Abstract
Fundo
O (COL11A1) gene collagen11A1 é overexpressed em câncer pancreático. A expressão da proteína COL11A1 poderiam estar envolvidos em eventos desmoplásicos em câncer pancreático, mas um anticorpo que cora especificamente a proteína COL11A1 não está actualmente disponível.
Métodos e resultados
Um total de 54 ductal pancreático adenocarcinomas (PDAC), 23 de pancreatite crônica (CP) amostras, e células do estroma peritumoral cultivadas de PDAC (passagens 3-6) foram estudados. amostras de tecido do pâncreas humano normal foram obtidos através de um programa de doação de órgãos de doador falecido.
1) Validação de COL11A1 gene sobre-expressão por q-RT-PCR. Resultados:. A expressão do gene COL11A1 é aumentado significativamente em amostras PDAC vs. amostras normais e CP
2) Análise do COL11A1 por imuno-histoquímica utilizando anticorpos altamente específicos anti-proCOL11A1. DADOS:. Manchas anti-proCOL11A1 estromais células /associados ao câncer fibroblastos (FAC) de PDAC mas não manchar condição crônica benigna (pancreatite crónica) células estromais, células epiteliais ou fibroblastos normais
3) Avaliação de a capacidade de discriminação do anticorpo. Resultados:. Anti-proCOL11A1 imunocoloração com precisão discrimina entre PDAC e CP (AUC 0,936, IC 95% 0,851, 0,981)
4) Caracterização fenotípica de proCOL11A1 + células estromais co-coloração com marcadores mesenquimais, epiteliais e células estreladas sobre amostras de tecido pancreáticas e células estromais do cancro do pâncreas peritumorais cultivadas. Resultados: células ProCOL11A1 + presentes co-coloração com mesenquimais, estrelado e marcadores epiteliais (EMT fenótipo) em diferentes proporções
Conclusões /Significado
Detecção de proCOL11A1 através de imunocoloração com este anticorpo recém-desenvolvida permite. uma distinção precisa entre PDAC e CP. Ao contrário de outros anticorpos disponíveis vulgarmente utilizados para detectar FAC, anti-proCOL11A1 é negativo em células estromais de pâncreas normal e quase ausentes na inflamação benigna. Estes resultados sugerem fortemente que proCOL11A1 é um marcador específico para FAC e, portanto, anti-proCOL11A1 é uma nova e poderosa ferramenta para pesquisa de câncer e diagnósticos clínicos
Citation:. García-Pravia C, Galván JA, Gutiérrez-Corral N, Solar-García L, García-Pérez E, García-Ocaña M, et al. (2013) sobre-expressão de COL11A1 pelo cancro-associados fibroblastos: Relevância clínica de um marcador estromal em cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (10): e78327. doi: 10.1371 /journal.pone.0078327
editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigações Oncológicas (CNIO), Espanha |
Recebido: 28 Abril 2013; Aceito: 11 de setembro de 2013; Publicação: 23 de outubro de 2013
Direitos de autor: © 2013 García-Pravia et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Esta pesquisa foi co-financiado por fundos do FEDER do EuropeanUnion; por INNPACTO-ONCOPAN IPT-010000-2010-31 Projeto; por Fiss-09- PS09 /01.911 Project, Ministério da Ciência e Inovação, Espanha; pelo FC-11-PC10-23 Project, FICYT, Machado 1 do FEDER Programa-Quadro Operacional 2007-2013 do Principado das Astúrias, Espanha; e por Progenika Biopharma, S.A. e Oncomatrix, S.L. Derio, Espanha. O mAb proCOL11A1 foi patenteada pela Oncomatrix, S.L. (PCT /ES2012 /070616; WO 2013/021088 A2). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. O anticorpo descrito neste estudo está em uma patente depositada pelos Drs. Luis Barneo, Carmen García-Pravia, Juan R. de los Toyos, Marcos García-Ocaña, Jokin Del Amo-Iribarren, Laureano Simón-Buela e outros intitulado: MÉTODOS E PRODUTOS PARA DIAGNÓSTICO IN VITRO, IN VITRO prognóstico e desenvolvimento de medicamentos CONTRA INVASORAS carcinomas (PCT /ES2012 /070616; WO 2013/021088 A2). Jokin Del Amo-Iribarren trabalha para Progenika Biopharma, S.A. e Laureano Simón-Buela trabalha para Oncomatrix, S.L. Este estudo foi parcialmente financiado pela Progenika Biopharma, S.A. e Oncomatrix, S.L. Não existem outras patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) representa a quarta principal causa de morte por câncer em homens e mulheres. A taxa de sobrevida em 5 anos é inferior a 5% e tempo médio de sobrevivência é de 6 meses após o diagnóstico inicial. Mesmo em pacientes que se submetem à ressecção, as taxas de sobrevivência a longo prazo permanecem extremamente pobre [1]. No presente momento, não existem métodos de diagnóstico precoce ou terapias eficazes para o uso contra este tipo de tumor. Apesar do progresso que tem sido feito em seu diagnóstico e tratamento, o câncer de pâncreas continua a ter o pior prognóstico de todos os tumores malignos sólidos. O câncer de pâncreas é o paradigma da doença neoplásica avançada: independentemente do estádio TNM, a maioria dos pacientes apresentam doença disseminada nas primeiras fases [2]. Além disso, o cancro do pâncreas é resistente à quimioterapia e à radioterapia [3].
carcinoma do pâncreas é caracterizada por uma reacção envolvendo desmoplásica componentes celulares e acelulares, tais como fibroblastos (repouso ou activadas), miofibroblastos, pericitos, estreladas pancreático células, células do sistema imunológico, os vasos sanguíneos, a matriz extracelular e proteínas solúveis, tais como citoquinas e factores de crescimento [4,5]. Este estroma heterogénea influencia vários aspectos da PDAC e parece promover o crescimento do tumor, invasão e resistência à quimioterapia [6-9].
A pancreatite crônica é uma doença inflamatória caracterizada pela destruição irreversível e progressiva do órgão, resultando em exócrina e endócrina insuficiência. O parênquima perdido é substituído por tecido fibroso denso, com infiltração de leucócitos e hiperplasia ductular. pancreatite crônica aumenta significativamente o risco de desenvolver cancro do pâncreas [10-12], o que sugere que a inflamação crônica no pâncreas pode ser um fator predisponente ao desenvolvimento de câncer. A ligação causal entre inflamação crônica e câncer foi descrita há dois séculos por Marjolin [13], mas os mediadores inflamatórios que levam ao desenvolvimento de câncer permanecem indefinidos.
Entre os colágenos da matriz associadas a tumores, colágenos fibrilares são o mais conspícuo. Colagénios são sintetizados como procolagénios por fibroblastos. Estes procolagénios ter um domínio principal em hélice tripla central, designado como α1, α2 e α3, e codificadas por sequências de genes específicos. Uma vez segregada para o meio extracelular, estes procolagénios são clivados, e, em seguida, as moléculas de colagénio maduras montar extracelularmente em fibrilas. Em tecidos normais, colagénio dos tipos I, II e III são os principais principais colagénios fibrilares, enquanto colagénios V e XI são menos abundantes colagénios fibrilares menores [14]. Colagénios V e XI partilham uma homologia de 75% ao seu nível sequência de aminoácidos. Procolagénios α1 de tipos V e XI são codificados por genes COL5A1 e COL11A1, respectivamente.
Estudos dos fibroblastos na vizinhança do tumor, os chamados fibroblastos associados ao câncer (CAF), têm demonstrado o seu papel na estimulação da progressão do tumor [15-20]. As características dos FAC foram investigadas em profundidade, mostrando que a sua expressão, o padrão de crescimento, comportamento migratório genotípica e a secreção de factores de crescimento diferentes das dos fibroblastos normais [15,21]. No entanto, os investigadores não têm ferramentas específicas para diferenciar FAC de fibroblastos inflamatórias. Vimentina (VIM) e actina de músculo liso alfa (αSMA) são muitas vezes utilizados para identificar FAC, mas estes marcadores biológicos não são específicos, visto que mancha os fibroblastos e outras células inflamatórias bem. Nós já identificou 116 genes que foram sobre-expressos em PDAC usando microarranjos de DNA [22] (ver S2 Arquivo). Encontramos genes da matriz extracelular, cuja expressão foi aumentado em comparação com pancreatite normal e crônica (PB) tecidos. Um dos genes mais significativamente e consistentemente sobre-expressas foi COL11A1 (Tabela S1 S1 no ficheiro). Dada a ausência de um anticorpo comercial fiável, geramos um anti-soro policlonal de coelho para um trecho de aminoácidos altamente específica de proCOL11A1 humano, a fim de avaliar o nível de proteína expressa no cancro pancreático [23]. Posteriormente, foi desenvolvido um anticorpo monoclonal [24], altamente específico para proCOL11A1 humana, que marca claramente estas células do estroma peritumoral.
Neste estudo, tentou confirmar a superexpressão do gene COL11A1 no PDAC. Além disso, foi avaliada a utilidade clínica do imunodetecção de proCOL11A1 em tecidos PDAC e CP. Finalmente, nós exploramos as características fenotípicas de células COL11A1 expressando dentro do estroma pancreático.
Materiais e Métodos
As características dos pacientes e amostras de tecido
Os estudos imuno-histoquímica com anti-proCOL11A1 pAb foram realizados em 54 e 23 de PDAC CP (20 alcoólica, 2 auto-imune, uma biliar) amostras históricas embebidos em parafina obtidos a partir de espécimes cirúrgicos de pacientes submetidos a cirurgia no Hospital Universitário Central de Astúrias, Oviedo, Espanha. A idade média dos pacientes com PDAC foi de 65 ± 9 anos (46-81 anos) e, 56 ± 12 anos (25-73 anos) dos pacientes com CP. A razão de sexo (M /F) foi de 37/17 para os pacientes PDAC, enquanto a predominância do sexo masculino foi ainda maior nos pacientes com PC (22/1). (.. Cancer AJCC manual Staging 7ª ed 2010) a distribuição de estágio do tumor PDAC acordo com a classificação TNM foi: IA, 13%; IB, 17%; IIA, 19%; IIB, 37%; III, 6%; IV, 9%. A classificação foi neoplásica: G1, 20%; G2, 66%; G3, 12%; G4, 2%. O mAb anti-proCOL11A1 foi aplicado a 69 (51 PDAC e 18 CP) dos casos anteriores. Recentemente removido PDAC, CP e amostras de tecidos normais pâncreas foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido na sala de cirurgia e armazenadas a -80 ° C até o processamento. As amostras normais pâncreas humano tecido foram obtidos por meio de um programa de doação de órgãos de cadáveres (6 casos, todos os 41-76 anos de idade) do sexo masculino e foram utilizados para q-RT-PCR. Amostras frescas foram usadas para isolar e cultivar os fibroblastos. estudos Q-RT-PCR foram aplicados em amostras PDAC e CP congelados. Este estudo está em conformidade com a Declaração de Helsinki e foi aprovado pelo comitê de ética do Hospital Universitário Central de Astúrias (Projeto n ° 42/12). Todos os pacientes assinaram o termo de consentimento que manifestaram vontade de participar e sua compreensão do processo e objectivo geral do estudo.
RT-PCR quantitativo de COL11A1
O RNA total foi isolado a partir de biópsias pâncreas, usando TRIzol reagentes (Life Technologies), e o ADNc foi sintetizado com a enzima transcriptase reversa Superscript II ARNase (Life Technologies). Todas as reacções de PCR foram realizados em duplicado num LightCycler 2.0 (Roche) utilizando o mestre de ADN FastStart SYBR Green I kit (Roche). As sequências dos iniciadores eram as seguintes: COL11A1 (gene alvo): para a frente 5 ‘TGGTGAT CAGAATCAGAAGTTCG 3’, reverso 5 ‘AGGAGAGTTGAGAATTGGGAATC 3’; proteína ribossômica L10 (gene de referência): para a frente 5 ‘TGCGATGGCTGCACACA 3’, inverta 5 ‘TCCCTTAGAGCAACCCATACAAC 3’. A eficiência das reacções de PCR foi calculada usando as curvas de referência com diluições em série de ADNc. As razões entre os valores de expressão de genes normalizados foram determinados usando a equação quantificação relativa, que corrige as diferenças de eficiência da PCR [25]. Finalmente, os dados de expressão gênica foram comparados entre amostras de tumores e de controle usando o teste de Mann-Whitney.
policlonal de coelho anti-soro para a região variável de procolágeno humano 11A1 (anti-proCOL11A1 PAB)
anteriormente descrita a geração de este anti-soro [23]. Resumidamente, após a proteína de fusão COL11A1-TGST recombinante foi construído, expresso e purificado, um coelho branco da Nova Zelândia foi injectado por via intramuscular a intervalos de 2 semanas com 2 ml de emulsão imunogénio da proteína de fusão COL11A1-t-GST purificado (ver arquivo S2). O anti-soro obtido por punção cardíaca foi empobrecido da reactividade anti_GST. A fração IgG foi purificado usando Protein ASepharose.
Mouse anticorpo monoclonal para procolágeno humano 11A1 (proCOL11A1-anti mAb)
A metodologia para gerar o anticorpo proCOL11A1 monoclonal anti-humana e para a caracterização dos mesmos foi publicada [24]. Em resumo, a proteína de fusão COL11A1-t-GST purificada foi usada para hyperimmunize ratinhos BALB /c. Usando células Sp2 /0 de mieloma de células como parceiro de fusão, os hibridomas de células B foram gerados por métodos convencionais. O anticorpo, DMTX1, foi fornecido pela Oncomatrix, SL, Derio, Espanha (Ref # P0002, lote # 200212).
estabelecimento de culturas de células
As amostras foram obtidas a partir da área do tumor, peritumoral área e área normal utilizando diferentes lâminas cirúrgicas para evitar a contaminação. alíquotas representativos foram examinados histologicamente. As amostras foram transportadas em meio RPMI-1640 (Gibco, Invitrogen) suplementado com amicacina e vancomicina (Normon Laboratories, Madrid, Espanha, tanto a 40 ug /ml) para o laboratório de cultura de onde eles foram cortados em fragmentos menores usando tesouras cirúrgicas. Os fragmentos obtidos foram enzimaticamente digeridos com colagenase (tipo I a 2 mg /ml, Sigma) durante 1-2 horas. Após a digestão, a solução de colagenase foi centrifugado a 400 g durante 10 minutos. O sedimento foi ressuspenso num meio de cultura de fibroblastos (meio de Eagle modificado por Dulbecco (Gibco, Invitrogen) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (FCS, Gibco, Invitrogen), amicacina e vancomicina (ambos a 40 ug /ml). Os fragmentos de tecido que não tinha sido digerido com colagenase foi submetido a uma segunda digestão com tripsina a 0,05% e EDTA a 0,02% (T /e, Gibco, Invitrogen, Barcelona, Espanha) durante 30-60 minutos. O T removido /e foi inactivada com meio de cultura contendo soro (DMEM + 10% FCS) e centrifugado a 400 g durante 10 minutos. O sedimento foi ressuspenso em meio de cultura de fibroblastos. As células obtidas a partir de digestão com colagenase e tripsina digestão foram semeadas em placas de seis poços, utilizando meio de cultura de fibroblastos e mantida a 37 ° C numa incubadora de CO2 a 5%. o meio foi trocado a cada 3 dias. Quando a cultura primária foi confluentes, as células foram lavadas duas vezes com PBS e tratadas com T /e até que eles foram separadas. em seguida, o T /e foi neutralizada com cultura meio e centrifugado a 400 g durante 10 minutos para recuperar as células. Todas as células do estroma foram usadas nas primeiras passagens (3-6 passagens). A pureza celular de células do estroma foi avaliada pela morfologia e por imunocoloração para vimentina.
A imuno-histoquímica e imuno duplo na ressecção tecido pancreático
O tecido obtido a partir das amostras de pâncreas foi fixado em um formol a 10% solução, embebidos em parafina, corte 3 mm de espessura e corados com H e para exame histológico. A recuperação de antígenos foi realizada por aquecimento das amostras em
PTLink
(DakoCytomation, Dinamarca) em solução tampão a pH elevado durante 20 minutos. A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com
peroxidase reagente bloqueador
(DakoCytomation, Dinamarca) durante 5 minutos. As amostras foram incubadas a 37 ° C com os anticorpos primários descritos na Tabela 1, incubadas com o EnVision HRP Flexsystem (DakoCytomation, Dinamarca) durante 30 minutos à temperatura ambiente, e coradas com DAB (3-3′-diaminobenzidina) (DakoCytomation, Dinamarca) durante 10 minutos. Finalmente, elas foram contrastadas durante 10 minutos com hematoxilina (DakoCytomation, desidratadas e montadas em Entellan® (Merck, Alemanha) AntiproCOl11A1 pAb foi ensaiada em 1:.., 2000 em tampão de S2022 (Dako)
anticorpos primários (espécies)
Clone
referência comercial
diluição
O tempo de incubação (min)
ProCOL11A1 (mAb) 1E8.33 (DMTX1) Oncomatrix1: 40030ProCOL11A1 (pAB) Oncomatrix1.200030Alpha-actina de músculo liso (mAb) 1A4Dako, DenmarkR-t-U20Desmin (mAb) D33Dako, DenmarkR-t-U20GFAP (mAb) GA-5Biogenex, The Países Baixos1: 20020Citokeratin 7 (mAb) OV-TL 12 /30Dako, DenmarkR-t-U20Vimentin (pAB) C-20Santa Cruz Biotech , Germany1:. 60010Table 1. os anticorpos utilizados na análise imuno-histoquímica
(pAB) Rabbit Polyclonal, (mAb) monoclonal mouse, RTU pronto para uso CSV Baixar CSV
para avaliar a co-expressão de Pro-Col11A1 com mesenquimais (αSMA e VIM), epitelial (CK7) e células estreladas pancreático (desmina, glial fibrilar ácida marcadores Protein-GFAP-), dupla imunomarcação foi realizada utilizando o ultra-view kit de detecção de fosfatase alcalina Universal Red (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ) como o vermelho cromógeno e DAB como cromógeno marrom. Anteriormente, as amostras foram incubadas a 37 ° C com os anticorpos primários descritos na Tabela 1.
Immunocytofluorescence de células do estroma cultivadas e Microscopia Confocal
As células foram fixadas em acetona (-20 ° C ) durante 10 minutos na câmara de slides. As células foram secas à temperatura ambiente e, em seguida, foram introduzidos no tampão de lavagem (Dako) durante 30 minutos. As amostras foram incubadas com o proCOl11A1 mAb anti-(DMTX1, Oncomatrix) com Cytokeratin 7 (CK7) e anticorpo VIM, à temperatura ambiente, nas condições especificadas na Tabela 1. Os anticorpos secundários utilizados foram anti-coelho verde Alexa- 488 (1: 500, Invitrogen) e vermelho anti-coelho Alexa-546 (1: 500, Invitrogen), durante 1 hora à temperatura ambiente. Finalmente, as secções foram montadas com meio de montagem contendo DAPI (Vector Labs).
O co-localização (proCOL11A1 vs. VIM, proCOL11A1 vs. CK7, proCOL11A1 vs. αSMA e VIM vs. CK7) foi visualizado e fotografado usando um microscópio confocal Leica SP2 TCS com 63X e 100X objetivos de imersão em óleo, utilizando o seguinte fontes de iluminação para cada excitação fluorocromo:. Argon /Krypton laser (488 nm), Hélio /laser de néon (546 nm) e Diode azul-violeta (405 nm)
PDAC vs. avaliação CP imunohistoquímica
a avaliação foi levada a cabo em quatro regiões seleccionadas como as melhores representantes da reacção desmoplásica. Casos que apresentaram 4 campos positivos através da objetiva de 10X foram atribuídos a pontuação máxima de 4, enquanto os campos negativos foram atribuídos a pontuação mínima de 0. Para a avaliação de coloração, um campo 20X na maior área com a coloração mais intensa ( “hot spot “) foi escolhido. Casos com células positivas menos de 1% em relação à superfície do estroma foram atribuídos uma pontuação de 0, casos com entre 1 e 10% foram atribuídos uma pontuação de 1, casos com entre 10% e 50% foram atribuídos uma pontuação de 2, e com as células positivas casos mais do que 50% foram atribuída uma pontuação de 3. a variação total na coloração foi definida através da multiplicação do número de campos positivos (0-4) pela intensidade de coloração da área (0-3), obtendo-se uma pontuação total de 0-12. A marcação foi duplo-cego marcado por dois patologistas (CGP e JGG). Uma série de 24 PDAC e 16 CP imunocoradas lâminas também foram quantificadas por meio do programa de análise de imagem QWin (Leica), a fim de compará-los com as notas dos patologistas. Imagens da maior área com a coloração mais intensa foram tomadas através da objectiva 20X de um microscópio Olympus BX61 e gravados em uma câmera Olympus DP70.
Os dados estatísticos de análise
Assumindo variâncias desiguais, aplicamos Welch o teste para determinar a significância das diferenças nos dados de imagem entre PDAC e amostras de pancreatite crónica. O teste ANOVA foi também aplicado. A correlação entre os vários parâmetros de imagem foi avaliada através do teste de correlação de Spearman Rank. A sensibilidade e especificidade do proCOL11A1 foi descrita como uma análise das características de operação do receptor (ROC). foi calculada a precisão (isto é, casos corretamente classificados). A posição do corte na curva irá determinar o número de verdadeiros positivos, verdadeiros negativos, falsos positivos e falsos negativos. O valor de critério é o de corte correspondente à mais alta precisão (mínimo de falsos negativos e falsos resultados positivos). O tamanho da amostra utilizado em nosso estudo imuno-histoquímico (n = 77) permitiu-nos alcançar significância estatística (alfa = 0,05) para uma AUC = 0,9 sob a hipótese nula de uma AUC = 0,5, com um poder estatístico de 90%. Todas as análises foram realizadas utilizando o Statistical Package for the Social Sciences (SPSS 13) ou MedCalc v9.4.1.0.
Resultados
Q-RT-PCR de COL11A1 e imuno-histoquímica de tecidos pancreáticos com anti-proCOL11A1
pancreáticas células cancerosas expressam níveis elevados de ARNm de COL11A1, como demonstrado por RT-PCR quantitativo (figura 1). Os resultados confirmaram um aumento significativo da expressão do gene COL11A1 em amostras PDAC vs. amostras normais e CP (dobre mudança: 174; SLR: 7)
Todas as amostras PDAC testados com anti-proCOL11A1 mAb e. com antiproCOL11A1 pAb mostraram forte marcação intracitoplasmática da FAC estromais desmoplásicos-em torno do tumor (Figura 2E; Figura s1d no arquivo S1). A coloração não foi generalizada, mas sim localizadas em áreas peritumorais restritas, mesmo onde as células tumorais não foram vistos. As características morfológicas destas células estromais fibroblasto foram compatíveis com os de miofibroblastos (Figura LES, F em S1 Arquivo). coloração extracelular não foi observado. Em contraste, a expressão de proCOL11A1 em amostras de pancreatite crônica era ou ausente (Figura 2A; Figura S1B em S1 Arquivo) ou muito baixo e restrito a poucas células estromais. CP estroma mostrou alterações fibróticas e inflamatórias sem população miofibroblástica notável. pâncreas normais e células tumorais epiteliais, por outro lado, não mostraram qualquer coloração em todos com o anti-proCol11A1 (Figura S2 no ficheiro S1). pâncreas normais apresentaram coloração com VIM e αSMA, mas não manchar com GFAP. A maioria dos CP (Figuras 2C, D) e PDAC (Figuras 2G, H) células estromais mostraram forte coloração intracelular com VIM e αSMA. A coloração com desmina foi intensa no PDAC amostras (Figura 2F), mas inexistente na CP (Figura 2B) amostras. Figura S3 no ficheiro S1 mostra coloração positiva com o mAb anti-proCOL11A1 (pontuação 4) e desmina, num caso de pancreatite auto-imune; Além disso, a intensa positividade com VIM e αSMA, e negatividade com GFAP é observado.
As células estromais em CP foram negativos para proCOL11A1 anti-mAb (A) e desmina (B), enquanto que um número substancial de células estromais de PDAC expressa mAb anti-proCOL11A1 (e) e desmina (F). Na CP e PDAC a mancha de células estromais para αSMA (C e G, respectivamente) e VIM (D e H, respectivamente) foram difusas e não selectivo. Anti-proCOL11A1 mAb (A e E), desmina (B e F), αSMA (C e G) e VIM (D e H) (todas as fotomicrografias com × 400, Barra de escala 50 mm).
Caracterização da FAC pancreáticas
para caracterizar as FAC, cortes de tecidos pancreáticos foram duplamente coradas para proCOL11A1 /desmina, proCOL11A1 /αSMA, proCOL11A1 /VIM, proCOL11A1 /GFAP, proCOL11A1 /CK7 e CK7 /VIM (Figura 3 ). Um número muito elevado de células mesenquimais foram fortemente marcado para VIM e αSMA. Imunocoloração com GFAP foi negativa. Como proporção um pequeno número de células foram proCOL11A1 + e desmina +. Co-coloração de VIM ou CK7 com proCOL11A1 identificado um subconjunto de FAC com o fenótipo mesenquimal (proCOL11A1 + /+ VIM) e muito poucas células com o fenótipo epitelial (proCOL11A1 + /+ CK7) (Figuras 3 e E, respectivamente). Algumas células desmina ou αSMA co-coradas com proCOL11A1 (Figura 3 A e B, respectivamente). No entanto, as amostras de CP do estroma não apresentaram coloração com proCOL11A1, desmina ou a GFAP, e não houve co-coloração (Figura 4).
A, anti-proCOL11A1 (castanho)
vs. desmina (magenta); B, anti-proCOL11A1 (marrom)
vs
. αSMA (magenta); C, anti-proCOL11A1 (marrom)
vs
. VIM (magenta); D, anti-proCOL11A1 (marrom)
vs
. GFAP (não coloração); E, anti-proCOL11A1 (marrom) vs. CK7 (magenta); F, CK7 (células de tumor epitelial:
marrom) vs. VIM (magenta) (todas as fotomicrografias com × 200, Barra de escala de 200 m; inserção X1000).
A, anti-proCOL11A1 (marrom)
vs
. desmina (magenta); B, Anti-proCOL11A1 (marrom)
vs
. αSMA (magenta); C, anti-proCOL11A1 (marrom)
vs
. VIM (magenta); D, anti-proCOL11A1 (marrom)
vs
. GFAP (não coloração); E, anti-proCOL11A1 (marrom) vs. CK7 (magenta); F, CK7 (células de tumor epitelial:
marrom) vs. VIM (magenta) (todas as fotomicrografias com × 200, Barra de escala de 200 m).. .
A distribuição das células da FAC em cultura foi analisada por co-localização com immunocytofluorescence. Os dados resultantes estão apresentados na Tabela 2 (Figura 5). A interpretação da tabela é a seguinte: quando uma dupla coloração foi aplicado aos FAC pancreáticas cultivadas, por exemplo proCOL11A1 e CK7, um total de 188 células foram coradas; Destes, 82 células foram marcadas com anti-proCOL11A1, 60 células foram CK7 positiva, e 46 células foram coradas com ambos os anticorpos. O mesmo se aplica a lógica para o resto das colorações. De acordo com os dados apresentados na Tabela 2, entre as células proCOL11A1, 36% são CK7 +, 49% são VIM + e 48% são αSMA +; Entre as células com o fenótipo VIM, 21% são proCOL11A1 + e apenas 8% são CK7 +; 33% de células αSMA dividir o fenótipo proCOL11A1; e, por último, 45% das células CK7 têm a VIM + fenótipo e 43% têm o fenótipo proCOL11A1. A distribuição dos fenótipos proCOL11A1, CK7 desmina e em amostras de tecidos é mostrada na Tabela S2 em S1 Ficheiro. Não foi possível fazer uma análise dos campos em que as células são VIM + e + αSMA devido ao elevado número de células coradas, o que complica a individualizar e contá-las. De acordo com os dados apresentados na Tabela S2 no ficheiro S1, 18% das células são proCOl11A1 CK7 +, e 21% são desmina +; 45% dessas células coradas com desmina têm o fenótipo proCOL11A1, e 50% das células são CK7 proCOL11A1.
ProCOL11A1 /CK7 (DI)
proCOL11A1 /VIM (DI)
proCOL11A1 /αSMA (DI)
VIM /CK7 (DI)
proCOL11A1 + apenas 82 (43%), apenas 106 (18%) proCOL11A1 + única (23%) VIM 73 + única (85%) CK7 364 + apenas 60 (32%) VIM + apenas 370 proCOL11A1 + ( 64%) αSMA + apenas 138 (50%) CK7 + apenas 36 (8%) proCOL11A1 + /CK7 + 46 (25%) proCOL11A1 + /VIM + 101 (18%) proCOL11A1 + /αSMA + 67 (24%) VIM + /CK7 + 30 (7%) total 188 (100%) total 577 (100%) total 278 (100%) total 430 (100%) Tabela 2. a análise quantitativa da distribuição celular em fibroblastos de cancro do pâncreas peritumorais cultivadas (passagem 3)
*. *
uma amostra do paciente, avaliação em cinco campos para cada experiência da dupla imunomarcação (DI). Células coradas tanto com Ab em negrito. CSV Baixar CSV
mancha de fluorescência Duplo ilustra a presença de células proCOL11A1 + /CK7 +, proCOL11A1 + /αSMA + e proCOL11A1 + /VIM +.
Red
: proCOL11A1;
verde: CK7, αSMA e VIM, respectivamente;
azul e: núcleos. Inserções: tomadas aleatoriamente campos de alta potência da cultura. A barra de escala 100? M (X200) e 20 uM (X630).
PDAC vs. CP
As características de cada paciente e pontuação imunocoloração proCOL11A1 seu /sua patologista são apresentados na Tabela S3 em S1 Arquivo. Houve diferença estatisticamente significativa entre PDAC e pancreatite crónica na pontuação mAb (média ± SD: 7,33 ± 4,04 vs 0,61 ± 1,33; P 0,0001). Os dados são mostrados na Figura 6. A AUC de curvas ROC PDAC vs CP foi 0,936 (0,851-0,981), P 0,0001 (Figura 7). A imunocoloração mostrou uma sensibilidade de 92% e uma especificidade de 83% em discriminar PDAC da CP, com uma precisão de 90%. O uso de pAb mostrou um resultado similar discriminar PDAC de CP (Tabela S4 no arquivo S1). concordância entre os patologistas de observação foi de 90%. A pontuação coloração não se correlacionou com a idade, sexo, estágio do tumor do paciente ou grau. A associação com a sobrevida global paciente não foi investigado porque o número de pacientes PDAC com uma pontuação baixa foi muito baixa (4/51 casos)
Barras:.. ± 1 SD
μ indica o ponto de corte com a melhor separação (mínimo de falsos resultados positivos e negativos falsos) entre os dois grupos.
a imunocoloração foi também avaliada usando o software de análise de imagem QWin. Os resultados são mostrados na Tabela S5 S1 no ficheiro. Há uma diferença estatística entre PDAC e PB do número de células positivas na superfície manchada e na área de referência. Dentro da mesma série, houve uma elevada concordância entre a pontuação patologista e os dados QWin tais como a área de superfície das células coradas e o número de células positivas (coeficiente de correlação de Spearman = 0,825 e 0,825, respectivamente). curva ROC dados AUC foram obtidos para os seis parâmetros de análise de imagens (Tabela S6 em S1 Arquivo). Todos os parâmetros permite a discriminação entre PDAC e pancreatite crônica. Os parâmetros mais relevantes foram o número de células positivas e a área de superfície das células coradas.
Discussão
DNA microarrays permitir a análise simultânea do nível de milhares de genes e expressão poderá clarificar os mecanismos da carcinogênese pancreática [26-31]. O primeiro estudo para aplicar esta técnica para o câncer de pâncreas identificados com sucesso um conjunto de genes que é diferencialmente expressos em câncer pancreático [32]. Outros estudos levaram à identificação de ambos os genes candidatos anteriormente descritos e novos [33-39,50]. A maioria dos genes identificados, não pôde ser validado por outras técnicas mais precisos, quer no nível de proteína ou de ARNm. Temos focado nossos estudos sobre esses genes com potencial interesse como marcadores e /ou alvos terapêuticos [23], uma das quais é COL11A1.
Neste relatório, verificar a expressão imuno-histoquímica de COL11A1 no PDAC. observações anteriores sobre a expressão de COL11A1 em outros cancros [40-44] foram limitados à expressão diferencial de genes análises validado por RT-PCR quantitativo, transferências de Northern e /ou hibridação in situ de ARNm. Recentemente, a expressão de colagénio XI em ambos os tecidos do cólon humano normal e maligno foi avaliada por imuno-histoquímica [45].
Uma análise computacional da expressão génica em vários tipos de cancro [46] revela que a sobre-expressão de COL11A1 e outros genes é um biomarcador de alta especificidade para a invasão do cancro e prevê a resposta a terapia neoadjuvante. A infra-regulação de COL11A1 in vitro em co-culturas de células de cancro do pâncreas e estromais [47] tem sido relatada. Estas observações in vitro não são suportadas por dados ex vivo; o artificial em condições in vitro não cumprir todos os requisitos nem deve dar a todos os fatores locais conducentes à expressão alta COL11A1.
Para nosso conhecimento, nenhum marcador específico para FAC foi relatada. coloração convencional não apresentaram diferenças entre FAC e fibroblastos normais.