Abstract

Muscle invasiva cancro da bexiga (CINM, estágio ≥T2) é geralmente associado com mau prognóstico, constituindo a segunda causa de morte mais comum entre os tumores do trato geniturinário. Devido à heterogeneidade variações significativas de alto peso molecular no resultado histórico e natural da doença têm sido observados. Isso também tem atrasado a introdução de terapias personalizadas, tornando o cancro da bexiga estágio avançado quase uma doença órfã em termos de tratamento. Altered glicosilação da proteína traduzida pela expressão do antigénio Tn sialil-(STN) e o seu precursor, Tn, bem como a activação de Akt da via PI3K //mTOR são eventos associados ao cancro que podem ter potencial para a estratificação de pacientes e o tratamento orientado. Portanto, um desenho retrospectivo, 96 tumores de bexiga de diferentes estágios (Ta, T1-T4) foi exibido para a STN e formas fosforiladas de Akt (pAkt), mTOR (pmTOR), S6 (PS6) e PTEN, relacionada com a ativação do PI3K /Akt /mTOR. Em nossa série a expressão de Tn foi residual e não estava ligada à fase ou resultado, enquanto STN foi estaticamente superior no CINM, quando comparado com tumores invasivos não-musculares (p = 0,001) e associada diminuição da sobrevida específica por câncer (log rank p = 0,024). Por outro lado, PI3K /Akt /mTOR intermediários da via mostraram uma distribuição igual entre os não-muscular câncer de bexiga invasivo (NMIBC) e MIBC e não se associou com a sobrevivência ao câncer especi (CSS) em qualquer um desses grupos. No entanto, a superexpressão de pAKT, pmTOR e /ou PS6 permitido discriminar tumores estágio avançado da bexiga STN-positivas enfrentam pior CSS (p = 0,027). Além disso, a análise de regressão multivariada de Cox revelou que a superexpressão de /Akt /mTOR proteínas via PI3K em STN + CINM foi independentemente associada com um risco aproximadamente 6 vezes maior de morte por câncer (p = 0,039). Os ratinhos portadores estágio avançado tumores de bexiga induzidas quimicamente que imitam a natureza histológica e molecular dos tumores humanos foram então administradas com sirolimus inibidor de mTOR da via (rapamicina). Isto diminuiu o número de lesões invasivas e, concomitantemente, a expressão de STN e também PS6, o efector a jusante da via PI3K /Akt /mTOR. Em conclusão, a STN foi encontrado para ser marcador de mau prognóstico no câncer de bexiga e, em combinação com a avaliação via PI3K /Akt /mTOR, tem potencial para melhorar a estratificação da doença em estágio. Experiências com animais sugerem que a inibição da via mTOR poderia ser uma potencial abordagem terapêutica para este subtipo específico de MIBC

citação:. Costa C, Pereira S, G Lima, Peixoto A, Fernandes E, Neves D, et al. (2015) glicosilação de proteínas anormais e PI3K activada /Akt /mTOR Caminho: Papel no cancro de bexiga Prognóstico e Therapeutics visados. PLoS ONE 10 (11): e0141253. doi: 10.1371 /journal.pone.0141253

editor: Francisco X. real, Centro Nacional de Investigações Oncológicas (CNIO), ESPANHA

Recebido: 28 Julho, 2015; Aceito: 06 de outubro de 2015; Publicação: 16 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Costa et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Fundação Português para a Ciência e Tecnologia (FCT) Pós-Doutorado concede SFRH /BPD /66288/2009 (José Alexandre Ferreira), SFRH /BPD /101827/2014 ( Luis Lima), SFRH /BPD /85462/2012 (Rui Gil da Costa) e bolsas de doutoramento SFRH /BD /103571/2014 (Elisabete Fernandes) e SFRH /BD /111242/2015 (Andreia Peixoto). A FCT é co-financiado pelo Fundo Social Europeu (FSE), sob o Potencial Humano Programa de Operação (POPH) do Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN). Os autores reconhecem também o apoio financeiro do ICBAS-UP (Céu Costa e Sofia Pereira) e da Associação Português de Urologia /Pfizer prêmio de 2013. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do . manuscrito

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de bexiga é o segundo mais mortal tumor geniturinário e apresenta significativamente pior prognóstico em cima

muscular própria

invasão [1]. Aproximadamente 20-30% dos novos casos diagnosticados são musculares cânceres invasivos bexiga (CINM; estágios T2-T4), enquanto 50% são não-musculares tumores invasivos bexiga (NMIBC) com elevado potencial para avançar para a invasão. tratamento CINM inclui cistectomia e (neo) adjuvantes baseados em cisplatina regimes de quimioterapia [2]. No entanto, variações significativas na história natural da doença e resposta ao tratamento pode ser observada entre os tumores com características histológicas idênticas, refletindo sua heterogeneidade molecular elevado [3]. Além disso, aproximadamente 50% dos casos desenvolvem metástases dentro de 5 anos, pedindo a identificação de biomarcadores para ajudar o prognóstico eo desenvolvimento de terapias direcionadas mais eficazes [4].

Para atender a essa necessidade, temos abordado recentemente a expressão do antígeno sialil-Tn associado a um cancro (STN) em uma pequena série prospectiva de pacientes com câncer de bexiga não selecionados [5]. STN é uma modificação pós-translacional anormal que resulta de uma paragem prematura em proteínas de membrana celular

O

-glycosylation por sialilação do anti gene Tn (Fig 1A). Em tumores de bexiga, STN foi principalmente presentes em casos estágio avançado, enquanto ausente de mais baixo grau NMIBC [5]. Além disso, não foi expressa pelo urotélio normal, denotando um carácter específico do cancro [5]. Estudos

in vitro

mostraram que a expressão STN dotado células cancerosas da bexiga com capacidade de invasão alta [5] e um fenótipo immunotolerogenic, potencialmente favorecendo a disseminação da doença [6]. As alterações na glicosilação de proteínas da superfície celular foram estar implicado na activação de vias de sinalização oncogénicos intracelulares [7], incluindo o fosfoinositide-3-quinase (PI3K) /Akt via de sinalização [8] que se pensa desempenhar um papel crítico no desenvolvimento do cancro da bexiga . Estas observações preliminares suportam a hipótese de que a expressão STN pode desempenhar um papel-chave na evolução da doença, o que justifica uma investigação mais aprofundada. Vários estudos também sugerem que o anti gene Tn, que é um precursor de STN, pode ser também implicado em acontecimentos oncogénicos [7]; no entanto nada se sabe sobre a expressão deste glicano em tumores de bexiga.

A Representação) da proteína de membrana

O

-glycosylation com ênfase na expressão STN por células cancerosas. Este é um processo altamente regulado de importância crítica para a estabilidade e função da proteína. Resumidamente, as proteínas recentemente sintetizadas são

O

-glycosylated no aparelho de Golgi por meio da adição ppGalNAcTs mediada por radical de GalNAc para resíduos de Ser /Thr. Isto origina o anti gene Tn (GalNAc-O-Ser /Thr proteína-estrutura), o que é o mais simples de O-glicano. Em células normais destas cadeias são estendidos através da adição sequencial de outros açúcares pela primeira vez por CGALT-1 e, em seguida, outras enzimas. Isso culmina em glicanos altamente complexos, heterogêneos e alongadas, muitas vezes terminados por ABO ou grupo Lewis sangue relacionado antígenos (desenho da esquerda). Em células cancerosas o antígeno Tn é imediatamente sialiladas por ST6GalNAc.I, originando o antígeno STN (Neu5Ac-GalNAc-O-Ser /Thr backbone-proteína), inibindo assim ainda mais o alongamento da cadeia (desenho à direita). A expressão de STN na superfície da célula influencia a adesão célula-célula e do reconhecimento de células de cancro, favorecendo a motilidade, invasão e de escape imunológico. B) Representação esquemática da via PI3K /Akt /mTOR, que é activado ubiquamente em tumores da bexiga. Esta é uma via altamente conservada regulado, principalmente, por uma grande variedade de sinais extracelulares, incluindo factores mitogicos de crescimento, hormonas, nutrientes, os níveis de energia celular, e as condições de stress. Estes sinais de activar o receptor de tirosina-quinases que recrutam PI3K, que catalisa a conversão de PIP2 ligada à membrana de PIP3. Em seguida, Akt e PDK-1 são activadas através da ligação a PIP3. PTEN desfosforila PIP3 preferencialmente, inibir a progressão de sinalização. activação de Akt total requer dupla fosforilação por PDK-1 em si e PDK-2 (não mostrado). Akt fosforila directa ou mTOR pode também inactivar complexo TSC1 /TSC2, inibir a inactivação de mTOR. mTORC1 desencadeia o crescimento e proliferação celular por fosforilação reguladores de tradução eucarióticos, entre estes p70S6 cinase (p70S6K ou S6K1) que, por sua vez, fosforila a proteína ribossomal S6 (PS6), e a proteína do factor de iniciação da tradução eucariótica 4E de ligação 1 (4E-BP1 ). Para a proteína mTOR para activar a sua cascata de sinalização, que deve formar o complexo ternário mTORC1 sensível à rapamicina. PI3K Key /Akt /mTOR proteínas-pathway pAkt, pmTOR e PS6 explorado neste estudo são realçados por círculos laranja.

A fosfatidilinositol-3-quinase (PI3K) /Akt e o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR) vias estão interligados cascatas essenciais para o crescimento celular da bexiga e sobrevivência (Fig 1B) de sinalização. A via PI3K /Akt /mTOR ou mTOR integra uma multiplicidade de sinais extracelulares para regular a síntese de proteínas e de sinalização a jusante, o que em última análise conduz a uma vantagem de crescimento competitivo, a competência metastática, angiogénese, e resistência à terapia com [9]. A cascata de sinalização inicia-se com a activação de PI3K na membrana celular seguido de serina /treonina-quinase Akt translocação de membrana celular e a activação. O substrato a jusante de Akt melhor estudado é o mTOR quinase serina /treonina, cuja efector a jusante é S6-quinase-1 (S6K1). Em particular, um subconjunto de alterações da via mTOR tem sido demonstrado que ocorrem no cancro da bexiga, tais como mutações em

PIK3CA gene, que culmina com células aumentou de sinalização de mTOR e de cancro da bexiga resistência à apoptose [10]. Além disso, a inibição farmacológica ou bioquímica da via PI3K reduziu drasticamente a capacidade invasiva de células de cancro da bexiga linhas. Além disso, mais de metade dos tumores de bexiga humanos primários presente alta de fosforilação de Akt e a activação aberrante desta via tem sido sugerido para contribuir para a invasão [11]. Outro evento que influencia a activação da via mTOR em tumores de bexiga envolve a perda de supressor de tumor PTEN (fosfatase e homólogo angiotensina excluída no cromossomo dez) função [12]. PTEN normalmente suprime a activação da via PI3K /Akt /mTOR antagonizar PI3K e prevenir a activação de Akt e PDK-1. PTEN também funciona para regular a quimiotaxia e a motilidade celular, promovendo assim a invasão tumoral [13]. Em resumo, há evidências de que uma avaliação global de proteínas associadas da via PI3K /Akt /mTOR pode deter um potencial significativo para o valor para a estratificação dos pacientes. Além disso, muitos estudos pré-clínicos e clínicos apoiam que os inibidores de mTOR, tais como sirolimus (rapamicina) e seus derivados pode melhorar o tratamento do câncer [13,14].

Com base nestas observações Nossa hipótese é que Tn e /ou STN pode agir sinergicamente com a via mTOR para dirigir a progressão do cancro da bexiga. Como tal, temos dedicado para avaliar a expressão de STN e proteínas associadas com a activação da via PI3K //activação da via mTOR Akt em tumores da bexiga em diferentes fases. Prevemos que a combinação de eventos oncogênicos extracelulares e intracelulares pode melhorar a estratificação dos pacientes e fornecer insights para novas terapias. Além disso estimamos o impacto da sirolimus em tumores uroteliais induzidas quimicamente em ratos, que prevê a criação de uma base racional para a terapêutica mais eficazes cancro de bexiga.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Este trabalho envolve experiências em amostras de tumores de pacientes diagnosticados com câncer de bexiga na Insitute Português de Oncologia do Porto. Todos os procedimentos foram realizados após consentimento informado do paciente e aprovado pelo Comitê de Instituto Português de Oncologia-Porto Ética. Todas as informações clínico-patológico foi obtido a partir de registros clínicos dos pacientes.

Ele também envolve experimentos com animais. Todos os procedimentos envolvendo animais foram realizados de acordo com a Directiva Europeia 2010/63 /UE. Durante o curso deste estudo, os animais foram alimentados

ad libitum

com alimentos padronizada (Tecklad global Diet, Harlan, Espanha). O seguinte protocolo foi aprovado pelo Comité Português Ética para Experimentação Animal (Direção Geral de Veterinária, Aprovação não. 520/000/000/2003). Todos os ratinhos utilizados no ensaio foram aclimatizados durante uma semana sob condições laboratoriais de rotina antes de começar as experiências. Eles foram alojados aleatoriamente em grupos de 4-5 em gaiolas de plástico, com lascas de madeira dura para a cama. Os animais foram mantidos numa sala com uma temperatura controlada de 23 ± 2 ° C, uma 12 horas de luz /escuro e ciclo de 55 ± 5% de humidade. soluções de beber dos animais foram mudados uma vez por semana ou mais cedo, se necessário, e o volume ingerido foi gravado. ingestão de alimentos semanal também foi observado. Todos os ratos foram monitorados durante todo o experimento para sinais de sofrimento e perda de peso corporal. Os animais foram sacrificados com 0,4% de pentobarbital de sódio (1 ml /kg, intraperitoneal).

População

Este estudo foi realizado em uma série retrospectiva de 96 tumores de bexiga embebidos em parafina fixadas em formalina obtida a partir de blocos de parafina arquivados no Instituto Português de Oncologia-Porto (POI), Portugal. tumores de bexiga foram extraídos de 82 homens e 14 mulheres, com idade variando de 38 a 92 anos (mediana de 69,5 anos), admitidos e tratados no POI entre 2005 e 2007. Quarenta e sete dos tumores examinados foram histologicamente classificados como NMBIC (Ta e T1) e 49 lesões como invasoras (T2-T4). Dezesseis foram baixo grau e 80 eram tumores de alto grau, de acordo com os critérios de classificação da OMS de 2004. Além disso, carcinoma

em

situ (CIS) foi encontrado concomitantemente em 20,8% dos pacientes. O período de tempo médio de seguimento foi de 45 meses (1-134 meses). Cystectomy foi realizada em 64 pacientes (66,7%), enquanto os outros 32 (33,3%) foram submetidos à ressecção transuretral. Linfadenectomia foi realizada em aproximadamente 47% dos pacientes e das que 37% apresentaram metástase. Cinquenta e quatro (56,3%) tumores foram primárias e 42 (43,7%) eram tumores recorrentes. A partir dos tumores recorrentes, 38% não tinham tratamento prévio, 27% foram tratados com Mitomicin C, 11% com BCG e 19% foram submetidos a dois tratamentos. Além disso 5% destes pacientes foram tratados com quimioterapia neoadjuvante, antes da cistectomia. A tabela 1 resume as informações clínico-patológico.

específicas de sobrevivência Câncer (CSS) foi definida como o período entre a remoção do tumor por cirurgia e ou morte do paciente por câncer ou a última informação de acompanhamento. Todos os procedimentos foram realizados após o consentimento informado do paciente e aprovado pelo Comitê de IPO-Porto Ética. Todas as informações clínico-patológico foi obtido a partir de registros clínicos dos pacientes.

Imunohistoquímica

As expressões de antígeno STN, seu precursor Tn, e as formas fosforiladas de Akt (pAkt), mTOR (pmTOR), S6 ( PS6) e PTEN em tumores da bexiga foram acedidas por imuno-histoquímica utilizando o método da peroxidase avidina /estreptavidina, como descrito por Ferreira et al. [5]. Informação sobre os anticorpos primários e diluições utilizadas neste estudo encontram-se resumidos na Tabela 2. A imunorreactividade foi revelada utilizando diaminobenzidina (DAB, Thermo Scientific LabVision) como cromogénio e as secções foram contrastadas com hematoxilina de Harris. Os controlos negativos foram realizados substituindo o anticorpo primário com 5% de albumina de soro bovino (BSA). Os controlos positivos eram conhecidos tecidos positivos para os antígenos em estudo.

A imuno-histoquímica de pontuação de tumores humanos

As secções foram avaliadas duas vezes cegamente por microscopia de luz por dois observadores independentes (CC e SP) e validado por um patologista experiente (TA). leituras Disaccording foram re-analisados ​​utilizando um microscópio de duas pontas (Olympus BX46; Olympus Corporation), eo consenso foi alcançado. Uma abordagem semi-quantitativa foi criada para marcar o imunohistoquímica com base na extensão e intensidade da coloração.

Dada a ausência de Tn e Stn na urothelium saudável [5], os tumores foram classificados como positivos para estes antigénios quando membrana e /ou a imunorreactividade citoplasmática foram observados em mais de 5% do tumor, como descrito por Ferreira et al. [5,15]. expressões pAkt, pmTOR, PS6 e PTEN foram pontuados de acordo com a intensidade da coloração (weak-1 ponto; moderada 2 pontos; Strong-3 pontos) multiplicado pela percentagem de células positivas (0-5% -0 pontos; 5 -25% -1 ponto; 25-50% -2 pontos; 50-75% -3 pontos; 75-100% -4 pontos). Com base na classificação proposta por Nishikawa et al. [16], tumores com uma pontuação 6 foram considerados negativos, enquanto que aqueles com um score≥6 foram classificados como positivos (sobre-expressão). pAkt foi avaliada com base na imunorreatividade nuclear, pmTOR e PS6 com base na expressão citoplasmática e PTEN em ambos coloração citoplasmática e nuclear, como sugerido por outras publicações [17,18].

experimentos em animais com sirolimus e imuno-histoquímica de pontuação

os cortes histológicos de imprimir Região Control (ICR) camundongos com N-butil-N- (4-hidroxibutil) nitrosamina (BBN) lesões da bexiga induzidas, resultante do nosso trabalho anterior sobre o impacto do sirolimus sobre o cancro da bexiga [19 ], foram eleitos para este estudo. Resumidamente, quatro semanas de idade, ratinhos ICR machos (25 g; Harlan, Barcelona, ​​Spain) foram distribuídos aleatoriamente em quatro grupos, como descrito em pormenor numa publicação anterior [18]. Grupo 1 (n = 6) incluída ratinhos expostos a 0,05% BBN durante 12 semanas, seguido de água da torneira durante 8 semanas (total de 20 semanas). Grupo 2 (n = 7) incluídos ratinhos tratados com solução de BBN a 0,05% durante doze semanas, mantidas com a água normal da torneira durante mais uma semana, administrados por via intraperitoneal com o sirolimus mTOR-inibidor (1,5 mg /kg; Wyeth) durante cinco dias por semana, durante seis semanas consecutivas, isto é, até que a 19

th semanas, seguido por uma semana de água da torneira (total de 20 semanas). Grupo 3 (n = 6) incluída ratinhos expostos a 0,05% BBN durante 12 semanas, seguido de água da torneira durante 11 semanas (total de 23 semanas). Grupo 4 (n = 7) incluídos ratinhos tratados com 0,05% BBN e sirolimus, como descrito para o Grupo 2, mas com uma exposição à água da torneira depois de 3 semanas (total de 23 semanas). Grupo 3 e 4 foram criados para estimar a possibilidade de recidiva tardia e /ou alterações moleculares resultantes de sobrevivência prolongada. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com a Directiva Europeia 2010/63 /UE. Durante o curso deste estudo, os animais foram alimentados

ad libitum

com alimentos padronizada (Tecklad global Diet, Harlan, Espanha). As alterações histológicas induzidas por estas experiências incluíram tanto lesões pré-neoplásicas e neoplásicas potenciais com tumores invasivos e invasivos, tal como descrito em detalhe por Oliveira et al. [18]. Nisto, as lesões de tumores invasivos e potenciais invasivos musculares elevadas foram rastreados para STN e PS6 por imuno-histoquímica, tal como descrito em pormenor para os tumores humanos, uma vez que os anticorpos utilizados são reactivos contra ambos os ratinhos e humanos. A intensidade e a extensão da imunocoloração foram tomados em consideração para marcar a expressão dos antigénios, como descrito na secção anterior. As lesões da bexiga e imunocoloração foram avaliados duas vezes às cegas por dois observadores independentes (CC e SP) e validados por um patologista veterinário experiente (RMGC).

A análise estatística

análise estatística dos dados foi realizada com IBM Statistical Package for social Sciences-SPSS para Windows (versão 20.0). O teste do qui-quadrado foi utilizado para comparar as variáveis ​​categóricas. curvas de sobrevida de Kaplan-Meier foram utilizadas para avaliar correlação entre a expressão STN e específico do cancro sobrevivência (CSS) e foram comparadas pelo teste log-rank. Além disso, a análise de regressão de Cox multivariada foi realizado para avaliar o efeito individual dos marcadores avaliados na sobrevivência do paciente e ajustar para potenciais fatores de confusão (variáveis ​​que poderiam afetar CSS de pacientes NMIBC e CINM). A correlação entre as moléculas da via PI3K /Akt /mTOR foi utilizado o teste Spearman rho.

Resultados

glicosilação proteína alterada, traduzida pela expressão do antigénio STN e seu precursor Tn, PI3K /Akt /mTOR moléculas da via (pAkt, pmTOR, PS6), e PTEN inativação, são características marcantes de tumores de bexiga. Aqui temos dedicado a uma análise abrangente dessas alterações moleculares em uma série de pacientes com câncer de bexiga em diferentes estágios da doença, visando biomarcadores de sobrevivência específica do cancro pobres

.

O nosso conjunto de dados foi composta por 47 NMIBC e 49 pacientes CINM, como mostrado na Tabela 1. de acordo com a Figura 2, NMIBC apresentaram maior sobrevida específica por câncer (CSS; significa CSS: 119 meses) do que os pacientes CINM (CSS dizer: 43 meses; log rank, p 0,001). Estes resultados demonstraram que nossa série refletiu o curso natural da doença e destacou a CSS significativamente menor de CINM em comparação com casos NMIBC. Portanto, particular interesse foi definido na identificação de biomarcadores para a doença em estágio final com base na comparação entre NMIBC e MIBC.

A análise de Kaplan-Meier mostrando a CSS de NMIBC (Ta e T1) e s do CINM (T2 , T3 e T4). Comparação realizada pelo teste log-rank (p 0,001); + pacientes NMIBC censurados; ⧫ pacientes censurados CINM.

Tn e Stn expressões antígeno em câncer de bexiga

O antígeno Tn foi observada em aproximadamente 10% dos NMBC e MIBC (Tabela 2) e sua expressão era residual , não foi superior a 5% da área do tumor e sem qualquer padrão definido. Por outro lado, o antigénio foi detectado STN em aproximadamente 60% dos tumores da bexiga estudados, o que está de acordo com as nossas descobertas anteriores [5]. O antigénio foi predominantemente expresso na membrana celular, embora a coloração citoplasmática também pode ser observada. O antigénio STN apresentada uma expressão focal que não deve exceder 30% da área de tumor para a maioria dos casos positivos, independentemente da sua origem histológica. STN foi expresso principalmente por células indiferenciadas em tumores que mostram

lâmina própria

(T1; 60%) e

muscular própria

(≥ T2; aproximadamente 60-90%) invasão; Inversamente, a percentagem de Ta positivo foi inferior a 30% (

P

0,001; Figura 3A). Embora sem significância estatística, em células positivas Ta tumores STN estavam presentes principalmente nas camadas superficiais do tumor de distância dos vasos. Por outro lado, as células positivas STN em tumores T1 (Fig 3B) foram observadas acompanhamento e /ou invadir a camada basal (Figura 3B), enquanto que em MIBC estas células foram encontrados principalmente nas frentes de invasão (Figura 3B) e invasora e /ou no interior da vasos, o que sugere um papel na invasão e disseminação da doença. O reforço destas observações, a presença do antígeno STN foi estatisticamente maior no CINM, quando comparado com NMIBC (

p

= 0,001, Tabela 3).

(A) Distribuição de tumores STN negativos e positivos ao longo os diferentes estágios do câncer de bexiga; (B) Imagens representativas de coloração STN em NMIBC e CINM. Deixou-NMIBC mostrando um predomínio de células positivas STN nas camadas superficiais, longe do suporte fibrovascular; notar vasos sem células positivas. Direito do CINM mostrando a frente de invasão com a STN células marcadas positivamente; observar células uroteliais STN positivos nos vasos (seta), sugerindo um possível envolvimento na metástase.

PI3K /Akt /mTOR no cancro da bexiga

A avaliação da PI3K /Akt /mTOR /S6 foi feito utilizando anticorpos para as formas fosforiladas activas de Akt (pAkt), mTOR (pmTOR), e S6 (PS6). PTEN, que regula negativamente a sinalização de Akt, também foi avaliada.

pAkt foi detectada tanto no citoplasma e núcleo. Em casos NMIBC diversas áreas com diferentes intensidades de expressão foram observados (Fig 4A), denotando um padrão heterogêneo, que não era evidente no CINM (Fig 4B). Além disso, as células do estroma de casos CINM positivos mostraram intensidade de coloração reforçada principalmente nas áreas próximas ao tumor. pmTOR imunorreatividade foi citoplasmática e, em casos pontuais, nuclear. Em urothelium com expressão histologia pmTOR aparentemente normal era restrita a camadas de células superficiais. Em NMIBC expressão pmTOR foi distribuída de maneira uniforme as várias camadas de células uroteliais, embora tenha havido uma coloração mais intensa nas camadas superficiais (Fig 4C). Além disso, foram observadas diversas áreas com intensidade de coloração variável, o que denota uma expressão heterogênea. Em CINM Positivos casos, expressão pmTOR era focal e heterogêneo (Fig 4D). PS6 imunorreatividade foi predominantemente citoplasmática. Em NMIBC PS6 expressão foi observada em todas as camadas superficiais, tanto em guarda-chuva e as células diferenciadas (Figura 4E). A imunorreactividade de PS6 variou entre as células tumorais. Em CINM PS6 apresentou uma expressão difusa por todo o tumor, sendo mais presente em células basais e mitóticas (Fig 4F). Vários casos positivos apresentaram aumento PS6 intensidade de coloração na frente da invasão bem como a expressão PS6 em linfócitos infiltrantes tumorais e células endoteliais.

A e B) a expressão nuclear e citoplasmática pAKT em NMIBC (A) e MIBC (B) . Em casos NMIBC pAkt apresentou um padrão heterogêneo com áreas de diferentes intensidades de expressão. Em CINM, as células do estroma, principalmente nas áreas próximas ao tumor apresentaram maior expressão. C e D) pmTOR expressão citoplasmática em NMIBC (C) e MIBC (D). Em NMIBC pmTOR foi expressa em várias camadas, embora tenha havido uma coloração mais intensa nas mais superficiais. Em casos positivos de MIBC pmTOR expressão era focal. E e F) PS6 expressão citoplasmática no NMIBC (E) e MIBC (F). Em NMIBC foi observada expressão PS6 em todas as camadas superficiais tanto no guarda-chuva e células diferenciadas. Em CINM a imuno era difusa, porém mais presente no basal e células mitóticas. PS6 expressão foi maior na frente da invasão e em linfócitos infiltrados no tumor e células endoteliais. G e H) PTEN expressões citoplasmática e nuclear em NMIBC (G) e MIBC (H). expressão de PTEN foi maior em comparação com NMIBC CINM.

Tendo em conta a extensão da mancha e sua intensidade, 62/94 (66%), 33/96 (34%) e 45/95 ( 47%) dos tumores da bexiga foram considerados positivos para pAkt, pmTOR e PS6, respectivamente. Um teste de Rho de Spearman mostrou que as expressões de pAkt, pmTOR, PS6 foram correlacionados significativamente (P 0,05), independentemente da fase do tumor, assim, em conformidade com uma via totalmente activa. Além disso, apesar das diferenças histológicas, estes marcadores apresentado uma distribuição igual entre o NMIBC e MIBC e não poderia ser associado com a invasão do músculo (Tabela 3).

Por outro lado, 37/92 (40%) do Os tumores foram considerados positivos para PTEN. PTEN foi expressa no citoplasma e núcleo das mesmas células, no entanto com menor extensão de expressão em MIBC (33%, Figura 4G) em comparação com NMIBC (83%; Fig 4H). Além disso, o fenótipo PTEN-negativo foi significativamente associado com a invasão do músculo (Ta e T1; p 0,001, Tabela 3)., O que pode contribuir para manter uma PI3K activa /Akt /mTOR /S6 via nestes casos

Tn, STN, PI3K /Akt /mTOR e câncer específica Survival

a análise de Kaplan-Meier foi utilizado para avaliar associações entre os biomarcadores abordados e a sobrevivência específica do cancro dos pacientes. Observou-se que pacientes com tumores que expressam STN tinha uma CSS inferior, independentemente de seu estágio (p = 0,024; Fig 5A). Isto também foi observado quando se avalia NMIBC sozinho (p = 0,020; Figura 5B). Mais importante ainda, entre NMIBC, stn que expressam tumores T1 apresentaram CSS menor do que os tumores negativos (p 0,05). Além disso, a análise de regressão de Cox multivariada ajustada para potenciais fatores de confusão, ou seja, idade, sexo, estágio, categoria, status de recorrência, presença de concomitante CIS foi realizada. Descobrimos que STN é um marcador de prognóstico independente de pior CSS (HR = 11,836; 95% CI: [1,063-131,7]; p = 0,044). Contrastando com a STN, tumores TN, PAKT, pmTOR e PS6 positivos não mostraram diferenças em CSS em comparação com lesões negativos, independentemente da sua fase. Também observamos que os pacientes com tumores PTEN-negativos tiveram menor CSS (p = 0,015, Fig 6). Mais estudos são necessários para determinar se a falta de efeito supressor de PTEN mais de PI3K /Akt /mTOR pode ser responsável por estes resultados

A análise de Kaplan-Meier mostrando a associação entre STN e CSS em:. (A) todos estudada pacientes com câncer de bexiga; pacientes (B) NMIBC. Comparação realizada pelo teste de log-rank (A: p = 0,024; B: p = 0,020); + tumores negativos STN censurados; ⧫ censurado STN tumores positivos.

A análise de Kaplan-Meier mostrando o efeito na CSS de expressão de PTEN em todos os doentes com cancro da bexiga estudados. Comparação realizada pelo teste log-rank (p = 0,013); + negativos tumores PTEN censurados; ⧫ censurado PTEN tumores positivos.

Com base nestas observações e com o objetivo de melhorar o valor prognóstico da STN no contexto da doença fase tardia (CINM), temos completamente integradas as informações da STN e PI3K /biomarcadores Akt /mTOR. De acordo com a Figura 7, a introdução de moléculas de PI3K /Akt /mTOR permitido discriminar tumores positivos CINM STN com pior CSS (p = 0,027). Além disso, a análise multivariada de Cox (ajustado para a idade, fase, estado recorrência, presença de CIS concomitante e metástase) revelou que a presença de moléculas de PI3K /Akt /mTOR em STN + MIBC é independentemente associados com risco aproximadamente seis vezes superior de morte por câncer (HR = 5,662; IC 95%: [1,093-29,323]; p = 0,039). Estas observações sugerem, pela primeira vez, que a combinação de STN e mTOR biomarcadores via pode manter o potencial para melhorar a estratificação de tumores avançados fase da bexiga; no entanto corroboração em séries maiores é obrigatório

A análise de Kaplan-Meier mostrando a associação entre pAKT, pmTOR e expressões PS6 na CSS de tumores STN positivos CINM:. Comparação realizada pelo teste log-rank (p = 0,027); + tumores negativos PAKT e pmTOR e PS6 censurados; ⧫ censurado pAKT e /ou pmTOR e /ou PS6 tumores positivos.

A inibição da via PI3K /Akt /mTOR em modelos animais

-BBN ratos induzidos tumores da bexiga imitando a histologia e da natureza molecular dos cancros humanos [20,21], foram selecionados para STN e PS6, a efetora jusante do mTOR. Observamos nenhuma expressão STN na urothelium ratos saudáveis, de acordo com a observação prévia para a bexiga humano saudável [5].