Abstract

O terceiro membro de transformar ácida proteína em espiral espiralada (TACC) família, TACC3, foi mostrado para ser um jogador importante na a regulação da dinâmica do centrossoma /microtúbulos durante a mitose e verificou-se ser desregulada em uma variedade de malignidades humanas. Os nossos estudos anteriores sugeriram que TACC3 podem estar envolvidos na progressão do cancro do colo do útero e quimiorresistência, e a sua sobre-expressão pode induzir a transição epitelial-mesenquimal (EMT) através da activação do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /Akt e proteínas quinases reguladas por sinais extracelulares (ERKs ) vias de transdução de sinal. No entanto, os mecanismos montante de EMT TACC3 mediada e sua funcional /importância clínica em câncer cervical humano são ainda imperceptíveis. factor de crescimento epidérmico (EGF) tem sido demonstrado ser um potente indutor de EMT no cancro do colo do útero e associada com a invasão tumoral e metástases. Neste estudo, descobrimos que TACC3 é overexpressed no cancro do colo do útero e pode ser induzida por estimulação EGF. A indução de TACC3 por EGF é dependente da actividade de tirosina-cinase do receptor de EGF (EGFR). Curiosamente, a depleção de TACC3 abole EMT EGF-mediada, sugerindo que é necessário para TACC3 processo EMT EGF /impulsionado-EGFR. Além disso, Caracol, um jogador chave no EMT mediada por EGF, é encontrado para ser correlacionada com a expressão de TACC3 em câncer cervical. Colectivamente, o nosso estudo destaca uma função nova para TACC3 no processo EMT mediada por EGF e sugere que a segmentação de TACC3 pode ser uma estratégia atraente para tratar cancros cervicais impulsionado por EGF /EGFR vias de sinalização

Citation:. Ha GH, Kim JL, Breuer E-KY (2013) TACC3 é essencial para EMT EGF-Mediated em Câncer cervical. PLoS ONE 8 (8): e70353. doi: 10.1371 /journal.pone.0070353

editor: Antimo Migliaccio, II Università di Napoli, Itália |

Recebido: 18 Março, 2013; Aceito: 17 de junho de 2013; Publicação: 01 de agosto de 2013

Direitos de autor: © 2013 Ha et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

epitelial-mesenquimal de transição (EMT) é um altamente. processo biológico conservado que resulta numa conversão de células epiteliais polarizadas para tipos de células mesenquimais, caracterizado por a perda de contactos célula-célula mediados por e-caderina, bem como a aquisição de aumento potenciais migratórios e invasivos [1] – [9]. Transcricional fatores Caracol, Lesma, Twist and Zeb1 foram identificados como reguladores negativos da E-caderina e são considerados potentes indutores oncogênicos de EMT [10] – [14]

Apesar do grande sucesso do rastreio precoce. programas, o cancro do colo do útero continua a ser a principal causa de morte ginecológico entre as mulheres em todo o mundo [15], [16]. papilomavírus humano (HPV) são pensados ​​para ser a principal causa de cancro do colo do útero; No entanto, os estudos mostraram que o vírus sozinho não é suficiente para desenvolver cancro [15], [17], [18]. factor de crescimento epidérmico (EGF) tem sido demonstrado ser um dos indutores mais potentes de EMT no cancro do colo do útero e associada com a invasão estromal cervical e metástases nodais [15], [19]. tratamento com EGF induz EMT crónica através de sobre-regulação de EMT-indução de factor de transcrição Snail em células de cancro cervical, e EMT mediada por EGF está correlacionada com o receptor de EGF (EGFR) e a progressão clínica do cancro cervical [15], [20]. A expressão do EGFR foi encontrado para ser sobre-expresso em cancro do colo do útero [21].

O ácido proteína em espiral espiralada família transformar (TACC) é caracterizado por um terminal-C “domínio TACC” conservada, essencial para o interacção com a tubulina e microtúbulos [22] – [24], e tem sido conhecida por desempenhar um papel chave na regulação do centrossoma e dinâmica dos microtúbulos [22], [25] – [29]. Existem três proteínas TACC identificados em humanos: TACC1, TACC2 TACC3 e [24], [30] – [32]. TACC3 está envolvido na montagem e organização dos microtúbulos e alinhamento dos cromossomos durante a mitose, a manutenção da estrutura envelope nuclear ea regulação do crescimento celular /diferenciação e transcrição de genes [24], [26], [27], [29], [ ,,,0],33] – [38]. Esgotamento de

TACC3

provoca retardo do crescimento e letalidade embrionária em ratos devido ao aumento da apoptose [39].

Embora o papel do TACC3 no câncer humano não é claro, evidência crescente sugere que a desregulação dos TACC3 pode ser directa ou indirectamente ligadas a determinados tipos de cancro humano [24]. variações genéticas no cromossomo 4p16.3, a codificação região

TACC3

, são encontrados em vários cancros humanos [9], [24], [40] – [48]. O gene de crescimento de fibroblastos receptor do fator de 3 (

FGFR3

) e

TACC3

estão intimamente localizado no cromossoma 4p16.3 [9], [32]. Recentemente, uma proteína de fusão TACC3-FGFR3 foi relatada em um subconjunto de glioblastoma multiforme (GBM) [49] e tecidos de tumor da bexiga e linhas de células [50]. Esta proteína de fusão induz defeitos de mitose e aneuploidia e ativa quinase ativada por mitógeno proteína (MAPK) [49] sinalização, [50]. Até agora, uma mutação somática (E680K) e duas mutações constitucionais (S93L e G514E) de

TACC3

foram identificados no GBM e cancro do ovário, respectivamente [40], [51], [52]. Estudos têm mostrado que a sobre-regulação de TACC3 é encontrado em glioblastoma, cancro do pulmão de não pequenas (NSCLC) e mieloma múltiplo [40], [53], [54] e podem contribuir para lymphomagenesis [55], [56]. perfil de expressão gênica análise revelou que

TACC3

é regulado para cima durante a transição de carcinoma ductal

in situ

a carcinoma invasivo da mama e no cancro do ovário [57] – [59]. Foi anteriormente proposto que TACC3 podem ser directamente ou indirectamente associada com a progressão de tumores e resistência a drogas de cancro do colo do útero, com base em dados obtidos a partir da análise de microarranjo para identificar genes regulados por TACC3 [24], [60]. Além disso, o nosso estudo recente demonstrou que a expressão ectópica de TACC3 aumenta a proliferação, capacidade migratória /invasivo e capacidade de transformação de células de cancro do colo do útero HeLa e exibe um fenótipo mais mesenquimal, acompanhada por sub-regulação do marcador epitelial de E-caderina e a sobre-regulação de marcadores mesenquimais N-caderina e vimentina, bem como indutores do Slug EMT caracol e [9]. Por outro lado, o empobrecimento de TACC3 é capaz de reverter /suprimir EMT [9]. Embora a nossa descoberta indica que TACC3 pode desempenhar um papel importante na EMT, os eventos de sinalização a montante responsáveis ​​pela EMT TACC3 mediada continuam a ser determinado.

Aqui, nós demonstramos que TACC3 é overexpressed em câncer cervical. TACC3 pode ser induzida por EGF, e a indução TACC3 mediada por EGF é dependente da activação do EGFR. Importante, na ausência de TACC3, o EGF não é capaz de induzir EMT, sugerindo que é necessário para TACC3 EMT mediada por EGF no cancro do colo do útero. Além disso, encontramos uma correlação entre TACC3 e EGF indutor Caracol em câncer cervical. Nossos resultados, portanto, identificar um novo mecanismo que medeia EGF /EMT induzida por EGFR e um potencial alvo terapêutico para o câncer cervical.

Materiais e Métodos

Tissue microarrays e imunohistoquímica

microarrays de tecido de cancro do colo do útero (CR805, CR1003 e CR1501) foram adquiridos a partir de US Biomax (Rockville, MD). Tissue microarrays de dados do paciente é mostrada na Tabela 1. As lâminas Tissue microarrays foram desparafinados, re-hidratados e tratados termicamente, para a recuperação de antigénio antes da coloração com anticorpos [61]. As lâminas foram incubadas com um anticorpo anti-TACC3 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) durante 1 h à temperatura ambiente, seguido de incubação com o anticorpo secundário biotinilado e a Avidina Biotina complexo (ABC), em conformidade com o protocolo do kit Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Depois de desenvolver a cores com diaminobenzidina (DAB), as lâminas foram avaliadas independentemente pelos autores. A intensidade de coloração foi registada como se segue: 0 para a expressão negativa; 1+ para a expressão fracamente positivo; 2+ para a expressão positiva médio; e 3+ para a expressão altamente positivo. Fotomicrografia (ampliação x 100) foi feita pelo DP12 microscópio (Olympus, Tóquio, Japão) equipado com sistema de imagem digital DP71 (Olympus).

cultura de células, anticorpos e reagentes

A cancro do colo do útero humano (HeLa, CaSki, SiHa e C33A) e linhas de células imortalizadas por HPV epitélio ectocervical (Ect1 /E6E7) foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC) (Manassas, VA). As células HeLa foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) (Hyclone, Logan, UT) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Gemini Bio-products, Woodland, CA) e 1% de solução de penicilina /estreptomicina (Thermo Fisher Scientific , Waltham, MA). células CaSki foram mantidas em meio RPMI-1640 (Hyclone) contendo 10% FBS e 1% de solução de penicilina /estreptomicina. células SiHa e C33A foram cultivadas em MEM (Hyclone), complementado com 10% de FBS e 1% de solução de penicilina /estreptomicina. Ect1 /E6E7 células foram cultivadas em queratinócitos-meio isento de soro (Ker-SFM; Gibco /BRL Life Technologies, Gaithersburg, MD) com 0,1 EGF ng /ml recombinante humano, 0,05 mg /ml de extracto de pituitária bovina e cloreto de cálcio adicional de 44,1 mg /L (concentração final 0,4 mM). As células foram incubadas a 37 ° C numa incubadora humidificada com 5% de CO

2. O anticorpo anti-TACC3 foi adquirido da Santa Cruz Biotechnology. Os anticorpos contra a E-caderina, N-caderina, vimentina, Snail, Lesma e EGFR foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). -Anti-actina β anticorpo e EGF foram adquiridos a Sigma (St. Louis, MO). O inibidor de cinase de EGFR foi adquirido a partir de AG1478 Selleckchem (Houston, TX).

shRNA e transfecção

As células foram transfectadas com uma específica-TACC3 ou um shRNA controlo (Santa Cruz Biotechnology), utilizando FuGENE 6 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) de acordo com as instruções do fabricante.

Análise Western Blot

lisados ​​de tecido do cérvix normal humana foram adquiridos a Imgenex (San Diego, CA). Os extractos celulares foram preparados em tampão de lise consistindo em 50 mM de Tris-Cl (pH 7,4), 1% phenoxypolyethoxylethanol nonilo (NP-40), 0,25% de desoxicolato de sódio, 150 de cloreto de sódio mM (NaCl), ácido etilenodiaminotetracético 1 mM (EDTA) , 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo (PMSF), 1 mM de fluoreto de sódio (NaF) e cocktail de inibidor de protease completa (Roche Molecular Biochemicals). Os lisados ​​celulares foram clarificados por centrifugação a 13.000 rpm durante 10 min, e os sobrenadantes foram sujeitos a análise de Western blot. Quantidades iguais de proteína foram separados por sulfato de dodecilo e sódio (SDS) electroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. Após bloqueio com uma solução salina tamponada com Tris (TBS) /0.1% Tween 20 (TBS-T) suplementado com leite em pó magro a 5% durante 1 h, as membranas foram incubadas com anticorpos primários diluídos em tampão de bloqueio durante 2 horas à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C, seguido de incubação com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários (Bio-Rad, Hercules, CA) durante 1 h à temperatura ambiente. Finalmente, os complexos antigénio-anticorpo foram detectados por quimioluminescência aumentada (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido). Bandas foram quantificados usando o software ImageJ (https://rsb.info.nih.gov/ij/, NIH, Bethesda, MD) e normalizado para p-actina.

quantitativa em tempo-real da polimerase Reacção em Cadeia (qRT -PCR)

ARN total a partir de células foram extraídos utilizando o kit de mini-RNeasy® (Qiagen Ciências, Germantown, MD) e, em seguida, submetido a síntese de ADNc utilizando o kit ™ RevertAid First Strand cDNA Synthesis (Fermentas Life Sciences Europa, Bremen, Alemanha). A expressão de genes foi analisada utilizando um QI ™ SYBR

R Supermix verde (Bio-Rad) e um tempo real do sistema de detecção de PCR iCycler IQ5 (Bio-Rad). Foram utilizadas as seguintes condições de ciclo: 95 ° C durante 5 min e 30 seg, seguido de 40 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 1 min a 60 ° C. Os dados foram analisados ​​com um método de expressão de genes normalizados (ΔΔ Ct) [62] usando a IQ5 software do sistema óptico (Bio-Rad), e

β-actina

foi utilizado como referência para normalização. As sequências dos pares de iniciadores foram como se segue:

TACC3

5′-gaactggggaagatcatgga-3 ‘e 5′-ctcttcgttcttgcggtagc-3’ [63];

β-actina

5actinINK \\ l \\ o “Ulisse de 2007 # 484” gtagc-3 ‘CGG-3i [64]. Todas as medições foram realizadas em triplicado.

Transwell Migration Assay

inserções de cultura de células não revestidos (poros de 8 mm, 24 poços) (Greiner Bio-One, Monroe, NC) foram semeadas com 1 × 10

5 células em 200 ul de meio isento de soro. As câmaras inferiores foram cheias com 750 uL de meio completo contendo 10% de FBS. Após 16 h de incubação, as células na superfície superior do filtro foram varrido, e as células que tinham migrado para a superfície inferior do filtro foram fixadas com 4% de paraformaldeído ou gelo metanol frio durante 5 minutos, coradas com 0,05% de violeta de cristal durante 20 min e quantificado espectrofotometricamente a 490 nm.

Invasão Ensaio

ensaios de invasão foram realizadas utilizando os kits de QCM ECMatrix invasão da célula de ensaio (Millipore, Temecula, CA) de acordo com as instruções do fabricante.

Análise estatística

As análises estatísticas foram realizadas utilizando GraphPad Prism 5.0 (GraphPad, San Diego, CA). A significância foi determinada por

t

-teste e um caminho-de Análise de Variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparações múltiplas de Tukey. coeficiente de correlação de Pearson foi utilizado para medir a correlação entre duas variáveis. A

p-valor

inferior a 0,05 foi considerado como significância estatística.

Resultados

TACC3 é sobre-expresso em cancro do colo

Para investigar a importância clínica de TACC3 no cancro cervical humano, primeiro analisou a expressão de mRNA TACC3 no cancro do colo do útero usando o banco de dados publicamente disponíveis Oncomine (www.oncomine.org, Compendia Bioscience, Inc., Ann Arbor, MI) [65] e determinou que TACC3 é altamente expressa em câncer cervical [66], [67]. A sobre-expressão de TACC3 no cancro do colo do útero foi ainda confirmada em várias linhas de células do colo do útero, incluindo Ect1 /E6E7 (HPV-16 de E6 /E7 transformado epitélio ectocervical), CaSki (HPV-16), C33A (HPV-negativo), células HeLa (HPV-18 ) e SiHa (HPV-16) em comparação com três tecidos humanos normais do colo do útero. Como mostrado na Figura 1A, a expressão de TACC3 nestas linhas celulares foi maior do que a dos tecidos normais do colo do útero. Curiosamente, não houve diferença significativa na expressão de TACC3 C33A entre HPV-negativas e outras células que transportam os oncogenes de HPV (Ect1 /E6E7, CaSki, SiHa e HeLa), sugerindo que a infecção pelo HPV não pode ser responsável pela sobreexpressão de TACC3. Analisamos também imunohistoquímica da expressão de TACC3 utilizando microarrays de tecido de cancro do colo do útero. TACC3 era quase indetectável no cérvix normal, enquanto que a sua expressão forte foi observada em tecidos de cancro do colo do útero (Figura 1B). No entanto, não houve associação significativa de expressão TACC3 com o estágio clínico ou grau da doença (Figura 1C, 1D e S1). Com base nas nossas constatações de que a expressão de TACC3 é elevada em cancro do colo do útero em relação ao colo uterino normal, mas não significativamente associados com a progressão da doença, que sugerem que a expressão aumentada de TACC3 pode ocorrer nas fases iniciais do desenvolvimento do tumor, bem como ser essencial para a manutenção do colo do útero tumorigénese.

(A) A expressão de TACC3 em Ect1 /E6E7 (imortalizada HPV-epitelial ectocervical), CaSki (HPV-16), C33A (HPV-negativo), SiHa (HPV-16) e HeLa ( -linhas 18 de HPV) de células foi determinado por análise de western blot. Os níveis de expressão foram comparadas com três tecidos normais do colo do útero. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. A intensidade das bandas foi quantificada utilizando o software ImageJ e normalizado para p-actina. Os dados mostrados são médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. (B) coloração imuno-histoquímica Representante, em tissue microarray câncer cervical. A análise quantitativa de microarrays de tecido de cancro do colo do útero mostrou que a expressão de TACC3 é maior do que no cancro do colo do útero no cérvix normal, mas a sua expressão não se correlaciona com a fase do tumor (C) ou grau (D). Os dados mostrados são médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. *,

p Art 0,05; **,

p

. 0,001

EGF Estimulação Induz endógena TACC3 expressão em células que expressam EGFR

O nosso estudo anterior indicou que a superexpressão de TACC3 induz EMT , acompanhada por sub-regulação da caderina-e e aumento da regulação do Caracol e Slug, ao passo que o esgotamento dos TACC3 inverte EMT [9]. Além disso, a activação de Akt e ERK vias de sinalização é essencial para EMT TACC3 mediada [9]. Aqui, buscou-se determinar como TACC3 participa de EMT. factores de crescimento diversos, tais como EGF, factor de crescimento transformante β (TGF-β) e factor de crescimento 1 semelhante à insulina têm sido mostrados (IGF-1) para induzir EMT e estão significativamente associados com a capacidade de invasão, metástase e recorrência de cancro cervical [ ,,,0],15], [68] – [70]. EGF tem sido mostrado induzir EMT através de sobre-regulação de Snail em células de cancro cervical [15] e activar Akt e ERK vias de sinalização [71], [72]. Com base nestes estudos, a hipótese de que TACC3 pode estar envolvido na EMT mediada por EGF. Para testar a hipótese, células tratadas com células HeLa, CaSki e SiHa, com 50 ng /ml de EGF durante 24 h e, em seguida, examinadas as alterações morfológicas das células e a expressão dos marcadores de EMT. Como mostrado na Figura 2A, as células tratadas com EGF exibida características morfológicas e fenotípicas de EMT. Curiosamente, ambos proteína (Figura 2B) e ARNm (Figura 2C) níveis de TACC3 foram significativamente aumentados após estimulação EGF, acompanhada por sub-regulação do marcador epitelial de E-caderina e a sobre-regulação do marcador mesenquimais vimentina, bem como indutores EMT caracol e Slug em HeLa, CaSki e SiHa células (Figura 2B). experimentos curso de tempo também foram realizados para verificar a indução de TACC3 após estimulação EGF. EGF induziu uma expressão sustentada de TACC3 em CaSki e SiHa células até 48 h, enquanto um aumento temporário na expressão TACC3 foi encontrado em células HeLa (Figura S2). Nós também descobrimos que EGF promovido capacidades migratórias e invasivos de células HeLa e SiHa (Figura 2D e 2E), consistentes com outros estudos [15], [73]. Nós não vimos quaisquer mudanças significativas na morfologia celular (Figura 3A), a expressão de TACC3 e outros marcadores de EMT (Figura 3B), ou motilidade (Figura 3C) em células C33A tratados com EGF. Isto é mais provável porque C33A expressa níveis muito baixos ou não detectáveis ​​de EGFR (Figura 3D). Estes resultados sugerem que o EGFR é necessária para a indução mediada por EGF de TACC3 e EMT subsequente.

células de cancro do colo do útero (A) tratadas com EGF mostrou uma alteração morfológica associada com EMT. (B e C) Ambos os níveis de mRNA (C) de TACC3 proteína (B) e foram-regulada por estimulação EGF, juntamente com a infra-regulação da caderina-E e aumento da regulação do Vimentin, Caracol e Slug. p-actina foi utilizado como controlo de carga. A intensidade das bandas foi quantificada utilizando o software ImageJ e normalizado para p-actina. O nível de ARNm de TACC3 foi representada em relação ao transcritos de p-actina. Os dados mostrados são médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. células (D e E) HeLa e SiHa tratadas com ou sem EGF foram sujeitas a migração de Transwell (D) e ensaios de invasão de Matrigel (E) (ver Materiais e Métodos). As células foram incubadas com ou sem 50 ng /ml de EGF durante 24 h. Os dados mostrados são médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01; ***,

p Art 0,005; ****,

p

. 0,001

Células C33A tratados com EGF não mostrou mudanças significativas na morfologia celular (A), expressão de TACC3 e marcadores de EMT (B ), ou a motilidade (C). As células foram incubadas com ou sem 50 ng /ml de EGF durante 24 h e, em seguida, submetido a ensaios de Western blot e migração Transwell. A intensidade das bandas foi quantificada utilizando o software ImageJ e normalizado para p-actina. Os dados mostrados são médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. (D) A expressão de EGFR em Ect1 /E6E7, CaSki, C33A, SiHa e HeLa foi determinada por análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. A intensidade das bandas foi quantificada utilizando o software ImageJ e normalizado para p-actina. Os dados apresentados são médias ± DP de pelo menos três experiências independentes.

A ativação do EGFR é necessária para a indução mediada por EGF da TACC3

Como nossos dados indicam que o tratamento EGF pode aumentar o expressão de TACC3 em células que expressam EGFR, questionado se a indução mediada por EGF de TACC3 é dependente da actividade de tirosina quinase de EGFR. AG1478 é um inibidor da tirosina-cinase de EGFR, que bloqueia os eventos de sinalização mediada por EGFR [74], [75]. O tratamento com 5 uM de AG1478 abolida alterações morfológicas induzidas por EGF (Figura 4A) e indução TACC3 (Figura 4B), e, como consequência, EMT-EGF mediada foi inibida (Figura 4B). Estes dados sugerem que a activação de EGFR é necessária para a indução TACC3 mediada por EGF.

A inibição da actividade de tirosina quinase de EGFR abolida uma alteração morfológica associada com EMT (A) e a indução mediada TACC3-EGF (B). As células foram tratadas com EGF ou EGF + AG1478 durante 24 h e, em seguida, submetidos a análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. A intensidade das bandas foi quantificada utilizando o software ImageJ e normalizado para p-actina. Os dados mostrados são médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. *,

p

. 0,001

TACC3 é necessária para o processo EMT mediada por EGF

Uma vez que tanto TACC3 e EGF pode promover EMT através da ativação de PI3K /Akt e ERK vias de sinalização [9], [71], [72], e TACC3 pode ser regulada para cima sobre EGF estimulação (Figura 2B, 2C e S2), que questionado se TACC3 desempenha um papel importante na EMT mediada por EGF . Para resolver esta questão, empobrecido TACC3 usando um vector lentiviral entrega shRNA específico para TACC3 em células HeLa e SiHa e tratada com ou sem EGF. Como foi previamente relatado [9], o esgotamento dos TACC3 levaram à sobre-regulação de E-caderina e a sub-regulação de vimentina, Snail e Slug em células HeLa e SiHa em comparação com células de controlo (Figura 5A). Curiosamente, o tratamento com EGF em células TACC3-empobrecido não foi capaz de reverter a expressão de marcadores EMT (Figura 5A), a morfologia celular (Figura 5B), a migração celular (Figura 5C) ou capacidade de invasão (Figura 5D). Estes achados sugerem que TACC3 pode desempenhar um papel-chave na EMT mediada por EGF.

Na ausência de TACC3, o EGF não foi capaz de regular marcadores EMT (A), alterar a morfologia celular (B), ou aumentar a célula capacidades de migração e invasão (C e D). As células foram transf ectadas transitoriamente com shRNAs contra o controle (mexidos,

shCon

) ou TACC3 (

shTACC3

) e tratadas com ou sem EGF durante 24 h. As células foram então sujeitas a Western blot, a migração Transwell e ensaios de invasão de Matrigel. A intensidade das bandas foi quantificada utilizando o software ImageJ e normalizado para p-actina. Os dados mostrados são médias ± DP de pelo menos três experiências independentes.

*

,

p

0,01;

**, p

. 0,001

Uma correlação positiva existente entre TACC3 e Snail Expressão em Câncer Cervical

Snail tem sido conhecido por ser induzida por EGF , desencadeando assim o EGF-mediada EMT [15], [76]. Descobrimos que TACC3 também foi induzida por estimulação EGF (Figura 2B e 2C), e regula positivamente a expressão de Snail [9]. Portanto, questionamos se existe alguma correlação entre a expressão TACC3 e Caracol em câncer cervical. Mais importante, verificou-se que a expressão de Snail foi elevada no cancro do colo do útero (Figura 6A e 6B) e correlacionada com a expressão TACC3 (Figura 6C). No entanto, a expressão TACC3 não se correlacionou com a expressão de Slug, um outro membro da família do caracol (dados não mostrados).

(A) coloração imuno-histoquímica e representativas de TACC3 Snail em tissue microarray cancro cervical. análise quantitativa de microarrays de tecido de cancro do colo do útero mostrou que (B) a expressão de Snail é maior no cancro do colo do útero do que no colo do útero normal. Os dados mostrados são médias ± DP de pelo menos três experiências independentes. *,

p Art 0,001 (C) Caracol expressão se correlaciona com a expressão TACC3 (r = 0,80383,

p 0,0001

).

Discussão

foi suspeita-se que a desregulação (tanto para cima e para baixo-regulação) do TACC3 pode estar associada com o desenvolvimento de vários tipos de cancro humano [24], [77], [78]. Até agora, se TACC3 actua como um supressor de tumor ou um oncogene não tem sido claramente definida, devido às discrepâncias entre os estudos [24], [79]. Alternativamente, TACC3 podem ter diferentes funções, dependendo do tipo de célula ou órgão. Neste estudo, teve como objetivo investigar o significado funcional de TACC3 em câncer cervical. Nossa análise tissue microarray câncer cervical revelou que a expressão da proteína TACC3 é regulado para cima em carcinoma de células escamosas do colo do útero, o tipo mais comum de cancro do colo do útero (aproximadamente 80-90%) [80]. Isto é consistente com os dados obtidos a partir de Oncomine [67] e sugere o seu papel potencial como um oncogene no cancro do colo do útero. Nosso estudo também sugere que a expressão de TACC3 não pode ser regulamentada por oncogenes HPV E6 /E7, no entanto, no momento, não podemos descartar a possibilidade de que a expressão TACC3 é regulada por oncogenes de HPV ou correlacionados com os tipos de HPV.

EGF desencadeia uma cascata de eventos de sinalização através da interação com seu receptor, EGFR [81], e tem sido provado ser um potente indutor da EMT no cancro do colo do útero [15]. eventos de sinalização de EGF /EGFR estão associados com a progressão do tumor de cancro cervical acelerado [15], [19], [82]. Neste estudo, descobrimos que TACC3 foi regulado para cima com a estimulação EGF, e do esgotamento de TACC3 abolida processo EMT EGF-mediada em células de cancro do colo do útero. Além disso, a indução de TACC3 por EGF foi inibida com êxito por o inibidor de EGFR AG1478, indicando que a indução mediada por EGF TACC3 e subsequente EMT são dependentes da activação do EGFR. Curiosamente, verificou-se que em células C33A, TACC3 expressão foi muito mais elevado do que em células CaSki ou SiHa, apesar da ausência de expressão do EGFR. Embora o nosso estudo sugere que a activação do EGFR pode ser um dos mecanismos responsáveis ​​pela regulação da expressão de TACC3, sinalização a montante que regula a expressão de TACC3 não foi ainda bem definido. Tem havido até agora apenas uma demonstração estudo publicado diminuiu a estabilidade da proteína TACC3 de forma CDH1-dependente [83]. TACC3 interage com um activador da ubiquitina-ligase E3-promovendo anafase complexo /ciclossoma (APC /C), CDH1, e a sua interacção reduz a estabilidade da proteína TACC3 através de ubiquitinação e degradação mediada por CDH1 durante a progressão do ciclo celular. Uma possibilidade é que consideramos células C33A podem expressar níveis mais baixos de CDH1 do que outras linhas de células, assim mantendo elevados níveis de TACC3. Curiosamente, ao contrário SiHa, CaSki e linhas de células HeLa, células C33A não abrigam os genomas de HPV, mas que contêm a p53 mutante [84] e pRb [85]. Além disso, vários receptores do factor de crescimento expressos em C33A são um pouco diferente de SiHa, CaSki e células HeLa [86], [87]. Portanto, é possível que a expressão TACC3 pode ser regulamentada por diferentes vias de sinalização dependendo do tipo de célula.

Há um crescente corpo de evidências que demonstram a associação de TACC3 com vias de sinalização EGFR. TACC3 tem sido identificada como um parceiro de interacção do transdutor de sinal e activador de transcrição 5 (STAT5) [39], e a sua expressão tem sido mostrado para ser correlacionado com Aurora A expressão em determinados tipos de cancros [40], [63]. De forma intrigante, também se associa EGFR e coopera com STAT5 para alvejar e aumentar a expressão de Aurora A, e a sua expressão é encontrado para ser correlacionado com Aurora A expressão em cancros da mama e colorrectal [81]. Portanto, é razoável pensar que TACC3 pode formar um complexo com o EGFR, directa ou indirectamente, através da sua interacção com STAT5, e desse modo estar envolvidos em vias de sinalização de EGFR. TACC3 Também foi descoberto como um translocator receptor de hidrocarboneto aromático (AhR) nuclear (ARNT) -interacting proteína [88]. ARNT pertence à hélice-volta-hélice (bHLH) -Por-ARNT-Sim (PAS) família que dimeriza com AhR e α fator de hipoxia-induzida (HIF α) sobre o estresse ambiental [89], [90]. Como um cofactor de transcrição, TACC3 é capaz de regular a activação da transcrição de HIF através da interacção directa com o ARNT [91]. Um estudo recente mostrou que ARNT desempenha um papel importante na diferenciação epidérmica através da regulação das vias de sinalização de EGFR-ERK [92]. Deste modo, é tentador especular um potencial envolvimento de TACC3 na rede de ARNT-EGFR-ERK para regular a diferenciação de queratinócitos.

EGFR é expresso a níveis moderados a elevados em cancro do colo do útero, e a sua expressão está associada com estadiamento clínico e prognóstico ruim [93], [94]. Mutações em

EGFR

foram mostrados para ser rara no cancro cervical invasivo de elevado grau [95]. Até agora, apenas alguns ensaios clínicos em pequena escala foram testados para avaliar a eficácia de inibidores de EGFR para o tratamento de cancro cervical. Infelizmente, a monoterapia inibidor EGFR não foi eficiente em pacientes com câncer recorrente locorregionalmente avançado ou metastático cervical [94], [96]. As combinações de inibidores de EGFR com quimioterapia ou quimiorradioterapia estão atualmente sob investigação.

Desde TACC3 é sobre-expresso em cancros do colo do útero e outros, e parece ser um jogador chave no processo /EGF EMT-driven EGFR, é possível que a depleção de TACC3 pode ser uma boa aproximação para o tratamento de cancros que são conduzidos por EGF /EGFR vias de sinalização ou resistentes a terapia anti-EGFR. Embora mutações no

EGFR

no câncer cervical invasivo de alto grau são raras, seria importante estudar uma associação entre a expressão TACC3 e

EGFR

mutações. No geral, nossos resultados sugerem que TACC3 desempenha um papel importante na EMT mediada por EGF e pode servir como um alvo terapêutico atractivo para os cânceres humanos dirigidos por EGF /EGFR vias de sinalização.

Informações de Apoio

Figura S1.

A expressão de TACC3 no cancro cervical em relação ao estágio da doença e classificação histológica. A expressão de TACC3 com diferentes estágios da doença e grau do tumor foi apresentado. *,

p Art 0,05; **,

p Art 0,01; ***,

p Art 0,001

doi: 10.1371 /journal.pone.0070353.s001

(TIF)

Figura S2.

estimulação EGF induz a expressão TACC3 endógena. TACC3 foi induzida por tratamento com EGF. As células foram incubadas com ou sem 50 ng /ml e, em seguida, recolhidas nos pontos de tempo indicados para análises de Western blot.