diferencialmente com base em um valor de p de 0,01 e log

2 diferença ≥1. As intensidades de sinal de estas sondas diferencialmente expressos foram z-score normalizado antes de agrupamento hierárquico.

agrupamento hierárquico não supervisionado das amostras foi realizada utilizando Spotfire DecisionSite para Análise de Microarray (DSMA) com base em valores de sinal Z-score transformado de todas as sondas, exceto aqueles com desvio padrão 0,5.