Abstract

Introdução

A definição de tumor do tecido não-tumoral é um dos principais desafios da cirurgia de câncer . Os cirurgiões depender de pistas visuais e tácteis para seleccionar quais os tecidos devem ser removidos de um paciente. Recentemente, nós e os outros têm a hipótese de infravermelho próximo (NIR) de imagem pode ser usado durante a cirurgia para diferenciar tumores do tecido normal.

Métodos

Foram incluídos 8 caninos e 5 seres humanos submetidos a cirurgia de câncer de imagiologia NIR. Os pacientes foram injectados com verde de indocianina (ICG), um corante aprovado pela FDA NIR específico não receptora que se acumula em tecidos hiperpermeável, 16-24 horas antes da cirurgia. Durante a cirurgia, NIR de imagem foi usada para discriminar o tumor a partir de tecido não-tumoral.

Resultados

imagiologia NIR identificados todos os tumores com uma média relação sinal-fundo de 6,7. imagens ópticas foram úteis durante a cirurgia no tecido normal discriminante de câncer. Em 3 casos caninos e 1 caso humano, o tecido que rodeia o tumor estava inflamado devido à obstrução do suprimento vascular devido ao efeito de massa. Nesses casos, NIR imagem não conseguia distinguir tecido tumoral a partir de tecido que estava congestionada, edematoso e não continha câncer.

Conclusões

Este estudo mostra que NIR imagem pode identificar tumores de tecidos normais, fornece excelente contraste do tecido, e que facilita a ressecção dos tumores. No entanto, em situações em que há uma inflamação significativa peritumoral, imagiologia NIR com ICG não é útil. Isto sugere que os corantes NIR não-alvo que se acumulam em tecidos hiperpermeável terá limitações significativas no futuro, e corantes NIR específicos de receptor pode ser necessário para superar este problema

citação:. Holt D, Okusanya O, Judy R, S Venegas, Jiang J, DeJesus E, et al. (2014) intra-operatória Near-Infrared imagem possível distinguir o cancro do tecido normal, mas não inflamação. PLoS ONE 9 (7): e103342. doi: 10.1371 /journal.pone.0103342

editor: Gabriele Multhoff, Technische Universitaet Muenchen, Alemanha |

Recebido: 22 Janeiro, 2014; Aceito: 30 de junho de 2014; Publicação: 29 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Holt et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pela Associação americana cirúrgica (SS) e os Institutos Nacionais de Saúde Transformative R01 CA163256-01 (DH, MW, SN, SS). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: SN é um consultor para SpectroPath, Inc., uma empresa iniciante em Atlanta, GA para desenvolver instrumentação e contraste de nanopartículas agentes avançados para cirurgia guiada por imagem. consultoria de SN não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A cirurgia é o tratamento mais eficaz para tumores sólidos nos Estados Unidos, e metade de todos pacientes com câncer submetidos a cirurgia com intenção curativa. [1] No entanto, apesar de uma ressecção cirúrgica “curativa”, 20-50% dos pacientes que se submetem à cirurgia desenvolver recidivas locais. [1] Os doentes que desenvolvem uma recorrência local tem uma marcadamente reduzida em 5 anos sobrevivência. [1], [2]

recorrências locais são devido a células tumorais que são deixados para trás no momento da cirurgia. tumores discretas pequenas em órgãos sólidos podem, tipicamente, ser removido com bons resultados. Por outro lado, definindo as bordas do tumor (margens do tumor) é particularmente difícil em cancros que invadiram as estruturas adjacentes ou se desenvolveram alterações peritumorais devido à obstrução vascular. Estes ressecções são mais propensos a ser vencida e desenvolver recidivas locais. Cirurgiões usam tipicamente exame macroscópico (macroscópica) do tumor usando inspecção visual e palpação do dedo para definir as margens do tumor. No entanto, em muitos casos, esta abordagem alcança margens cirúrgicas do tumor-negativo apenas 50% do tempo. [3], [4] Os cirurgiões também pode utilizar consulta patologia intra-operatório. No entanto, de congelação intra-operatória apresenta seu próprio conjunto de dificuldades, incluindo desafios técnicos de tecidos de congelamento, artefatos de tecido de congelamento, custo, perda de tecido em espécimes menores para o diagnóstico secção permanente e falta de disponibilidade em “tempo real”.

Muitos grupos começaram a investigar de imagem intra-operatória do infravermelho próximo (NIR), a fim de identificar tumores. [5], [6], [7], [8], [9], [10] imagiologia NIR é um baixo abordagem -energy, tornando-o seguro para o cirurgião, paciente e equipe cirúrgica. Existem vários agentes de contraste NIR, no entanto, a única actualmente aprovados pela FDA é de corante verde de indocianina (ICG). ICG é bem tolerado e podem ser injectadas em pacientes para imagiologia de cancro da NIR. [11], [12], [13] Não é receptor-específica, mas em vez disso se difunde para tumores devido a diferenças na vascular e pressões linfáticos. [5 ] ICG de imagens não é possível para a maioria das aplicações de diagnóstico devido à falta de penetração nos tecidos da luz emitida através da pele. No entanto, quando a cavidade do corpo está aberto, dispositivos de imagem NIR pode detectar ICG em profundidades de 10-15 mm no tecido. [14]

A hipótese que NIR imagem usando ICG pode ser capaz de identificar tumores durante a cirurgia de câncer . Para testar a nossa hipótese, realizamos um estudo piloto em vários modelos de câncer e casos humanos de tumores sólidos. Descobrimos que NIR de imagem é uma abordagem razoável para identificar tumores em órgãos sólidos. Ele permite excelente contraste entre o tecido normal e tecido canceroso e é bem visualizado intra-operativamente. No entanto, em situações em que os tumores se desenvolvem em torno alterações inflamatórias, NIR imagem é incapaz de discriminar não-canceroso do tecido canceroso.

Materiais e Métodos

As linhas celulares

O esôfago murino linha de células de carcinoma, AKR, foi obtido a partir do mouse epitélio escamoso do esôfago com a ciclina D1 sobre-expressão através de vírus de Epstein-Barr promotor ED-L2 no p53 origens genéticas deficientes e foi uma oferta generosa do Dr. Anil Rustgi (University of Pennsylvania). [15 ] A linhagem de células de câncer murino pulmão, TC1, foi derivado de células epiteliais pulmonares rato imortalizados com HPV-16 E6 e E7 e transformado com o C-Ha-ras e foi uma oferta generosa do Dr. Steve Albelda (Universidade da Pensilvânia) [16]. A linha de células NSCLC metastático, carcinoma de pulmão Lewis murina (LLC), foi obtido a partir de American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). Ae17 é uma linha de células de murino derivadas de mesotelioma amianto e foi uma oferta generosa do Dr. Steve Albelda (Universidade da Pensilvânia [17]. EL4 foi obtido a partir de ATCC e foi derivado a partir de um linfoma de ratinho induzido por 9,10-dimetil-1, exposição de 2-benzantraceno. 4T1 também obtida a partir de ATCC, é uma linha de tumor mamário de murino metastático que é resistente à 6-tioguanina.

Excepto para TC1 e ae17, linhas de células foram cultivadas e mantidas em DMEM alta concentração de glicose (Dulbecco modificado de Eagle Medium, Mediatech, Washington, DC) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS;. Geórgia Biotecnologia, Atlanta, GA), 1% de penicilina /estreptomicina e 1% de glutamina TC1 e linhas celulares ae17 foram cultivadas em RPMI (meio RPMI 1640 médio, Mediatech, Washington DC) 10% FBS, 1% de penicilina /estreptomicina, e 1% de glutamina. As linhas celulares foram regularmente testados e mantidos negativo para

Mycoplasma spp

.

Reagentes

Pharmaceutical verde grau de indocianina (ICG) foi comprado de Akorn Inc. (IC-gREEN, NDC 17478-701-02, Lake Forest, IL). Ratinhos C57BL /6 receberam 7,5 mg /kg na veia da cauda ICG frasco 16-24 horas antes da cirurgia. [6] cães e seres humanos recebeu 24 horas antes da cirurgia.

sistemas de imagem 5 mg /kg por via intravenosa ICG Perto fluorescente no infravermelho

O próximo sistema de imagem de infravermelhos de mão foi previamente descrito em detalhe [18]. em resumo, um detector de Raman sonda foi incorporada uma cabeça de amostragem de aço inoxidável cilíndrico integrado com, um cabo de 5 m de duas fibras ; uma para a excitação do laser e o outro para a recolha de luz. O cabo da cabeça de amostragem e fibra foram acoplados através de um conector FC a um espectrômetro. O sistema de abertura da colheita eo espectrômetro combinada tem uma gama de comprimentos de onda de 800-930 nm com 0,6 resolução espectral nm para infravermelho próximo (NIR) de medição de fluorescência. A luz de excitação foi fornecido por um 785 nm, 100 mW de onda contínua laser de diodo. Todas as leituras foram tomadas com um tempo de 0,1 segundo integração e cumpridas em um computador usando o software proprietário. Este sistema foi utilizado para todos os estudos caninos, mas apenas

ex vivo

em seres humanos.

O dispositivo de imagiologia óptica NIR foi desenvolvido no nosso laboratório. [19] Em resumo, o dispositivo contém um 740 nm LED montados em um dissipador de calor. Os espectros de emissão de luz a partir do tecido passa através de um filtro de passagem de banda de 780 nm em uma câmara CCD. Um computador mostra as imagens através de software OEM PixeLINK Capture. Todo o sistema está conectado a uma plataforma de metal que pode ser mantido no lugar por meio de um suporte de anel ou realizada pelo cirurgião usando um adaptador de cabo (desenvolvido por Mark Cantor, BioMediCon ©, Moorestown, NJ). Cada com imagens é capturada por duas vezes, uma vez em campo brilhante e fluorescência uma vez em. Estas imagens são processadas e sobrepostos.

Histoquímica

Os tecidos foram colhidas e dividido em dois com uma metade, quer colocadas em Tissue-Tek OCT e guardadas a -80 ° C ou em formalina para seccionamento parafina. Para detectar células endoteliais, monoclonais CD31 (mAB390) [20] foi levantada a partir do sobrenadante de hibridoma e purificada. secções de tumor congeladas foram preparadas como anteriormente descrito. [21] a expressão de CD31 foi quantificada através da contagem do número de células coradas positivamente em quatro campos de alta potência (400 ×). [22]

Estudos Murinos

fêmea C57BL /6 (B6, Thy1.2) e ratinhos BALB /c foram adquiridos de Charles River Laboratories e Jackson Laboratories. Todos os ratinhos foram mantidos em condições isentas de agentes patogénicos e usadas para experiências em idades de 8 semanas ou mais velhos. Os Comitês de Cuidado e Uso de Animais do Hospital Infantil da Filadélfia e da Universidade da Pensilvânia aprovou todos os protocolos de murino de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório (Protocolo 804.894). As células tumorais para injecções subcutâneas foram suspensos em 100 ul de PBS. O volume do tumor foi calculado utilizando a fórmula (X π longo do eixo X-eixo curto

2) /6.

A cirurgia foi realizada em ratinhos portadores de tumores no flanco utilizando um modelo de ressecção parcial estabelecido. [23] Cirurgia foi realizada quando os tumores atingiram aproximadamente 200 mm3. Os ratinhos foram anestesiados com cetamina intramuscular (80 mg /kg) e xilazina (10 mg /kg), raspada, e o campo cirúrgico esterilizado antes da cirurgia. Inicialmente os ratos foram fotografadas para detectar o sinal de NIR e, em seguida, subsequentemente, uma 1 a 2 cm da incisão foi feita adjacente ao tumor e o tumor foi exposto utilizando a técnica de dissecção romba padrão. Depois de imagem, a incisão foi fechada com seda estéril 4-0. A buprenorfina (0,2 mg /kg) foi administrado no momento da cirurgia e 6 horas após a cirurgia para proporcionar analgesia. tratamento pré-operatório era desconhecida para o investigador realizar a cirurgia e fazendo medições do tumor.

desenho do estudo Canine

Entre junho de 2011 e abril de 2012, 8 cães consecutivos com tumores primários de pulmão que foram considerados candidatos à cirurgia foram recrutados da Universidade da Pennsylvania School of Veterinary Medicine. O estudo canino foi aprovado pelo Institutional Animal Care da Universidade e do Comitê Use. O documento de consentimento foi aprovado pelo Comitê Protocolo animal de propriedade privada da Escola de Veterinária e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os proprietários (Protocolo 802.853). No momento da cirurgia, uma toracotomia padrão de atendimento e ressecção pulmonar realizada. O lobo pulmonar afectado foi removido usando um agrafador cirúrgico (V3, Covidien, Mansfield MA).

Durante a operação, o sistema de imagem intra-operatória foi usada para inspeccionar o tórax antes da ressecção e após a ressecção pulmonar. Os dispositivos foram cobertas com plástico estéril e foram usados ​​para a imagem do tumor primário

in situ

. As leituras de fluorescência foram tomadas a partir do centro do tumor, pulmão grosseiramente normal no lóbulo afectado ou, no caso de grandes tumores do pulmão, grosseiramente normal em lóbulos ipsilaterais. A periferia do tumor foi fotografada em 4 direções radiais, designou os 12, 3, 6 e 9 horas de posições. Grosseiramente pulmonar normal, 5 mm e 10 mm, que se estendem para longe da periferia do tumor foi depois trabalhada. As margens fluorescentes foram marcados com sutura.

Após a remoção de todos os tecidos, as amostras foram re-trabalhada

ex vivo

antes de submetê-los a patologia. Todos os tecidos foram então fixadas em 10% de formalina, embebidos em parafina, seccionado, e avaliadas por um patologista certificado placa. As margens do tumor, determinados por fluorescência e marcados com sutura, foram comparadas com margens histopatológicos.

Estudos Humano

Os estudos em humanos foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional (Universidade da Pennsylvania School of Medicine, protocolo de 811.870) e cumpridos procedimentos de documentação e necessária autorização do Conselho. Todos os pacientes foram submetidos a consentimento informado por escrito antes de participar neste estudo. Durante a cirurgia, todo o tórax foi apalpado e inspeccionados visualmente para a doença. Nesse ponto, o sistema de câmera foi esterilizada drapeado e trouxe para o campo cirúrgico para imagiologia NIR. Uma vez que a cirurgia do câncer estava completa, as amostras foram re-fotografada na mesa de trás da sala de cirurgia usando o espectrômetro de mão. Todas as amostras foram enviadas para exame histopatológico.

Resultados

imagiologia NIR pode identificar depósitos de tumor no tecido normal

Inicialmente, a fim de determinar se um agente de contraste NIR poderia identificar tumores sólidos

in situ

, realizamos um estudo de prova de conceito em modelos murinos de doença maligna. Cinquenta fêmeas C57BL /6 ou camundongos BALB /c tinha uma das cinco linhas diferentes sing�icos de células de câncer (câncer 4T1 mama, cancro do pulmão TC1, EL4 de timoma, mesotelioma ae17, AKR câncer de esôfago) injetado em seus flancos. Após os tumores estavam bem estabelecidas (200 milímetros

3), ICG foi administrado através da veia da cauda. No dia seguinte, um espectrómetro de tecido foi usado para a fluorescência semi-quantificar a partir do tumor e órgão circundante. [18]

A fluorescência média dos tumores do flanco era 52,710 unidades arbitrárias (UA) (gama de 46,283-60,000) , e a fluorescência média de circundante tecidos e órgãos normais em média 6173 ± 3300 AU. Assim, a média relação sinal-para-fundo (SBR) foi de 8,5 (Figura 1a). Percebemos que a fluorescência de diferentes subtipos histológicos de tumor não era marcadamente diferente. No passado, nós e outros têm a hipótese de que a absorção de corantes NIR é variável e dependente da vascularização do tumor. [5], [6] Assim, tumores de histologia diferente deve ter fluorescência diferente. Os tumores foram colhidos, seccionado, e ensaiaram-se para a densidade de microvasos por coloração com CD31. Embora não era tão vasta gama de densidade de microvasos, não foi encontrada uma diferença significativa na SBR do tumor em diferentes tipos de tumores histológicos (p 0,1). Além disso, não encontramos que a fluorescência tumor correlacionado com a vascularização do tumor (Figura 1a).

Cinco tipos de células cancerígenas (A) foram injectados no flanco de ratinhos singeneicos. Uma vez estabelecidos (200 mm3), os animais foram doseados com 7,5 mg /kg de ICG e fotografada. Os tumores foram colhidos, fotografada e coradas para CD31 (marcado com setas pretas). imagens Histologia tomada em aumento de 200x. (B) ratinhos C57BL /6 (n = 21) foram injectados com células de LLC em seus flancos no dia 0. Começando no dia 12, os animais foram sacrificados, doseados com 7,5 mg /kg ICG 24 horas mais cedo e as suas cavidades torácica aberta. Os observadores determinado se os nódulos tumorais metastáticas eram visíveis no pulmão. imagiologia NIR foi então usado para detectar doenças que não era visível para o olho humano assistida-un. imagens Histologia tomada em 100x.

Em seguida, postulou que NIR rotulagem dos tumores poderia detectar depósitos de câncer de vários tamanhos no pulmão. 6 ratinhos C57BL /(n = 65) foram injectados no flanco (Dia 0) com uma linha celular de cancro de murídeo, Lewis Lung Cancer (LLC), que metastiza espontaneamente para o pulmão. A cada 3 dias, os ratinhos (n = 3) foram injectados com 7,5 mg /kg de ICG via veia da cauda. Os ratos foram sacrificados, e as caixas foram abertas e inspecionadas quanto a carga tumoral. tumores do flanco foram fotografadas como antes, e eles foram encontrados para ter uma fluorescência média de 53.290 ± 2668 au com um SBR média de 10,8. Menor contra tumores do flanco maiores tiveram pouca variabilidade na fluorescência (p 0,1). Descobrimos que NIR imagiologia dos pulmões de murino pode detectar a fluorescência a partir de metástases pulmonares tão cedo como o dia 15. Estes depósitos não eram visíveis a olho assistida-un e foram tão pequeno como 0,2 cm por histologia (Figura 1b). A fluorescência de tumor médio em pequenos depósitos iniciais sob dois milímetros foi 39,923 ± 4,577 UA, bem acima da fluorescência de fundo (média de 4290 au). Estes nódulos subcentimeter teve uma média de 9,3 SBR. nódulos pulmonares metastáticos tornou-se visível a olho assistida-un pelo Dia 24. O SBR dos tumores superior a 3 mm foi 9,8, e não significativamente diferente dos tumores menores. No entanto, a SBR dos tumores no pulmão era mais baixo do que o SBR dos tumores no flanco. Esta foi provavelmente devido aos desafios técnicos de imagiologia na pequena cavidade do peito do rato e sem relação com fluorescência tumor real.

Em resumo estes dados confirmam a hipótese de que NIR fluorescência de tumores sólidos pode distinguir os cancros da envolvente normais tecidos. Além disso, NIR de imagem pode identificar pequenos nódulos com SBR razoável e que este não parece depender de vascularização do tumor.

NIR imagem pode identificar tumores em órgãos sólidos em um modelo de câncer de pulmão canino ocorre naturalmente

imagiologia de pequenos animais é realizada num ambiente controlado, artificial, portanto, avaliada imagiologia NIR para identificação de tumores sólidos, em um modelo animal grande rigor na prática clínica. Oito caninos consanguíneas com tumores que ocorrem naturalmente que apresentaram para a Universidade da Pensilvânia Escola de Medicina Veterinária clínica de cirurgia com um tumor primário de pulmão foram incluídos no estudo com o consentimento informado de seus proprietários e aprovação institucional (Figura 2a). As idades variaram de 4 a 14 anos (mediana 10 anos) e os pesos variaram de 6 a 60 kg (média de 24 kg) (Tabela 1). Três cães foram esterilizados fêmeas e 5 cães eram machos castrados. Todos os cães receberam ICG através da veia cefálica sem quaisquer reacções adversas 24 horas antes da cirurgia.

(A) Signal-to-fundo proporção de tumor para o tecido circundante normal, pulmão

in situ Comprar e

ex vivo

em 8 caninos. Todos os valores são apresentados em unidades arbitrárias (u.a.).

† Devido ao grande tamanho deste tumor, nenhuma medição de fluorescência de pulmão normal podia ser obtido ex vivo. (B) Depois de abrir o peito, o tumor foi visualizado no peito. O tumor foi bem circunscrito e era altamente fluorescente (proporção 11,3 sinal-para-fundo). O tumor encontra-se na posição de caudal e o hilo do pulmão é craniana. (C)

Ex vivo

, o tumor era fluorescente (SBR 12,7) e as margens do tumor foram bem definido. (D) H E confirmado um adenocarcinoma do pulmão com 2+ CD31 coloração. A relação sinal-fundo (SBR) foi maior

ex vivo

que

in situ

por causa do controle superior do ambiente circundante, como as condições de iluminação, exposição e falta de movimento. Embora a fluorescência a partir dos tumores não se alterou de forma significativa, a fluorescência de fundo do pulmão normal foi reduzida quando o meio ambiente pode ser melhor controlada. Microscopicamente, a densidade microvascular tumoral (MVD) não parecem afetar o grau de fluorescência.

No momento da cirurgia, a fim de determinar se NIR imagem poderia identificar cânceres de pulmão dos tecidos circundantes, todos os caninos foram submetidos a imagiologia do tumor e de pulmão normal. O tamanho médio do tumor foi de 6,5 cm (intervalo de 2-15 cm).

In situ

, o tumor principal pode ser facilmente identificada no pulmão por NIR imagiologia (Figura 2b). Três leituras espectrais foram tomadas no centro do tumor e em 6 regiões em torno da borda do tumor. A intensidade de fluorescência da maioria dos tumores variou de 30.000 a 60.000 au. O parênquima pulmonar foi fotografada em vários locais para estabelecer um valor de emissão espectral de fundo. A maior parte da variabilidade ocorreu no parênquima pulmonar normal fundo porque a emissão espectral era baixa (inferior a 5000 UA) e difícil de quantificar. O tumor significativo SBR foi de 8,8, e o tumor SBR variou entre 2,9 e 20,8, portanto, que era fácil de distinguir do tumor a partir de tecido normal por imagiologia NIR. Quando se examinou a variabilidade intra-tumoral do centro do tumor para o aro do tumor, não havia diferença mínima (P 0,4). O cirurgião foi capaz de olhar para o NIR imagens em tempo real durante o processo e rapidamente identificar o tumor a partir de tecido normal. Todos os 8 tumores apareceram igualmente fluorescente para o cirurgião, e ele não conseguia identificar quais tumores tinham uma fluorescência baixa (ie. SBR 2,9) versus uma alta fluorescência (ie. SBR 20,8).

Nós descobrimos que houve substancial variabilidade na fluorescência do tumor de acordo com as condições de luz ambiente, a capacidade para posicionar o espectrómetro de e o acesso a todo o tumor no animal. A fim de obter leituras mais padronizados, os tumores foram ressecados a partir do cão e re-trabalhada sobre a mesa de trás da sala de operações.

ex vivo

, o tumor significativo SBR foi 11 vezes maior do que o parênquima pulmonar circundante (p = 0,016) (Figura 2c). Houve significativamente menos variabilidade intra-na fluorescência no tumor uma vez que as condições de iluminação e de posicionamento do espectrómetro pode ser melhor controlada sobre a mesa de volta. Removemos um outlier (Sujeito # 8) a partir deste cálculo, devido à forte sinal a partir do tumor (rácio 100+ diferença dobra de sinal-para-fundo entre o tumor e pulmão normal). Em média, encontramos o

ex vivo

imagem tinha uma SBR maior em relação ao

in situ

imagem (

in situ

SBR 8,8 contra

ex vivo

SBR 11.4) porque o ruído de fundo foi reduzido, não porque o tumor foi mais fluorescente (Figura 2d).

de modo a determinar se a fluorescência do tumor correlacionada com a vascularidade do tumor, comparou-se a SBR do tumor para a densidade microvascular (MVD). Todos os tumores primários foram coradas para CD31. Dois investigadores independentes classificaram os tumores como 0, 1+, 2+ e 3+ MVD. Houve uma grande variedade de fluorescência baseada na segurou a mão espectrômetro de ambos

in situ

e

ex vivo

, e dado o pequeno tamanho da amostra, nós não vê qualquer correlação entre a densidade vascular e grau de fluorescência (Figura 2d). Além disso, não pudemos avaliar o impacto do tamanho do tumor na fluorescência devido à falta de tamanho de amostra suficiente.

NIR de imagem não pode distinguir o câncer de atelectasia nas margens do tumor

Como tumores crescer e se desenvolver em um grande fardo no órgão anfitrião, a inflamação peritumoral pode ocorrer devido ao efeito de massa no suprimento de sangue do órgão e drenagem venosa. Por exemplo, lobos pulmonares freqüentemente desenvolvem pneumonite obstrutiva e congestão de um grande tumor bloqueando o brônquio e drenagem venosa a um segmento do pulmão. [24] Isto tem implicações importantes. Nos seres humanos, se um tumor provoca obstrução distal, o prognóstico é pior eo paciente é designado para ter câncer de pulmão T2. [25] Durante uma operação, cirurgiões muitas vezes não conseguem distinguir tecido tumoral a partir circundante alterações inflamatórias por palpação e visualização. Assim, queríamos determinar se NIR imagem poderia discriminar congestionamento peritumoral anormal do tecido normal e câncer, e se imagiologia NIR foi superior à capacidade dos cirurgiões para identificar o câncer da inflamação nas margens.

Em primeiro lugar, nós comparamos a sensibilidade de localizar o bordo do tumor pelo cirurgião em relação ao dispositivo de NIR. O carcinoma do pulmão foi palpado primeiro pelo cirurgião e pontos azuis foram colocados circunferencialmente para marcar a avaliação das margens do tumor dos cirurgiões. Em seguida, a câmara de NIR foi usada para identificar as margens do tumor. Se havia uma discrepância entre a avaliação da borda do tumor e a fluorescência dos cirurgiões, um outro ponto de marcação foi colocado na nova margem. emissões espectrais foram registradas em cada local.

Em 5 caninos, os tumores não têm qualquer pneumonite pós-obstrutiva, assim, não houve fluorescência significativo para além da borda do tumor. Nestes casos, as margens do tumor eram palpáveis ​​pelo cirurgião e semelhante às margens identificados por imagiologia NIR (Figura 3A). A borda do tumor era fluorescente (média de 51.324 AU), e os tecidos numa distância de 5 mm da extremidade do tumor foi marcadamente diferente. Dentro de 5 mm de distância a partir do tumor, do parênquima pulmonar já não era fluorescente (média de 12.642 au) e a SBR diminuiu desde mais de 8 a menos de 1,5. cortes seriados pelo patologista confirmou que tanto o cirurgião e imagiologia NIR pode identificar o bordo do tumor no prazo de 2 mm.

(A)

In situ

, o tumor pode ser visualizado e palpados. (B) Stitches marcar a margem do tumor em intervalos de 5 mm da margem do tumor palpável. (C) O espectrómetro foi usada para medir NIR de fluorescência (805 nm) em cada local sobre o espécime e desenvolver um mapa de calor. O mapa de calor previu as margens do tumor avaliadas pelo cirurgião e o patologista. Num segundo caso com inflamação significativa peritumoral, (D) as imagens intra-operatórios demonstraram um tumor em um lobo pulmonar, uma vez que foi recolhida a partir do peito canino. (E)

Ex vivo

, o lóbulo pulmonar poderia ser visto fluorescente, no entanto, foi difícil por brightfield ou fluorescência para discriminar as margens entre tecido tumoral e tecido pulmonar inflamatória. Espectroscopia demonstraram alguma diferença na fluorescência a partir do tumor contra o tecido congestionado, mas este foi clinicamente tedioso e não prático. O cirurgião também teve dificuldade em identificar tumor a partir de tecido não-tumoral por meio de palpação manual, porque o pulmão estava congestionado e edematoso.

Em 3 caninos, os tumores eram grandes (6, 8 e 15 cm) e que resultou em congestão venosa, pneumonite obstrutiva eo colapso dos tecidos que rodeiam o câncer. Nestes casos, verificou-se uma variabilidade significativa na fluorescência no tecido anormal que envolve o tumor. Estes tecidos anormais emitida elevado de fluorescência (Figura 3b). A diferença na fluorescência entre o bordo do tumor (média SBR 8,4) e 5 mm do bordo do tumor (média SBR 7,9) não foi marcadamente diferente. Mesmo a 10 mm de distância do bordo do tumor, a média SBR foi tão elevado quanto 5,7. Utilizou-se o espectrómetro para tentar melhorar a discriminação da SBR, no entanto, isso não melhorar a nossa capacidade de distinguir do tumor de inflamação. Histologicamente, as áreas de inflamação não tem células tumorais. Tinham distorcida arquitectura dos tecidos, macrófagos, edema, e em alguns casos maciças infiltração de neutrófilos e necrose. Quando o cirurgião olhou para as imagens ópticas, ele não conseguia distinguir do tumor de atelectasia ou inflamação baseado em fluorescência (Figura 4).

(A) No intra-operatório, o animal foi submetido a toracotomia e palpação do tumor primário direita. imagem intra-operatória do lóbulo pulmonar, uma vez que é recolhido a partir do peito canino revelou a porção dorsal do lobo tem uma compressão significativa (ie. atelectasia) por obstrução tumor. A porção ventral do pulmão manteve a sua aparência normal. análise espectroscópica do tumor foi realizada

in situ

. Todos os sites foram registrados em triplicado e média. O gráfico mostra o tecido inflamatório foi altamente fluorescente e não poderia ser distinguido de tumor. (B) H E demonstrou parênquima normal alveolar (painel esquerdo), pulmão congestionamento com neutrófilos e plugues fibróticas (painel do meio) e tumor (painel da direita) a partir de biópsias representativas do lobo pulmonar

Juntamente. , estes dados demonstraram que o NIR imagiologia pode distinguir com precisão as margens em tumores pulmonares em comparação com circundante parênquima pulmonar normal, mas não pode identificar com precisão as margens em tumores pulmonares que têm inflamação peritumoral. NIR de imagem não foi particularmente superior à capacidade dos cirurgiões de distinguir normal versus tecido canceroso.

NIR de imagem pode identificar tumores humanos sólidos

Para determinar se os tumores humanos podem distinguir-se do normal tecidos circundantes por imagiologia NIR, que matriculou 5 pacientes submetidos a cirurgia para a remoção do seu cancro (nódulos pulmonares 3, massa de parede 1 peito e massa mediastinal 1 anterior). As idades variaram de 49 a 69 anos (média de 62 anos). Dois cirurgiões chegaram a um consenso sobre o estádio clínico e abordagem operacional antes da cirurgia. Todos os pacientes incluídos foram pensados ​​para ter doença limitada, passível de cirurgia e sem metástases (ie. Potencialmente curáveis). O tamanho médio do tumor foi de 2,3 cm (intervalo 1,8-9,1 cm) de imagem pré-operatória. Os pacientes foram injectados com o ICG antes da cirurgia. No momento da cirurgia, a cavidade do corpo foi aberto e inspeccionado. Em todos os casos, o cirurgião pode visualizar imediatamente ou apalpar o tumor. Os pacientes foram submetidos a um padrão de atendimento a ressecção cirúrgica do tumor.

Uma vez retirado do paciente, o espécime foi examinado, aberto, biópsia e analisados ​​

ex vivo

. Qualitativamente, NIR imagiologia de fluorescência revelou forte em todas as massas. O espectrômetro de mão foi usada para semi-quantificar a fluorescência do tecido. Cada tumor tinha 4 medições em quatro locais perpendiculares e o centro do tumor (total de 20 medições /tumor). A média de fluorescência nos tumores humanos foi 51,756 ± 2,266 au com um SBR de 8,1. A fluorescência dos tumores era notavelmente homogénea em todo o tumor.

Em 4 casos, os tumores eram relativamente pequenas (intervalo 1,8-3,1 cm), e há não parecem ser qualquer inflamação peritumoral ou colapso. O sinal médio diminuiu de mais de 50.000 au na margem do tumor a menos de 20.000 au dentro de 5 mm da margem do tumor bruto. As margens do tumor estavam fácil de visualizar e Palpate dedo pelo cirurgião. Utilizando o dispositivo de imagem NIR, a fluorescência do tumor poderia ser facilmente distinguidos pelo cirurgião (Figura 5).

A tomografia computadorizada (TC) e tomografia por emissão de positrões (PET) scan demonstrou uma massa mediastinal anterior e uma nódulo pulmonar em dois pacientes. Os pacientes foram injectados com o ICG, e em seguida foi submetido a ressecção dos tumores.

Ex

vivo, NIR imagem demonstrado que os tumores eram altamente fluorescente e o órgão circundante teve o mínimo de ruído de fundo.