Abstract

Fundo

activação aberrante da via /β-catenina canônica Wnt ocorre em quase todos os cancros colo-rectais e contribui para o seu crescimento, invasão e sobrevivência. Fosfolipase D (PLD) tem sido implicado na progressão do carcinoma colorectal No entanto, um entendimento das metas e regulação desta importante via permanece incompleta e, além disso, a relação entre a sinalização de Wnt e PLD não é conhecido.

Metodologia /Principais achados

Aqui, demonstramos que isozimas PLD, PLD1 e PLD2 são alvos diretos e reguladores de feedback positivo de sinalização /β-catenina Wnt. Wnt3a e Wnt miméticos aumentou significativamente a expressão de PLD a um nível de transcrição em células de cancro colo-rectal HCT116, ao passo que o silenciamento de expressão do gene β-catenina ou a utilização de uma forma negativa dominante de células T factor-4 de (TCF-4) inibiu a expressão de PLD . Além disso, tanto PLD1 e PLD2 foram altamente induzida no cólon, fígado e estômago tecidos de ratinhos após a injecção de LiCl, um mimético de Wnt. Wnt3a estimulada a formação dos complexos β-catenina /TCF para dois elementos TCF-4-funcionais de ligação dentro do promotor PLD2 tal como avaliado por ensaio de imunoprecipitação da cromatina. Suprimindo PLD usando o silenciamento do gene ou inibidor selectivo bloqueou a capacidade de β-catenina para transcricionalmente activar PLD e outros genes alvo de Wnt por prevenção da formação do /TCF-4 complexo β-catenina, enquanto tácticas para elevar os níveis intracelulares de ácido fosfatídico, o produto de actividade de PLD, reforçada estes efeitos. Aqui nós mostramos que PLD é necessária para o crescimento invasão e independente de ancoragem Wnt3a-driven de células de câncer de cólon.

Conclusão /Significado

PLD isoenzimáticos age como um alvo transcricional romance e regulador feedback positivo de sinalização Wnt, e, em seguida, promove o crescimento independente de ancoragem de Wnt-driven de células de cancro colorrectal. Propomos que as intervenções terapêuticas visando PLD pode conferir um benefício clínico no Wnt malignidades /β-catenina-driven

Citation:. Kang DW, Min DS (2010) Positive Regulamento feedback entre fosfolipase D e Wnt Signaling Promove Wnt- impulsionada Crescimento Anchorage-Independent de células de câncer colorretal. PLoS ONE 5 (8): e12109. doi: 10.1371 /journal.pone.0012109

editor: Sudha Agarwal, Universidade do Estado de Ohio, Estados Unidos da América

Recebido: 03 de abril de 2010; Aceito: 05 de julho de 2010; Publicação: 12 de agosto de 2010

Direitos de autor: © 2010 Kang, Min. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Coréia Healthcare Tecnologia R D Project, Ministério da Saúde, Bem-Estar e Assuntos da família, República da Coreia (A080287). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal é uma das neoplasias mais comuns, ocorrendo em uma percentagem significativa da população. Mais de 80% dos cancros colorectais esporádicos e hereditários pode ser causada por aberrações na via de sinalização Wnt /β-catenina [1] – [3]. Assim, alterações na via /β-catenina Wnt definir um evento chave na patogênese do câncer de cólon. β-catenina é um coactivador de transcrição do factor de células T (TCF) /factor de intensificador linfóide (ABL) factores de transcrição. β-catenina estabilidade é regulada por um complexo multiproteico que inclui polipose adenomatosa coli (APC), glicogénio sintase quinase 3β (GSK3β), e axina. A fosforilação de β-catenina por GSK3β alvo β-catenina a ubiquitinação e degradação de proteassoma [4]. Assim, a activação da via de degradação reprime β-catenina, o que resulta na acumulação nuclear de β-catenina. No núcleo, a acumulação de TCF /β-catenina conduz à activação da transcrição de vários genes alvo, que pode então contribuir para o desenvolvimento de cancro [5], [6]. Assim, a identificação dos alvos directos da via de sinalização /β-catenina Wnt é potencialmente importante para a compreensão do papel central da via Wnt /β-catenina /via canonical TCF dependente na tumorigénese.

fosfolipase D (PLD) catalisa hidrólise de fosfatidilcolina (PC) para gerar o ácido fosfatídico (PA), o qual actua como um segundo mensageiro em muitas respostas fisiológicas [7]. Dois isozimas PLD específico para PC mamífero designado como PLD1 PLD2 e foram clonados. PLD tem emergido como um regulador crítico da proliferação celular e sobrevivência cuja desregulação ocorre durante o desenvolvimento de uma variedade de tumores humanos [8]. expressão elevada de PLD1 PLD2 e tem sido relatada em tecidos de cancro colo-rectal [9]; em particular, o nível de expressão PLD2 e sua associação com características clinicopatológicas foram recentemente investigada em carcinoma colorrectal [10]. Os níveis de expressão de PLD2 correlação significativa com o tamanho do tumor e sobrevida dos pacientes com carcinoma colorectal [10]. A mutação pontual PLD2 também foi encontrada no cancro da mama [11]. As células que sobre-expressam PLD isozima melhorar a metaloproteinase de matriz-2 e de expressão de invasão de células tumorais e formar metástases em ratinhos singeneicos [12], [13]. Estas descobertas sugerem que a PLD desempenha um papel importante na progressão do carcinoma colorectal, e poderia ser um alvo para a terapia do cancro. Temos recentemente informou sobre co-sobre-expressão significativa do PLD isoenzimas com β-catenina no cancro colorectal humana [14]. Usando dois interferência de RNA (RNAi) à base de telas de perda de função, os oncogenes que modulam β-dependente-catenina e a transcrição regulam a proliferação de células de cancro do cólon foram identificados [15].

Entre um dos genes identificado nesta tela era PLD1, e supressão de PLD1 inibiu significativamente tanto a proliferação de transcrição celular atividade e câncer de cólon β-catenina. No presente estudo, demonstramos a ação do PLD isozimas como novos alvos e reguladores de feedback positivo de sinalização Wnt. Assim, a identificação de um eixo PLD Wnt-β-catenina-TCF-regulada fornece novas informações mecanicistas em câncer.

Materiais e Métodos

As linhas celulares e reagentes

colorectal humano células cancerosas (HCT116, HCA-7, Colo-741, RKO) e células de cancro da mama (Hs578T) foram adquiridas da ATCC (Manassas, VA) e foram cultivadas de acordo com protocolos padrão. Purificada Wnt3a recombinante foi adquirido à R D Systems Inc. BIO foi obtido da Calbiochem. LiCl, 1- ou 3-butanol, dioctanoílo PA, e 1-propranolol foram adquiridos da Sigma-Aldrich. PLD1 e PLD2 inibidores selectivos foram adquiridos a Cayman química. kits de ensaio dupla de luciferase foram adquiridos da Promega.

Plasmids e pequena interferência RNA

PLD1 Humano (pGL4-PLD1 Luc) e PLD2 (pGL4-PLD2 Luc) plasmídeos repórter promotor conter -1,9 kb ( -1930 /+ 1) e de 2,6 kb (-2180 /+ 491) a montante de DNA flanqueante 5 ‘ligados a genes repórter de luciferase, respectivamente, e foram descritos noutro local [14]. Utilizou-se o promotor de hPLD1 (pGL4-PLD1; -1930 /+ 1), transcrita a partir do exão 2, entre os dois transcritos alternativos de PLD1 a ser transcritas em dois locais diferentes de transcrição (exão 1 e o exão 2). O método baseado em PCR foi utilizada para a clonagem do promotor PLD2 suprimido em série construções no vector repórter pGL4-14b no sítio Kpn I e Bgl II. A sequência dos oligonucleótidos utilizados como iniciadores em PCR amplificações é mostrado na Tabela S1.

Mutações de TCF-4 elementos de ligação sobre o promotor PLD2 foram gerados utilizando o Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit, de acordo com o fabricante do recomendações (Stratagene; Tabela S2). TOPflash e FOPflash plasmídeos de luciferase contendo várias cópias de elementos de resposta TCF /LEF foram utilizados para a medição da actividade TCF. Dominante negativo TCF-4 (ΔN30 TCF-4) foi gentilmente cedido pelo Dr. Tesshi Yamada (Instituto Nacional do Câncer Research Center). mutante constitutiva activa de β-catenina (S37A β-catenina) e vectores de tipo selvagem TCF-4 de expressão foram gentilmente fornecidas pelo Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University). shRNA para β-catenina foi gentilmente fornecido pelo Dr. H. Clevers (Utrecht,. Países Baixos). SiRNAs para o controle, PLD1 e PLD2 foram adquiridos de Dharmacon Research Inc (Lafayette, Colorado). sequências de siRNA para PLDs são os seguintes:. PLD1 humana (nucleótidos, de 1571 a 1591, AAGGUGGGACGACAAUGAGCA) e PLD2 humanos (nucleotídeos, 1378-1396, ACAUAAAGGUGAUGCGUCA)

Transient transfecção e Reporter Gene Assay

Seguindo as instruções, plasmídeos de expressão do fabricante ou siRNA foram transitoriamente transfectadas em células utilizando Lipofectamina Plus (Invitrogen) ou reagentes Polyfect (Qiagen). Os ensaios de transfecção e de luciferase foram realizadas como anteriormente descrito [16]. a actividade de luciferase relativa foi obtido por normalização da actividade da luciferase do pirilampo contra a actividade do controlo interno

Renilla luciferase

.

Imunoprecipitação e Western Blotting

Os lisados ​​celulares foram analisados ​​por imunoprecipitação e /ou imunotransferência, como previamente descrito [17]. -Anti-α tubulina (Sigma, MO), anti-vimentina (Sigma, MO), anti-c-Myc (Santa Cruz, CA), anti-β-catenina (Santa Cruz, CA), anti-NOS2 (Santa Cruz , CA), anti-TCF-4 (Santa Cruz, CA), anti-β-catenina (BD Biosciences, CA), anti-cycinD1 (BD Biosciences, CA), e o anticorpo-GSK3β anti-fosfo (sinalização celular, MA ) foram adquiridos. O anticorpo anti-PLD policlonal que reconhece tanto PLD1 e PLD2 foi gerado como descrito anteriormente [18].

a actividade de PLD ensaio

a actividade de PLD foi avaliada por medição da formação de [

3H] phosphatidylbutanol, o produto de transfosfatidilação PLD mediada por, na presença de 1-butanol, como previamente descrito [17].

RT-PCR quantitativo

o ARN total (1 ug) era pré-tratada com DNase e utilizado para a transcrição reversa com M-MLV de transcriptase inversa (Invitrogen). Real-time Q-PCR foi realizada num aparelho de RG-6000A-Rotor Gene (Corbett Research): durante 44 ciclos de 94 ° C durante 10 seg, 60 ° C durante 10 seg, e 72 ° C durante 15 seg. As reacções (20 uL) incluído 2 uL de ADNc, os iniciadores específicos para o alvo, e o estojo de PCR verde SYBR Quantitect (QIAGEN). O intervalo de temperatura para a análise de curvas de fusão foi de 55 ° C a 99 ° C durante 30 seg. Três experiências independentes foram realizadas para cada reacção em triplicado. Todos os dados foram normalizados com os valores de expressão do gene de GAPDH. Veja a Tabela S3 para sequências de primers Q-RT-PCR.

Animal e tecido preparação

Ratos foram fornecidos com a manutenção padrão e uma dieta de Dae Han Bio Link (Seul, Coréia). Os estudos em animais foram aprovados e executados sob as diretrizes do Instituto de diretrizes de saúde para o Conselho de Revisão Institucional da Universidade Nacional de Pusan ​​(Busan, Coreia do Sul). Doze ratos FVB macho semanas de idade receberam uma injecção intravenosa com LiCl, uma vez por dia durante 2 dias a dose de 5 mg /kg. O grupo de controlo foi injectado com o mesmo volume de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Quarenta e oito horas após a injecção de LiCl, os animais (n = 3 /grupo) foram anestesiados profundamente com éter dietílico e decapitados, e os tecidos foram imediatamente congelados em LN

2 e armazenadas a -70 ° C durante imunotransferência. Os ratinhos (n = 3 /grupo) também foram anestesiados e em seguida perfundidos intracardial com 4% de paraformaldeído em PBS contendo 0,34% de L-lisina (Sigma). Após perfusão fixador, os tecidos foram removidos e colocados em solução de paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante a noite, e, em seguida, transferidos para uma solução de sacarose a 30%. Os tecidos foram processados ​​por criostato de corte coronal em solução de PBS de Dulbecco contendo 0,1% de azida de sódio utilizando um micrótomo de congelação (MICROM, Alemanha).

A imuno-histoquímica

4? M secções de parafina fixados com paraformaldeído de tecidos do cólon foram autoclavadas em tampão de 10 mM de citrato de sódio (pH 6,0). Após o bloqueio com BSA a 5% e soro de cabra normal a 1% em PBS, as secções foram incubadas com anti-β-catenina (BD transdução) e anticorpos de PLD a noite a 4 ° C, seguido por lavagem com PBS. Subsequentemente, as secções foram incubadas com Alexa Fluor 488 ou Alexa Fluor 555 anticorpo secundio de IgG conjugada (Santa Cruz, 1: 200) à temperatura ambiente durante 1 h, seguido por lavagem com PBS. Após counterstaing com DAPI e lâminas foram montadas em Permount

® (Fisher Scientific, EUA). imagem fluorescente de duas cores para anti-PLD e coloração com anticorpos β-catenina foram recolhidos num Zeiss LSM 510 microscópio confocal (Zeiss, Alemanha). imagens fluorescentes foram analisados ​​utilizando software navegador de imagem Zeiss LSM (Zeiss).

cromatina imunoprecipitação (CHIP) Ensaio

experimentos ChIP foram realizados conforme descrito anteriormente [19], com pequenas modificações. As células HCT116 foram usadas para reticulação com paraformaldeído a 1% em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 10 min. As células foram raspadas e recolhidas por centrifugação. As células foram lisadas em tampão de lise (50 mM de Hepes, pH 7,5, 140 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, 0,1% de desoxicolato, e mm de cocktail inibidor de protease de 1,0) e sonicada durante 20 segundos 3 vezes. IgG de rato normal, anti-β-catenina ou anticorpos anti-HDAC1 e incubou-se durante 6 h a 4 ° C. Immnunocomplexes foram extraiu-se 3 vezes com 1% de SDS, 0,1 M de NaHCO3, e a reticulação foi invertida por incubação a 65 ° C durante a noite. A fracção de entrada cromatina salvo também foi processado da mesma maneira. As amostras foram, em seguida, digerido com DNase isenta de RNase e proteinase K a 50 ° C durante 4 h, e extraiu-se com fenol /clorofórmio /álcool isoamílico. As amostras de ADN foram purificados com colunas Qiagen de limpeza. A região do promotor ou PLD2 NOS2 foi analisada por Q-RT-PCR utilizando iniciadores específicos (Tabela S4).

A migração celular e invasão Ensaios

Células foram adicionados às câmaras de membrana Transwell (tamanho de poro, 12,0 uM; Corning). O número de células que migraram através da membrana para a cara inferior foi contado após 24 horas. Para as experiências de ARNip, as células foram semeadas 24 horas após a transfecção com os siRNAs, e ensaios de migração foram efectuados durante mais 24 horas. Para os ensaios de invasão de Matrigel, (1: 5; BD) foi adicionado às câmaras de membrana Transwell e incubou-se durante 5 horas; As células foram então semeadas. Extensão da migração e invasão foram expressos como o número médio de células por campo microscópico.

Anchorage independente ensaio de crescimento

crescimento independente Anchorage foi medido utilizando o CytoSelect ™ 96-Well

In vitro

Tumor sensibilidade do ensaio (célula Biolabs, CA), de acordo com as especificações do fabricante. o crescimento independente da ancoragem foi examinada em ágar mole; 50? L de matriz de base de agar foi adicionada ao fundo de cada poço de uma placa de 96 poços. Uma vez que o ágar foi sólido, 75 ul de suspensão de células de matriz de agar /mole contendo 3 × 10

3 células foi acamada sobre o topo, seguida de 50 uL de 2 x meio completo com Wnt3a e /ou inibidores. Após 10 dias de incubação, a matriz de agar foi solubilizada, e 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio foi adicionado a cada poço. A absorvância produzida por formação de produto de formazano insolúvel por células viáveis ​​foi registada a 570 nm.

A análise estatística

Todas as experiências foram realizadas de forma independente, pelo menos, três vezes, com resultados semelhantes. Os dados foram analisados ​​pelo

t

teste de Student, e

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

sinalização Wnt promove a expressão do PLD. isozimas

para examinar a questão da existência ou não de sinalização Wnt aumenta a expressão PLD, as células cancerosas colorectal HCT116 foram expostos a Wnt3a ou Wnt3a miméticos (Figura 1). Tal como determinado por imunoprecipitação e transferência de Western, a expressão de ambos PLD1 e PLD2 foi aumentada de uma maneira dependente do tempo após a exposição a Wnt3a recombinante purificada (150 ng /ml) (Figura 1A, o painel superior). O anticorpo anti-PLD foi gerado contra o péptido C-terminal de PLD1 em que 7 aminoácidos entre os aminoácidos 12 foram os mesmos com a de PLD2, e reconhece tanto PLD1 PLD2 e [18]. Demonstrou-se que as células HCT116 têm mutações em β-catenina a Ser-45 e Ser-que este alelo mutante 45 não foi suficiente para suportar a tumorigénese de células HCT116 [20] – [22]. Assim, sugere-se que a via β-catenina em células HCT116 não está totalmente activado pela mutação, e, portanto, pode ser estimulada por mensageiros extracelulares adicionais, tais como a sinalização de Wnt, resultando na transformação oncogénica. Em seguida, investigou a questão da existência ou não de expressão PLD induzida por sinalização Wnt pode ser regulada a nível da transcrição. Wnt3a reforçada os níveis de mRNA de PLD1 PLD2 e de uma forma dependente do tempo (Figura S1). Para excluir esse aumento Wnt-dependente de mRNA PLD só é causada por mudanças na estabilidade do mRNA, foi realizado um ensaio de mRNA decadência usando actinomicina D, o que impede a transcrição. A expressão de PLD1 e PLD2 foi aumentada ao longo do tempo de uma forma comparável entre Wnt-tratadas e as células de controlo, tal como analisada por Q-RT-PCR (Figura S2). O pré-tratamento com actinomicina D suprimiu significativamente a ambos os níveis basais e induzidas Wnt3a PLD de ARNm (Figura S2). Assim, o aumento de Wnt-dependente de ARNm PLD é, de facto, devido à transcrição elevado. A fim de reforçar ainda mais nossos resultados, determinou-se o efeito de bloqueio da GSK-3β na expressão PLD. LiCl e BIO são agonistas que mimetizam a via Wnt-sinalização estabelecida, conduzindo à activação e estabilização de β-catenina [23], [24]. Tal como analisado por imunoprecipitação e transferência de Western, LiCl (20 mM), BIO (1 uM), e Wnt3a (150 ng /ml) aumentou significativamente o nível de isozimas de PLD (Figura 1B) expressão. miméticos de Wnt também aumentou o nível de proteína de β-catenina, bem como a expressão de c-Myc e NOS2, genes alvo de sinalização Wnt. Tal como analisado por Q-RT-PCR, a sinalização Wnt níveis de expressão marcadamente elevados de ARNm de PLD (Figura 1C). Além disso, Wnt e seus miméticos aumentou significativamente a actividade do promotor de ambos PLD1 e PLD2 (Figura 1D); Wnt3a acompanhada um aumento significativo na expressão de genes a partir de uma TCF /LEF específica da luciferase repórter plasmídeo (TOPflash) usado como um controlo. Além disso, verificou-se que Wnt3a aumentou os níveis de expressão de isoenzimas de PLD em várias células cancerígenas, incluindo células de cancro colorectal (HCA-7, RKO, Colo-741) e células de cancro da mama Hs578T () (figura S3). Para observar a indução de isozimas de PLD em resposta à sinalização de Wnt, escolhemos as células cancerosas, em que o estado da via Wnt é normal. Estas células cancerosas são conhecidas por expressar a APC tipo selvagem e β-catenina [25] – [29]. Assim, sugere-se que Wnt expressão de PLD induzida por sinalização pode ser um fenómeno geral. A sobre-regulação da expressão de PLD por Wnt3a e Wnt miméticos fortemente implicado um papel central para a inibição da GSK3β e a via de sinalização Wnt canónica em efeitos de Wnt-mediadas. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a indução da isozima PLD como um novo alvo de sinalização Wnt é regulada em ambos os níveis de transcrição e pós-transcrição.

células HCT116 (A) foram tratados com Wnt3a recombinante purificada (150 ng /mL) durante os tempos indicados, e os lisados ​​foram imunoprecipitados e imunotransferidas com anticorpo a PLD. β-catenina foi analisada por Western blotting utilizando lisados ​​nucleares (painel superior). Os histogramas mostram os níveis relativos de proteína PLD1 e PLD2, que são normalizados para os valores correspondentes α-tubulina (painel inferior). células HCT116 (B-C) foram tratados com Wnt3a (150 ng /mL), LiCl (20 mM), ou BIO (1 uM) durante 24 h. (B) nível de proteína de PLD foi analisada por imunoprecipitação e imunotransf erência. c-Myc e a expressão de NOS2 foi analisado por transferência de Western (painel superior). Os histogramas mostram os níveis relativos de proteína PLD1 e PLD2, que são normalizados para os valores correspondentes α-tubulina (painel inferior). Os dados são representativos de três experiências independentes. os níveis de (C) de mRNA dos genes indicados foram analisados ​​por Q-RT-PCR. *

P Art 0,05

contra

veículo. (D) Os plasmídeos repórteres de promotores indicados foram transfectadas e tratou-se com Wnt3a, LiCl, ou BIO durante 12 h; Determinou-se então a actividade da luciferase. *

P Art 0,01

contra

veículo. Os dados representam a média ± S.D. de três experiências independentes.

LiCl induz a expressão de isoenzimas PLD

in vivo

Para fortalecer ainda mais nossos resultados, nós investigamos o efeito do bloqueio de GSK3β no PLD expressão

in vivo

. LiCl foi injectado em ratinhos, e a expressão de PLD foi investigado em vários tecidos utilizando o anticorpo anti-PLD, que reconhece tanto PLD1 e PLD2. Nós relataram sobre a especificidade do anticorpo a PLD [18], [30]. Tal como analisado por meio de imunoprecipitado, LiCl aumentou os níveis de proteína de ambos PLD1 e PLD2 no cólon, do estômago, do fígado e de tecidos (Figura 2A). Como um controlo positivo, o nível de β-catenina e NOS2, bem como a fosforilação de GSK3β, foi aumentada em tecidos de LiCl-injectados. Um resultado complementar no que diz respeito à expressão de PLD a seguir à aplicação de LiCl também foi obtido por imunofluorescência em tecidos do cólon (Figura 2B). Os núcleos foram contrastadas por DAPI. Considerando β-catenina demonstrou um padrão de coloração membranosa no cólon de controlo injectados com PBS, β-catenina foi aumentada por LiCl no citoplasma e núcleo das células. nível de PLD foi aumentada concomitantemente tanto no citoplasma e núcleo das células no cólon LiCl-injectado como β-catenina foi aumentada (Figura 2B). Colectivamente, estas observações indicam que a expressão de ambos PLD1 e PLD2 é aumentada em tecidos de ratos tratados com LiCl.

Ratos (A) foram injectados por via intravenosa com LiCl, como descrito em “Materiais e Métodos”. Os lisados ​​de vários tecidos foram imunoprecipitados e imunotransferidas com anticorpo que reconhece tanto a PLD e PLD1 PLD2 (painel da esquerda). Os níveis de proteína foram analisados ​​por imunotransf erência usando os anticorpos indicados. Os histogramas mostram os níveis relativos de proteína PLD1 e PLD2, que são normalizados para os valores correspondentes α-tubulina (painel direito). seções (B) de parafina de tecidos de cólon foram submetidos a imunofluorescência análises usando anti-β-catenina (Alexa Fluor 488; verde) e PLD (Alexa Fluor 555; vermelho) anticorpo. Os tecidos foram monitorizados usando Zeiss LSM 510 microscópio confocal. Microscopia campos foram observadas a 650 × ampliação. Os dados são representativos de três experiências independentes.

β-catenina e TCF-4 regular a expressão de PLD isozimas

Foi examinada a questão de saber se ou não expressão de PLD isozimas é realmente transcricionalmente activado por β-catenina ou TCF-4. Como mostrado na Figura 3

Um

, a expressão ectópica de TCF-4 e um mutante estável β-catenina (S37A β-catenina), que é insensível a ubiquitinação de β-catenina, reforçada de activação da transcrição de ambos e PLD1 PLD2. TCF-4 e estável mutante β-catenina aumentou significativamente a expressão do gene a partir de um plasmídeo repórter de luciferase específica TCF /LEF utilizada como um controlo. Esta indução foi significativamente diminuída pela adição de um negativo dominante (DN) de TCF-4 vector de expressão (ΔN30 TCF-4) (Figura 3A). Além disso, a análise por imunoprecipi tacão e imunotransferência mostrou que a expressão ectópica de β-catenina ou TCF-4 o aumento dos níveis de proteína endógena de PLD1 e PLD2 isozimas em células HCT116. genes TCF-regulada, incluindo c-myc e NOS2, foram também aumentou a expressão da β-catenina ou TCF-4 (Figura 3B). Além disso, a transfecção de dnTCF-4 ou depleção de β-catenina usando shRNA diminuiu os níveis de proteína de ambas as isozimas de PLD e Wnt genes alvo em células HCT116 (Figura 3C). Estes resultados indicam que a expressão de isoenzimas PLD é regulada por ambos β-catenina e TCF-4.

Células HCT116

(A) foram co-transfectadas com os vectores de expressão indicados TOP /FOP repórteres pGL4-PLD ou e. *

P Art 0,01

contra

simulada; †

P Art 0,05

contra

S37A β-catenina /TCF-4. (B) As células foram transfectadas com o vector de expressão de TCF-4 ou β-catenina, e os lisados ​​foram imunoprecipitados com ou imunologicamente os anticorpos indicados (painel superior). Os histogramas mostram os níveis relativos de proteína PLD1 e PLD2, que são normalizados para os valores correspondentes α-tubulina (painel inferior). (C) As células foram transfectadas com ΔN30 TCF-4 ou shRNA para β-catenina. Os lisados ​​foram analisados ​​por imunoprecipitação ou mancha Western usando os anticorpos indicados (painel superior). A expressão proteica foi quantificada por análise de densitometria. Os histogramas mostram os níveis relativos de proteína PLD1 e PLD2, que são normalizados para os valores correspondentes α-tubulina (painel inferior). Os dados são representativos de três experiências independentes.

β-catenina e TCF-4 se ligam aos EBTs do promotor PLD2 e aumentar a expressão PLD2

Um polimorfismo do gene PLD2 tem recentemente foi associado a uma prevalência de carcinoma colorrectal [31]. Além disso, os níveis de expressão de PLD2 detectadas por PCR em tempo real utilizando 97 colorretais tecidos de carcinoma foram significativamente correlacionados com o tamanho do tumor e sobrevida dos pacientes com carcinoma colorretal; Assim, foi sugerido que o nível de expressão PLD2 poderia ser um indicador de prognóstico no carcinoma colorrectal [10]. Portanto, tentamos examinar as regiões que são responsáveis ​​por Wnt /β-catenina /expressão PLD2 induzida TCF-4.

Conforme mostrado na Figura 4A, o promotor PLD2 -2180 /+ 491 foi transactivado por TCF -4 (4,6-vezes) ou proteínas S37A β-catenina (2,3 vezes). Sequential deleções 5 ‘do promotor PLD2 para posições -1601, -1210, -784 e transactivação não afectou TCF-4- ou S37A β-catenina mediada do promotor PLD2 (TCF-4, 4,2 vezes; p-catenina activação de 2,2 vezes de todos os mutantes); No entanto, a deleção de regiões -380 diminuiu significativamente TCF-4 ou S37A β-catenina-estimulou a actividade de promotor de PLD. Assim, sugere-se que o elemento de ligação putativo TCF (TBE) nas posições -784 -380 ~ pode ser essencial para a regulação do gene PLD2 por TCF-4 e β-catenina.

(A) análise de deleção de pGL4- PLD2 em células HCT116. Uma representação esquemática das construções repórter pGL4-PLD2 é mostrado. As células foram co-transfectadas com os vectores de expressão indicados pGL4 PLD2-e, seguido de determinação da actividade da luciferase. (B) Representação esquemática da -2.180-491 região do promotor humano da PLD2. Os números acima das linhas referem-se ao local de início da transcrição do gene da

PLD2

(1). Dois locais de ligação putativos para TCF-4 estão indicados na sequência (as setas indicam a direcção). (C) As células HCT 116 foram transfectadas com o plasmídeo repórter da luciferase contendo o tipo selvagem (wt) PLD2 promotor, uma ou duas vezes TBE formas mutantes (Mt) de promotor PLD2, e tratou-se com Wnt3a (150 ng /ml) ou BIO (1 uM). actividades de luciferase foram medidas. *

P Art 0,05

contra

wtTBE /Wnt3a; †

P Art 0,01

contra

wtTBE /BIO. (D) As células foram co-transfectadas com os vectores de expressão indicados, juntamente com as formas mutantes wt ou TBE do promotor PLD2. actividades de luciferase foram medidas. *

P Art 0,05

contra

transfectadas com wtTBE /β-catenina; †

P Art 0,05

contra

wtTBE /TCF4; **

P Art 0,05

contra

transfectadas com wtTBE /β-catenina /TCF4. (E) As setas indicam a posição dos iniciadores utilizados na experiência de chip. O ensaio de chip foi realizada utilizando IgG pré-imune, anti-β-catenina, ou o anticorpo anti-HDAC1 e analisados ​​por Q-RT-PCR. Como um controlo positivo, foi realizada a análise do chip do promotor de NOS2 contendo TBE. *

P Art 0,05

contra

β-catenina /veículo; †

P Art 0,05

contra

HDAC1 /veículo. Os dados são representativos de quatro experiências independentes. (F) Diagrama esquemático para comparação dos EBTs em regiões promotoras PLD2 de várias espécies. TCF-4 elementos de ligação em regiões 5 ‘flanqueadora do PLD2 humano transcricional começam local (SST) foram comparados com os dos genomas de 4 espécies diferentes. Um núcleo

motif

, CTTTG (A /T) (A /T) [ou a sequência complementar (A /T) (A /T) CAAAG] de sequências de ligação TCF na promotor PLD2 é altamente

conservada entre espécies.

como se mostra na Figura 4B, a análise de sequência da sequência flanqueante 5 ‘do gene PLD2 identificados dois putativos TBE (designado como TBE1 e TBE2). TBE1 (ATGAAAG) está localizado -512 b upstream, e contém uma correspondência quase invertida com o consenso CTTTG (A /T) (A /T) seqüência para TCF-4 vinculativo [32]; TBE2 (CTTTCAT) foi localizado -497 b montante e quase alcançaram a sequência de consenso (Tabela S2) [33].

Para examinar a importância funcional do motivo TBE na regulação da transcrição de genes PLD2, mutação dirigida ao local locais de TBE foi gerado no contexto de um promotor PLD2. A mutação no local da TBE1 ou TBE2 diminuiu significativamente a actividade do promotor induzida por PLD2 Wnt3a em células HCT116 (Figura 4C). As mutações de ambos os locais TBE1 e TBE2 (TBE1 /2) suprimiu drasticamente a atividade do promotor PLD2 estimulada por Wnt3a. Além disso, TCF-4 e /ou a actividade do promotor induzida por PLD2 β-catenina também foi abolido quando TBE1 e TBE2 foram mutados (Figura 4D). Estes dados sugerem que o promotor PLD2 é um alvo do complexo /β-catenina TCF através do seu TBE consenso.

Além disso, nós, então, realizada a imunoprecipitação da cromatina (ChIP) Ensaio em células HCT116 para confirmar

em vivo

ligação de β-catenina /TCF-4 para o promotor PLD2. ADN-β-catenina /TCF-4 complexos foram imunoprecipitados com anticorpos mostrado na Figura 4E, seguido de inversão de reticulação e Q-RT-PCR utilizando iniciadores que flanqueiam ambos TBE1 e TBE2, que estão localizados em posição proximal em relação uns aos outros. Tal como mostrado na Figura 4E, purificada recombinante Wnt3a ligação aumentada de β-catenina /TCF-4 para ambas as TBE do promotor PLD2. Estes resultados são comparáveis ​​com os do ensaio promotor utilizando mutagénese. alvos de sinalização Wnt p-catenina a cromatina para a remoção do co-repressor HDAC1 (histona-desacetilase 1) [34]. Como esperado, Wnt3a suprimiu significativamente a ligação de β-catenina a dois TBE do promotor PLD2 após o ensaio de chip, utilizando anticorpo anti-HDAC1. Além disso, descobrimos que TCF sites na promotor PLD2 de ligação são conservadas entre espécies (Figura 4F). Tomados em conjunto, estes dados demonstram que o gene alvo é um PLD2 transcrição directa de β-catenina /TCF sinalização in vivo.

isozimas PLD são necessários para a formação do β-catenina /TCF-4 e complexo de promoção β-catenina /TCF transcricional atividade

Nós investigamos a questão da existência ou não Wnt induzida por sinalização PLDs regulação positiva pode modular a atividade transcricional TCF β-catenina-dependente através de um ciclo de feedback positivo. A expressão ectópica de um mutante activo constitutivo de β-catenina aumento da actividade transcricional TCF em células cancerígenas do cólon HCT116 (Figura 5A). inibidores selectivos de PLD foram recentemente desenvolvidos [35], [36].