Abstract

Fundo

MicroRNA (miRNA) é uma subclasse emergente de pequenos RNAs não-codificantes que regula a expressão de genes e tem um papel essencial para muitos processos fisiológicos, incluindo o desenvolvimento de câncer. Relatórios recentes revelaram o papel dos miRNAs como biomarcadores ideais e alvos terapêuticos devido à sua natureza tecido- ou específica da doença. câncer de cabeça e pescoço (CCP) é uma das principais causas de mortalidade e morbidade relacionada ao câncer, e câncer de laringe tem a maior incidência na mesma. No entanto, os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento do câncer de laringe continuam a ser conhecido e biomarcadores altamente sensíveis e nova terapia promissora é necessário.

Metodologia /Principais Achados

Para explorar miRNAs específicas do câncer de laringe, RNA a partir de 5 amostras cirúrgicas na laringe, incluindo tecidos de câncer e não-cancerosas foram hibridadas com microarray transportando 723 miRNAs humanos. Os resultantes miRNAs diferencialmente expressos foram ainda testados usando quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) em amostras de tecido 43 da laringe, incluindo cancros, contrapartes não-cancerosas, doenças benignas e displasias pré-cancerosas. diferenças Expressional significativas entre pares combinados foram reproduzidas em miR-133b, miR-455-5p e miR-196a, entre os quais sendo o biomarcador de câncer mais promissor como validados por qRT-PCR miR-196a analisam amostras adicionais 84 de tecido. análise de sequenciação profunda revelou desvio quantitativa e qualitativa de expressão isomiR miR-196a no câncer de laringe. A hibridação in situ confirmaram a expressão específica de câncer de laringe de miR-196a em ambas as células cancerosas e estroma câncer. Finalmente, a inibição de miR-196a contrariado proliferação de células cancerosas tanto em modelo de células derivadas de câncer e xenoenxerto rato laringe.

Conclusões /Significado

Nosso estudo forneceu as possibilidades que miR-196a pode ser muito útil no diagnóstico e tratamento do câncer de laringe

Citation:. Saito K, Inagaki K, Kamimoto T, Ito Y, Sugita T, Nakajo S, et al. (2013) MicroRNA-196a é um diagnóstico de biomarcador putativo e alvo terapêutico para o câncer de laringe. PLoS ONE 8 (8): e71480. doi: 10.1371 /journal.pone.0071480

editor: Valerie W. Hu, The George Washington University, Estados Unidos da América

Recebido: 08 de fevereiro de 2013; Aceito: 28 de junho de 2013; Publicação: 14 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Saito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Uma parte este trabalho foi apoiado por uma bolsa de Tecnologia industrial Research da Nova Energia e Tecnologia industrial Development Organization (NEDO; https://www.nedo.go.jp/english/index.html). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo

Conflito de interesses:. Embora alguns dos autores são empregados por empresas comerciais (Y. Ito, T. Sugita, e S. Nakajo por SRL, Inc., T. Ishikura, H. Hanaoka, e T. Onozaki pela Life Technologies Japão), eles não têm interesses conflitantes em relação a este trabalho. Esses empregos não alteram a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

Em 2004, 28,260 novos casos de câncer de cavidade oral e faringe e 20,260 novos casos de cancro da laringe foram diagnosticados nos Estados Unidos, resultando em 7.230 e 3.830 mortes, respectivamente [1], [2]. Apesar dos avanços significativos em cirurgia e radioterapia nas últimas décadas, as taxas de sobrevida em 5 anos de pacientes com carcinoma de células escamosas do pescoço (CECP) cabeça e foram melhorados apenas moderadamente em parte devido à relativamente elevada taxa de recorrência local. Actualmente, HNC locorregional é tratado com uma combinação de radiação e cirurgia, com ou sem quimioterapia, enquanto cada opção de tratamento resulta em consequências devastadoras para expressão e função de deglutição. Além disso, os procedimentos cirúrgicos na cabeça e no pescoço e na região da cavidade oral comumente resultar em deformidades estéticas significativas. Mesmo com o tratamento combinado abordagens anteriormente, os doentes com CCP avançado são, portanto, necessidade de novos tratamentos e menos invasiva para a sua doença alta morbilidade. Neste estudo, pensando considerável heterogeneidade de tumores CECP, temos nos concentrado em um único bem definido anatômica localização, laringe. Embora o câncer de laringe é altamente curável, quer por remoção cirúrgica ou irradiação, quando detectado e tratado na fase inicial, cancro avançado permanece muito menos curável resultando em nenhuma melhora significativa da sobrevida global desde 1975 [3]. Assim, os biomarcadores altamente sensíveis para detectar o câncer de laringe, mesmo na fase inicial, sem sintomas clínicos, e novos agentes terapêuticos significativamente eficazes são necessárias para melhorar ainda mais os resultados dos pacientes de câncer de laringe. Além disso, as abordagens atuais para prever o resultado de pacientes com CECP incluir o exame usando os parâmetros clínico, tais como tumor primário, nó regional, metástase (TNM) – etapa, profundidade de invasão, e grau de diferenciação. No entanto, esses parâmetros não refletem com precisão o prognóstico dos pacientes e preditores e biomarcadores adicionais seriam úteis para o doente. Assim, a biologia molecular e celular, é um campo promissor de estudo que podem conduzir à descoberta de novos biomarcadores e alvos terapêuticos novos.

MicroRNA (miARN), que codifica um pequeno ARN não codificante de ± 22 nucleótidos, é agora reconhecido como uma grande família de genes expressos em plantas, animais, e vírus, bem como em algas unicelulares [4]. A maioria dos miRNAs de animais são evolutivamente conservadas e, muitas vezes encontrados em clusters [5]. miARNs primárias (pri-miARNs) formar estruturas de haste-laçada estão predominantemente transcrito pela ARN-polimerase II e são sucessivamente transformados por duas enzimas de ARNase III-like, Drosha no núcleo da célula e Dicer no citoplasma da célula, para gerar miARNs maduros [6] [7]. miRNAs regulam negativamente a expressão de genes em nível pós-transcricional por clivagem e /ou repressão de translação de seus alvos de mRNA através da interação com base emparelhamento perfeito na extremidade 5 ‘do miRNA maduro, também denominada região de semente [8]. bioinformática análises recentes relataram que mais de 60% dos genes codificadores de proteínas têm potencial para o emparelhamento e para ser controlado por miARNs [9]. Investigações adicionais demonstraram que miARNs desempenham um papel extremamente importante em quase todos os aspectos da biologia, incluindo o metabolismo, a proliferação celular, apoptose, diferenciação e desenvolvimento [10], [11].

Nos últimos anos, tem havido um um interesse considerável na compreensão do papel de miARNs em processos de doença e a sua desregulação é acreditado para promover o comportamento maligno dos tumores [12]. As ligações entre a expressão aberrante de miRNAs e patogênese de vários tipos de câncer [12] – [14] são documentados

Também foi relatado que miRNAs poderia ser um biomarcadores ideais para a detecção do câncer porque:. (I ) expressão miRNA é frequentemente desregulado no cancro [15], [16], (ii) os padrões de miRNAs em câncer humano expressão parece ser específico de tecido [17], e (iii) miRNAs têm invulgarmente elevada estabilidade mesmo em formalina-fixo tecidos [18]. Além disso, a recente pesquisa extensiva miARN também revelou que miARNs são promissores alvos terapêuticos em cancros incluindo os do cólon, da mama, gástrico e de doenças malignas hepatocelulares [19] – [26]

Todos estes problemas são importantes para proporcionar uma mais profunda. compreensão dos papéis de miRNAs na patogênese da CECP e como potenciais marcadores prognósticos e diagnósticos, bem como alvos terapêuticos em CECP. No presente estudo, nós perfilado a expressão de 723 miARNs humanos originais em 3 cancros da laringe, 2 equivalentes da laringe não cancerosos utilizando microarrays de oligonucleótidos com uma estrutura de gancho de cabelo incorporado na extremidade 5 ‘da sonda [27] fabricada por um sintetizador de oligonucleótidos de jacto de tinta [28] (Agilent Humano miRNA V2, Agilent Technologies) e identificaram vários miRNAs que poderiam servir como potenciais marcadores de doenças de diagnóstico. Nós confirmou ainda a expressão de miRNAs selecionados utilizando qRT-PCR (ensaios TaqMan® miRNA, Applied Biosystems) em 5 homólogos não cancerosos, 14 pólipos ou nódulos, 12 displasias e 17 cancros da laringe para fornecer dados que sugerem que os níveis de expressão alterada de miRNAs têm um funcional consequência no câncer de laringe.

In situ

hibridação (ISH) ainda provou a marcadamente expressão diferencial de miRNAs na lesão de câncer em comparação com epitélio celular escamoso normal.

Foram avaliados ainda mais o impacto da inibição do miR-196a

em

vitro

e

em

vivo

sobre o crescimento de HNSCC para avaliar o potencial de miRNA como um novo alvo terapêutico para HNC.

materiais e Métodos

Ética Declaração

o protocolo deste estudo foi aprovado pelo conselho de revisão institucional da Escola Universidade Keio de Medicina e Hospital Sano Kousei Geral. Todas as amostras de tecido foram tomadas com o objetivo de biópsia de diagnóstico ou tratamentos dos pacientes submetidos à cirurgia após a aprovação do estudo pelo conselho de revisão institucional da Escola Universidade Keio de Medicina e Sano Hospital Kousei Geral. consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes

Os animais foram tratados e utilizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal de Keio University School of Medicine (número de autorização para este estudo:. 10243- (0 )). Todos cirurgia foi realizada sob anestesia tribromoethanol, e todos os esforços foram feitos para minimizar o sofrimento.

Pacientes e espécimes

Uma parte da amostra foi processada para fixado em formalina e embebidos em parafina (FFPE) procedimento, seguido por patológica análises de rotina, enquanto que o tecido residual foi saturada em ARN

mais tarde

® (Ambion, Foster City, CA), e armazenados a -80 ° C até processamento. Todas as amostras FFPE foram revisadas por patologistas experientes para confirmar os diagnósticos. As características dos pacientes e estadiamento patológico estão resumidos na Tabela 1.

Reagentes

Salvo disposição em contrário, os materiais químicos de rotina foram obtidos a partir de qualquer Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO) ou Wako ( Osaka, Japão). miR-196a inibidor (HSA-miR-196a miRIDIAN Hairpin Inhibitor, IH-300529-06) e inibidor de controlo negativo (controlo, miRIDIAN microARN inibidor de controlo negativo não. 1, EM-001005-01) usado neste estudo foram adquiridos da Dharmacon (Lafayette, CO). miRIDIAN Hairpin inibidor foi concebido para inibir a função RISC da miARN alvo com a sua região de cadeia dupla [29]. Para

In situ

hibridação (ISH) de miR-196a, a sonda bloqueada incorporado ácido nucleico-3′-DIG marcado com miARN (microARN detecção da sonda miRCURY LNA ™, Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) foi usado neste estudo.

Extração de RNA e Análise de Microarray de miARN

o RNA total RNA, incluindo baixo peso molecular a partir de amostras de tecidos e linhas celulares de cancro foi isolado utilizando o kit de isolamento de miARN miRvana ™ (Ambion) de acordo com a as instruções do fabricante. A qualidade das amostras de ARN foi avaliada usando um Agilent Bioanalyzer 2100, e apenas as amostras que satisfazem os critérios de 28S /18S 1 e ARN Integridade Número (Rin) ≥7.5 foram utilizados para todas as análises

Para. microarrays análise, foi utilizada a Human miRNA microarray Kit V2 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), que contém 20-40 apresenta a segmentação cada um dos 723 miRNAs humanos (Agilent projeto ID 019.118) [30], como anotado na Sanger miRBase, liberação 10,1 [31]. Etiquetagem e hibridação de amostras de ARN total foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante. Cem ng de ARN total foi utilizado como uma entrada para a reacção de marcação, e toda a reacção foi hibridada com cada matriz durante 20 horas a 55 ° C. Os resultados foram analisados ​​usando Agilent GeneSpring GX7.3. controlos normais e amostras de cancro foram comparados utilizando o teste t de Welch (p 0,05) e miARNs expressos diferencialmente com pelo menos uma alteração de 2 vezes na expressão foram consideradas como potenciais biomarcadores. Todos os dados in-house de análise microarray de miRNAs foram depositados na Expressão Gênica Omnibus (GEO) com um número de acesso de GSE47610.

TaqMan® Quantitative PCR em Tempo Real Ensaio de miRNAs

A níveis de cada miARN expressão foram confirmados com TaqMan ® quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) utilizando iniciadores específicos e sondas individuais de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA). Resumidamente, 10 ng de ARN total foi transcrito de forma inversa com os iniciadores de haste-laçada específicos de miARN (Applied Biosystems), e a PCR foi realizada com o ADNc específico do RNA gerado na solução de ensaio de PCR TaqMan ® miARN em tempo real específico do gene numa StepOnePlus real-Time PCR System (Applied Biosystems). A reacção foi realizada a 95 ° C durante 10 min, seguido de 45 ciclos de 95 ° C durante 15 s, e 60 ° C durante 60 s. Todas as amostras foram medidos em triplicado, incluindo quaisquer controlos modelo. A normalização foi realizada com o pequeno U6 ARN nuclear (RNU6B; Applied Biosystems), e expressão relativa foi calculada usando o método comparativo Ct (limiar de ciclo). As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t pareado para comparar os níveis de expressão em pares combinados e teste de Tukey-Kramer para comparar os níveis de expressão entre várias doenças e outras análises foram realizadas pelo teste U de pares Mann-Whitney. O nível de significância foi fixado em p . 0,05

Next Generation Sequencing de miRNAs

análise de sequenciação de nova geração foi realizado usando Applied Biosystems sistema ™ sólidos e Kit RNA Expressão Pequeno ™ sólida de acordo com SOLiD ™ System 3 Guia do Utilizador (Applied Biosystems). A percentagem de pequenos ARN por massa de ARN total foi calculada pela Agilent Bioanalyzer 2100. O conteúdo de RNA pequeno foi enriquecida utilizando fracionamento flashPAGE ™ (Ambion), se necessário. As espécies de ARN pequenos (10-40 nt) foram então convertidos em bibliotecas de ADNc utilizando SOLiD Kit ™ pequeno ARN Expressão (Applied Biosystems), seguido por limpeza e selecção de tamanho por PAGE em torno ~105-150 pb. amplificação clonal em esferas com emulsão de PCR foi realizada utilizando o kit ™ ePCR sólida. grânulos preparados foram submetidos a verificação da qualidade de execução e depois foram sequenciados on Solid ™ 3 Analyzer. Total de 11,6-35.900.000 sequência leituras foram obtidas a partir de cada biblioteca, e análise a jusante foi realizada usando sólido pipeline ™ Sistema de Análise de RNA pequeno Ferramenta Pipeline (Corona RNA2MAP versão 0.50). Todas as leituras foram mapeadas sequencialmente contra (1) RNA ribossômico e RNA de transferência (2), sequências de referência conhecidos de miRNAs em Sanger miRBase Release 18, (3) montagem do genoma de referência humano hg19 (genoma de referência Consortium GRCh37), bem como humano genoma mitocondrial ( NC_001807.4). A soma do número de curto que lê mapeado para cada região de interesse foi normalizado ao total curto lê em cada amostra biblioteca, e utilizados como valores de expressão matérias da região correspondente mapeado-referência. Conservação e informações de repetição foi obtido usando o navegador da tabela Universidade da Califórnia em Santa Cruz. As amostras analisadas incluem 2 cânceres de laringe (T416, 66 yo do sexo masculino, T3N0; T506, 74 yo do sexo masculino, T3N2c) como amostras de câncer avançado e 3 papilomas da laringe (T421, 33 yo do sexo masculino, do início do adulto; T484, 33 yo do sexo masculino, do início do adulto; T502, 38 yo do sexo masculino, idade adulta) como amostras não-cancerosas. Todos os dados in-house de próxima geração de sequenciamento miRNAs foram depositados na DDBJ Sequence Leia Archive (SRA), com um número de acesso de PRJDB994.

In situ

Hibridização de miR-196a

O

detecção in situ

foi realizada em secções de parafina 4 mícrons de série incluindo mucosa normal e material de câncer de laringe de um yo 74 Paciente do sexo masculino submetidos à laringectomia total para a remoção completa do tumor T3 avançado. As secções foram desparafinadas e subsequentemente digerida com proteinase K (10 ug /ml) durante 5 min a 37 ° C. Após digestão com proteinase K, as secções foram fixadas em paraformaldeído a 4%, e as lâminas foram então hibridadas com 4 pmol de Exiqon miRCURY LNA sonda de detecção complementar a miR-196a em tampão de hibridação (formamida 50%, 5 × SSC, 0,1% de Tween, 9,2 ácido cítrico mM (pH 6), 50 ug /ml de heparina, e /ml de ARN de levedura 500 ng) durante a noite a 50 ° C. A e uma sonda RNU6B mexidos (Exiqon) também foram utilizados como controlos negativos e positivos, respectivamente. Em seguida, após a incubação com fragmentos de anti-DIG-AP Fab conjugado com fosfatase alcalina diluída a 1:50 em solução (Roche, Basileia, Suíça) durante 3 horas à temperatura ambiente o bloqueio, as sondas hibridadas foram detectadas através da aplicação de cloreto de tetrazólio nitroazul /5- bromo-4-cloro-3-indolil fosfato substrato de cor (Roche) para as lâminas. As lâminas foram contrastadas com nuclear rápido vermelho e analisados ​​utilizando um microscópio Nikon 55i ECLIPSE.

cultura de células e transfecção

carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) linhas de células, derivadas de língua (HSC- 2, 3-HSC, HSC-4), gengiva (SAS), da cavidade oral (Ca9-22), laringe (JHU-011) e da faringe (FaDu), foram todas mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de calor -inactivated de soro fetal bovino e 1% de penicilina-estreptomicina a 37 ° C em 5% de CO

2.

Para os ensaios de transfecção, as células foram transfectadas com apenas um dos inibidores de miR-196a ou inibidor de controlo negativo utilizando Lipofectamine ™ 2,000 reagente (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O controlo negativo foi inibidor baseado em C. elegans miARN e corresponde a CEL-miR-239b. O controle foi analisado por BLAST contra todas as sequências genómicas humanos, ratos e de camundongos e sequências de miRNA no banco de dados de sequência miRBase. Esta molécula tem um design e modificações como inibidores miRIDIAN microRNA que são conhecidos por sequências alvo de ARNm idênticos. Cada experiência foi efectuada em triplicado e os tempos de forma independente, pelo menos, 3.

A viabilidade celular e

células JHU-011 Ensaio de Citotoxicidade

foram plaqueadas numa placa de 24 poços a uma densidade de 2 × 10

4 células /poço e cultivadas durante 24 horas. Em seguida, as células foram transfectadas tal como descrito acima e a proliferação das células foi determinada por contagem celular directa a 0, 3 e 5 dias após a transfecção. Resumidamente, as células foram tripsinizadas e coradas com 0,4% de azul de tripano para medir a extensão de morte celular utilizando condessa ™ (Invitrogen). A contracoloração nuclear utilizando Hoechst 33258 também foi realizada para visualizar as células viáveis ​​aos 3 dias após a transfecção.

Além disso, a viabilidade celular e a citotoxicidade foi avaliada por atividades de protease diferencial utilizando MultiTox-Fluor Multiplex Ensaio de Citotoxicidade (Promega, Fitchburg, WI) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas a uma concentração de 5 × 10

3 células /poço numa placa de 96 procedimentos de transfecção e assim foram realizadas 24 horas após a sementeira. Em seguida, a actividade de a actividade de protease de células vivas e protease de células mortas foram medidos a 3 dias após a transfecção por adição de glicil-fenilalanil-aminofluorocoumarin (GF-AFC) ou bis-alanil-alanil-pnenylalanyl-rodamina 110 (bis-AAF-R110) quanto substratos peptídicos, respectivamente. As células foram incubadas durante 30 minutos a 37 ° C e a fluorescência resultante foi medido (fluorescência de células vivas 400

EX /505

EM; fluorescência de células mortas 485

EX /520

EM) para se obter as Unidades de fluorescência relativa (RFU).

laringe Cancer xenoenxertos Models

os experimentos foram realizados em macho de 6 semanas de idade camundongos BALB /c nu nu /nu. Os animais foram tratados e utilizados em conformidade com os protocolos aprovados pelo Comité de animal Cuidado e Uso de Keio University School of Medicine (Tóquio, Japão). Dez ratos foram divididos aleatoriamente em 2 grupos de 5 ratinhos. A eficácia do tratamento em ambos os tumores e suas metástases locorregional nódulo linfático foi examinada em cada um dos 2 grupos seguintes: Grupo 1, inibidor de miR-196a; Grupo 2, inibidor de controlo negativo (controlo). Os ratinhos foram anestesiados por injecção intraperitoneal de 5-7 mg tribromoetanol. tumores de xenoenxerto ortotópicos foram estabelecidos em torno do pescoço ao nível da laringe, por injecção subcutânea de 5 x 10 6 células JHU-011

com uma agulha de calibre 25. Após uma semana, os tumores foram medidos em três dimensões utilizando compassos de calibre, e, em seguida, quer inibidor de miR-196a ou controlo combinado com AteloGene ™ (Koken, Tóquio, Japão) (1 nmol /200 uL) foi injectado nos espaços subcutâneos em torno dos tumores. Tratamentos adicionais foram realizadas nos dias 13 e 19 dias após a inoculação de células tumorais e de medição periódica do tumor foi realizada até 12 semanas após a injecção. Os ratos foram submetidos à eutanásia e massas tumorais foram colhidas, em seguida, corte em 2 pedaços. Metade de cada tumor foi fixada em formalina a 10% tamponada neutra a noite, desidratados com o passo-a-passo de etanol e embebidos em parafina. metade residual do tumor foi saturada em ARN

mais tarde

® (Ambion) e armazenado a -80 ° C. Bilaterais dos gânglios linfáticos cervicais foram colhidas, snap-congelados e embebidos em parafina. coloração com Hematoxilina-Eosina foi realizada em amostras embebidas em parafina para análises histológicas. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o teste t para comparar o efeito terapêutico do inibidor de miR-196a contra o câncer de laringe

em

vitro

e

em

vivo

. O nível de significância foi fixado em p . 0,05

Resultados

Microarray Triagem de expressão alterada miRNA no câncer de laringe

Para identificar miRNAs desregulados em cancros da laringe, primeiro analisou o perfis de expressão de 723 miRNAs humanos maduros nos tecidos 5 laringe (3 cancros da laringe e 2 pares de laringe não cancerosas adjacentes) usando microarrays. Os resultados mostraram que 5 miARNs (miR-130b-5p (anteriormente designado como o miR-130b *), miR-196a, miR-455-3p, miR-455-5p, e miR-801) ou 2 miARNs (miR-133b e miR-145) foram significativamente regulada para cima ou para baixo-regulada, respectivamente, nos cancros da laringe (Figura 1A). Curiosamente, níveis de quer deixar-7 família, o miR-15, o miR-16, ou o miR-17-92 aglomerado, conhecida por estar associada com vários outros tipos de cancro de expressão, não eram obviamente diferente entre tecidos de cancro da laringe e outros tecidos não-cancerosas (figura 1B).

os conjuntos de dados são comparados entre cancros e contrapartidas não cancerosas adjacentes, conspirando a abundância de um determinado miRNA em um conjunto de dados contra o seu valor correspondente em outro conjunto de dados tanto em uma escala logarítmica. 723 miARNs humanos foram incluídos no microarray da Agilent. (A) Comparação entre os controlos normais e amostras de cancro demonstrada a sobre-regulação de 5 miARNs (miR-130b-5p, miR-196.º, miR-455-3p, miR-455-5p, e miR-801) e a jusante regulação de 2 miARNs (miR-133b e miR-145). (B) Os níveis de expressão de let-7 família, o miR-15, o miR-16, ou o miR-17-92 conjunto, conhecido por estar envolvido em vários outros cancros, não foi significativamente diferente entre os controlos e os cancros normais (

superior painel direito

e painéis

inferiores

). Os níveis de expressão de 723 miRNAs humanos também são mostrados (

parte superior do painel

esquerda).

Quantitative PCR em tempo real Validação de miRNA Expressão no câncer de laringe

Em seguida, para confirmar e validar os resultados obtidos a partir de nossa análise microarray, foi realizada a análise quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) (TaqMan® microRNA Ensaios, Applied Biosystems) usando 5 pares de cancros da laringe primária e seus tecidos não cancerosos correspondentes. Embora a análise de microarray revelou-regulação de 5 miARNs e sub-regulação de 2 miARNs, miR-801 é agora considerada como um fragmento de ARN spliceosomal U11 e removido do miRBase [31]. miR-145 também foi excluída dos estudos adicionais, uma vez que foi relatado para ser frequentemente regulados negativamente em cancros em múltiplos órgãos, incluindo o cancro da próstata [32], o cancro da mama [33], o cancro da bexiga [34], o cancro do cólon [35 ], [36], do cancro do ovário [37], o cancro esofágico [38], o cancro do pulmão [39], [40], cancro da nasofaringe [41], o cancro gástrico [42], bem como malignidades de células-B [43] e considerado como sendo não um biomarcador adequado para o cancro da laringe.

miR-455-5p em vez de miR-455-3p foi usado em estudos posteriores, pois miARNs 3p e 5p são geradas a partir de ambos os lados do mesmo precursor -tronco para ter sequências similares e recente relatório sugeriu o envolvimento potencial do miR-455-5p na progressão do cancro [44]. Assim, a análise de qRT-PCR foi realizada em 4 miARNs residuais (isto é, o miR-130b-5p, miR-196a, miR-455-5p, e miR-133b). Os níveis de expressão destes miRNAs foram comparadas entre 5 tecidos de câncer e seus tecidos não cancerosos adjacentes. Os resultados foram consistentes com os obtidos a partir de análises de microarray, especialmente quando amostras emparelhadas foram comparadas nos mesmos pacientes (Figuras 2A e B). maiores níveis de expressão de miR-130b-5p foram observados em tecidos de câncer em comparação com controles vizinhos em 4 de 5 pares. Além disso, os níveis de miR-196a e miR-455-5p expressão foram significativamente mais elevados em tecidos de cancro, quando comparado com controlos vizinhos (miR-196a, p = 0,0460; miR-455-5p, p = 0,0286) (Figura 2a), embora nível de miR-133b expressão foi significativamente menor em amostras de câncer em comparação com os controles (p = 0,0274) (Figura 2B).

expressões relativas de miRNAs associados ao câncer de laringe em 5 amostras pareadas foram medidos por TaqMan® qRT- análise de PCR e mostrado em

esquerdo painéis

. Os níveis de expressão em contrapartes não-cancerosas adjacentes (SAE) em cada par são ajustados para ser 1 em

painéis direitos

para visualização clara da diferença vezes significativa em cada miRNA. Os dados são expressos como valores médios com desvio padrão. (A) a regulação positiva de 2 miARNs (MIR-196.º e miR-455-5p) foi confirmada nos cancros quando cancros 5 foram comparados com os seus NCs. *,

p Art 0,05. (B) miR-133b foi regulada para baixo em cancros em todos os 5 pares combinados. Foram observadas diferenças estatisticamente significativas dos níveis de miR-196a, miR-455-5p e miR-133b expressão entre pares combinados. *,

p

. 0,05

Assim, destes 4 miRNAs, 3 miRNAs (ie, miR-196a, miR-455-5p e miR-133b) mostraram significativamente diferentes níveis de expressão em tecidos de cancro, quando comparado com os tecidos de controlo correspondentes e mais de quantificação miARNs foi realizada utilizando 48 amostras de laringe. Estas amostras incluiu 5 homólogos não cancerosos, 14 lesões benignas (pólipo, nódulo, polipóide, ou hiperqueratose), 12 displasias e 17 cânceres de laringe. Quando foram estudados 48 amostras, o nível de miR-455-5p expressão foi significativamente maior em comparação com cancros homólogos não cancerosas adjacentes e tecidos benignos da laringe (p = 0,0113). Além disso, o nível de expressão de miR-196a era claramente superior em tecidos de cancro comparativamente com outros tecidos não cancerosos (homólogos não cancerosas adjacentes e tecidos benignos da laringe, p = 0,0003; displasias, p = 0,0040) (Figura 3A). Embora o miR-133b mostraram níveis de expressão significativamente mais baixos quando amostras de cancro foram comparados com tecidos da laringe não cancerosos correspondentes (Figura 2B), o nível deste miARN expressão não foi significativamente inferior em amostras de cancro, quando comparados com não cancerosas outros tecidos (homólogos não-cancerosas e tecidos benignas da laringe, p = 0,8353; displasias, p = 0,2185) no estudo usando amostras múltiplas (Figura 3B)

(a) os níveis de expressão de miR-455-5p e miR-196a foram medidos por qRT-PCR TaqMan ®. usando 48 amostras de tecido. tecidos não cancerosos adjacentes (contrapartes não-cancerosas, a SAE) são mostrados como pátios abertos. foi observada significativa aumento da regulação do miR-455-5p em cancros em comparação com NCS e amostras benignas. Os níveis de expressão de miR-196a foram significativamente mais elevados em tecidos de cancro, quando comparado com qualquer CNs e amostras benignas ou displasia amostras pré-cancerosas. As barras indicam o valor médio de cada grupo. *,

p Art 0,05. os níveis de (B) a expressão de miR-133b foram também examinados em múltiplas amostras. Embora a expressão relativamente mais baixa foi observada em cancros, as diferenças não foram estatisticamente significativas quando comparadas com outros grupos. As barras indicam o valor médio de cada grupo. *,

p

. 0,05

Portanto, para continuar a explorar o significado de miR-196a como um biomarcador promissor para o câncer de laringe, análise de qRT-PCR de miR-196a foi realizada em 84 amostras histologicamente verificados (15 contrapartes não cancerosos, 24 doenças benignas, 18 displasias, 27 cancros da laringe) e 7 linhas de células de carcinoma epidermóide. O estudo mostrou que o aumento da tendência do nível de expressão de miR-196a foi observado quando as amostras de cancro foram comparados com os seus homólogos não cancerosos, tecidos benignos ou displasias (Figura 4A). A expressão de miR-196a em cancros foi significativamente mais elevada do que as suas correspondentes amostras emparelhadas (p = 0,005) e também foi evidente em linha celular de cancro da laringe células JHU-011 (dados não apresentados). Além disso, encontramos a expressão de miR-196a foi significativamente maior no cancro avançado do que o câncer precoce (p = 0,0045; Figura 4B,

esquerdo do painel

), e também em câncer precoce de displasia pré-cancerosa (p = 0,0263; Figura 4B,

painel direito

). Juntamente com estes resultados, miR-196a pode ser um marcador favorável para o câncer de laringe.

(A) A importância do miR-196a como um biomarcador promissor para o câncer de laringe foi confirmada por TaqMan® qRT-PCR utilizando 84 tecido amostras. O ensaio também incluiu 7 linhas de células de carcinoma epidermóide. contrapartes não cancerosos (SAE) são mostrados como pátios abertos. As barras indicam o valor médio de cada grupo. (B) O nível de expressão de miR-196a foi maior em cancros avançados (T3 e T4) em comparação com cancros precoces (T1 e T2) (

esquerdo do painel

). Além disso, observou-se significativamente mais elevado nível de expressão de miR-196a em amostras precoce do câncer de T1a em comparação com amostras de displasia pré-cancerosas (

direito painel

). As barras indicam o valor médio de cada grupo. *,

p

. 0,05

diferença qualitativa de isomiRs miR-196.º revelados por Deep Sequencing

A recente advento da tecnologia de sequenciação profunda revelou que existem geralmente variações em sequências de miARN maduros como cunhado com o termo “isomiR” [45]. Tais variações são causadas principalmente por uma mudança de locais de clivagem quando miRNAs maduros são processados ​​por Drosha e Dicer, mas também são introduzidos por adições de nucleótidos terminais ou de edição de RNA interno. Embora significados fisiológicos para a diversidade de isomiR permanecem ainda desconhecidos, que se acumulam evidências sugerem que existe preferência desenvolvimento /específico de tecido no espectro de isomiRs.

Assim, para explorar a possível heterogeneidade nos perfis de isomiRs miR-196.º expressão entre câncer de laringe e tecidos não-cancerosas, análise de sequenciação profunda de RNA pequeno foi realizado usando sólido sistema Applied Biosystems (Kamimoto T et al., manuscrito submetido). Existem dois genes distintos para miR-196a, ou seja,

mir-196a-1 Restaurant at chr17 e

mir-196a-2 Restaurant at chr12, e seus transcritos miRNAs maduros compartilhar o mesmo ‘braço 5 *,

p Art 0,05. *,

p Art 0,05. *,

p Art 0,05. *,

p Art 0,05.