Abstract

O glioblastoma multiforme (GBM) é o glioma maligno adulto mais comum com prognóstico reservado devido à resistência à radioterapia e quimioterapia, que podem estar envolvidos criticamente na repovoamento de células-tronco cancerosas (CSCs) após o tratamento. Nós tinha investigado as características das células cancerosas estaminais-como side population (SP) escolhidas a partir de células GBM, e estudou o efeito de Honokiol segmentação em CSCs. células GBM8401 SP possuía os marcadores de células-tronco, tais como nestina, CD133 e Oct4, e as expressões de genes relacionados stemness auto-renovação, tais como

SMO

,

Notch3

e

IHH

(Hedgehog indiana). Honokiol inibiu a proliferação de ambas as células parentais GBM8401 e células SP de um modo dependente da dose, o IC

50 foram de 5,3 ± 0,72 e 11 ± 1,1 ^ M, respectivamente. As proporções de SP em células GBM8401 foram diminuídos por Honokiol de 1,5 ± 0,22% para 0,3 ± 0,02 e 0,2% ± 0,01% com doses de 2,5 uM e 5 uM, respectivamente. As células SP pareceram ter maior expressão de

O

metiltransferase de ADN-6-metilguanina (MGMT) e ser mais resistente à temozolomida (TMZ). A resistência ao TMZ pode ser apenas ligeiramente revertida por inibidor MGMT

O

6-benzilguanina (

O

6-BG), mas significativamente reforçada por Honokiol disso. Tal melhoria significativa foi acompanhado com a maior indução de apoptose, uma maior infra-regulação da

Notch3

bem como suas jusante

HES1

expressões em células SP. Nossos dados indicam que Honokiol pode ter benefícios clínicos para pacientes com GBM que são refratários ao tratamento TMZ

Citation:. Lai IC, Shih PH, Yao CJ, Yeh CT, Wang-Peng J, Lui TN, et al . (2015) Eliminação de Células Estaminais-como câncer e potenciação da temozolomida Sensibilidade por Honokiol em células de glioblastoma multiforme. PLoS ONE 10 (3): e0114830. doi: 10.1371 /journal.pone.0114830

Editor do Academic: Waldemar Debinski, Wake Forest University, School of Medicine, Estados Unidos

Recebido: 01 de abril de 2013; Aceito: 14 de novembro de 2014; Publicação: 12 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Lai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento: Este estudo foi apoiado pelas bolsas do Ministério da Saúde e Bem-Estar, Taiwan (MOHW103-TD-B-111-01), Institutos nacionais de Pesquisa em Saúde, Taiwan (03A1 CAPP33-014) e Ministério da Ciência e Tecnologia, Taiwan (NSC 100-2632-B -038-001-MY3). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

tumor cerebral maligno é um dos cânceres mais letais em adultos. Com base na classificação da OMS, os tumores de grau I são biologicamente “benigna”, enquanto os tumores de grau II são neoplasias de baixo grau com cursos clínicos mais longos [1]. Grau III e IV são gliomas malignos que são letais dentro de poucos anos e 9-12 meses, respectivamente [2]. Alto grau (glioblastoma multiforme, GBM) glioma, o tumor cerebral mais frequente e maligno em adultos são tipicamente resistentes à radioterapia e quimioterapia. A sobrevivência de GBM após a cirurgia e a radioterapia foi limitada em um ano. A quimioterapia, tais como Temozolomida (TMZ), poderia prolongar ainda mais a sobrevivência até cerca de 20 meses [3], mas a maioria dos pacientes morreram no prazo de dois anos. Assim, em busca de agentes terapêuticos inovadores e desenvolver novas estratégias para pacientes com GBM refratários são imperativas e urgentes.

TMZ é um agente quimioterapêutico alquilante que é actualmente utilizado para o tratamento de GBM. O benefício terapêutico de TMZ depende da sua capacidade de ácido nuclear alquilato /metilato, o que ocorre mais frequentemente no N-7 ou O-6 posições de resíduos de guanina [4]. Esta metilação prejudica a replicação do DNA por pareado incorretamente

O

-6-alkylguanine com timina e provoca a morte de células tumorais. Demonstrou-se que as células cancerosas se uma actividade mais elevada expresso de

O

metiltransferase 6-metilguanina-ADN (MGMT), uma enzima de reparação de ADN para remover o aducto TMZ-ADN, podem diminuir a eficácia terapêutica de TMZ e parecem ser mais resistentes e refractários à terapia TMZ. Combinado com inibidor MGMT, O

6-benzilguanina (

O

6

-bg), pode aumentar a citotoxicidade de TMZ [3]. No entanto, o ensaio clínico de fase II do

O

6-BG com TMZ não mostraram o benefício de resposta para GBM, exceto os pacientes com astrocitoma anaplásico (AA) [5]. As razões para esta discrepância pode ser devida a diferentes comportamentos malignos, incluindo a presença de proporção mais elevada de cancro de células estaminais (CSC) no GBM [6]. Esta evidência clínica deu origem a nossa motivação para procurar qualquer terapêutica que é capaz de segmentar na CSC de GBM resistente ao TMZ.

A pesquisa para CSC ou célula de iniciação tumoral (TIC) tornou-se um campo interessante desde 2000. Não importa qual o tipo de método a ser utilizado para identificar o CSC, várias linhas celulares de tumores sólidos contendo CSC tinha sido relatada em meduloblastoma, neuroblastoma, glioma, cancro da mama, cancro do cólon e cancro gástrico, etc [7] também foi demonstrado que os pacientes com recidiva e refratária ao TMZ correlacionados com a maior proporção de CSC permaneceu na massa tumoral [6]. Portanto, em busca de novas terapias dirigidas sobre a CSC torna-se uma nova estratégia para alcançar uma melhor evolução clínica de pacientes com GBM refratários.

CSCs possuem características de capacidade de auto-renovação, tumorigênese e diferenciação de linhagem em células tumorais não estaminais bem como a expressão de proteínas de resistência a fármacos múltiplos. Além de usar marcadores CD para identificar CSCs, um método comum para isolar o CSCs é a técnica população lateral (SP), que se tornou cada vez mais popular desde 2004. Esta técnica de triagem para isolar células SP por citometria de fluxo dual-comprimento de onda é baseado sobre a capacidade destas células para efluxo o corante de ligação a ADN fluorescente Hoechst 33342 [8]. O fenótipo das células SP é caracterizada pela expressão elevada de cancro da mama resistentes à proteína-1 (BCRP1 ou ABCG2), um de ATP-ligação cassete transportadores (ABC), que está associado com resistência a múltiplas drogas em muitos cancros por bombeamento para fora dos fármacos [ ,,,0],9]. Uma vez que a resistência a múltiplas drogas é uma característica importante das CSCs, também tem sido demonstrado que as células SP ordenadas são enriquecidas de CSCs [10]. Assim, a triagem células SP é postulada para ser uma rica fonte de CSCs e representa uma plataforma de tecnologia para o rastreio terapêuticas que é capaz de segmentar em CSCs.

medicamentos tradicionais chineses têm sido amplamente utilizados no controle da doença há milhares de anos .

Magnolia Officinalis

, também chamado Houpo em chinês ou Saiboku-tu em japonês, é uma antiga género distribuídos principalmente no Sul e Leste da Ásia, bem como Oriente e América do Norte. Vários compostos ativos derivados de suas cascas tinham sido identificados, como Magnolol, Honokiol, 4-

O

-methylhonokiol, Obovatol e outros compostos derivados de neolignanas, que possuía muitos diversas funções biológicas, incluindo a melhoria de reações alérgicas e asmáticas [11 ]. Honokiol, um dos componentes bioactivos biphenolic, possui actividades multifuncionais, tais como antioxidantes, anti-inflamatória, e quimiopreventivo efeitos neuroprotectores [12, 13, 14, 15]. Como a literatura relatou, Honokiol PI3K especificamente inibida /mTOR sinalização de ativação em gliomas [16]. Além disso, as nossas descobertas recentes sugeriram que Honokiol pode viajar através do sangue-cérebro-barreira (BBB), indicando o potencial para o tratamento de gliomas malignos [17]. No entanto, há pouca informação sobre seu efeito anti-câncer contra células GBM, especialmente o efeito de CSCs.

Neste trabalho, investigamos os efeitos da Honokiol sobre a eliminação de CSCs ea reversão da resistência TMZ em células GBM8401 SP, e estudou o que os mecanismos subjacentes são responsáveis.

material e Métodos

Cells and Materials

Honokiol (5,3′-Diallyl-2,4′- hidroxibifenilo), sulforhodamina B (SRB), Hoechst 33342, Verapamil, reserpina,

O

6

benzilguanina (

O

6

–

BG) e temozolomida (TMZ) foram adquiridos da Sigma Aldrich (Xangai, China). reagente Trizol extracção de RNA foi obtido a partir de MDBio Co. (Frederick, MD, EUA). glioblastoma multiforme humano (GBM8401, BCRC No. 60163) e glioblastoma humano /astrocitoma anaplásico (U-87 MG, BCRC No. 60360) linhas celulares foram adquiridos da coleção e Research Center Bioresource (BCRC) de Taiwan Indústria de Alimentos Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento . Outros reagentes de alto grau foram adquiridos de empresas comerciais.

Cultura celular

Human glioblastoma multiforme células GBM8401 foram mantidas com Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) e glioblastoma /U87 astrocitoma anaplásico humana células MG foram mantidas na de Eagle Meio Essencial mínimo (MEM). As células foram mantidas em meio completo contendo 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1 x aminoidos n essenciais e 100 unidades /ml de penicilina /estreptomicina /

L-glutamina (Gibco, Invitrogen Corporation, Grand Island, NY, EUA ) a 37 ° C numa atmosfera humidificada.

SRB ensaio de viabilidade celular

efeito de citotoxicidade Honokiol foi determinada utilizando um ensaio de rastreio de drogas anticancro-colorimétrico SRB modificadas [18]. Resumidamente, as quantidades apropriadas de células foram semeadas em placas de 96 poços de fundo plano, em 200 ul de meio. Depois de 24 h de incubação, as células foram tratadas com diferentes concentrações de Honokiol (dissolvido em DMSO, a concentração final foi ajustado para menos de 0,05%), seguido por incubação durante mais 3 dias a 37 ° C, 5% de CO

2. O meio foi então aspirado e as células foram fixadas sobre a subestrutura de plástico por meio da adição de 100 ul de ácido tricloroacético a 10% (TCA) e incubação durante 2 h a 4 ° C. As placas foram lavadas cinco vezes com água para remover o TCA e durante pelo menos 1 hora secou-se ao ar. Isto foi seguido por coloração com 200 ul de 0,065% de SRB (sulfo-rodamina B) durante 30 min à temperatura ambiente, lavando cinco vezes com ácido acético a 1% para remover corante não ligado, e, subsequentemente, a secagem ao ar. O corante ligado foi dissolvido com 200 ul de base Tris 10 mM (pH 10,5). A absorvância foi lida utilizando um espectrofotómetro a 570 nm.

isolamento da população lateral (SP) e não-SP (NSP) Células

Identificação da população lateral foi realizado com pequenas modificações como descrito previamente [19]. As células MG GBM8401 ou L-87 (10

6 /ml) foi incubada em meio contendo Hoechst 33342 (5 mg /ml) com ou sem controlo positivo (ABC inibidor transportador, verapamil ou reserpina) durante 3 h a 37 ° C . Após a incubação, as células foram analisadas utilizando um sistema de triagem de células fluorescentes-activado com um software DIVA (FACSAria III, Becton Dickinson). As células vivas foram fechado usando iodeto de propidio e analisadas utilizando uma combinação de um 450 nm (azul Hoechst) e uma 675 nm (vermelho Hoechst) realizar uma filtragem após excitação com um laser de 350 nm NUV. As células SP foram definitivamente identificados mediante o tratamento de inibidores específicos contra transportadores de cassete de ligação de ATP. A população de células grandes, com o nome não-SP células (NSP), foi significativamente corados com Hoechst 33342. Ambas as células SP e não-SP foram classificados e colhidas respectivamente para um estudo mais aprofundado. células SP foram mantidas com meio HEscGro (Millipore, Billerica, MA, EUA) Factor contendo de crescimento epidérmico (EGF, 10 ng /ml) mais o factor de crescimento de fibroblasto básico (bFGF, 8 ng /ml) mas sem soro, e não-SP As células foram incubadas com meio DMEM completo.

Análise de citometria de fluxo e de diferenciação da superfície celular Marcadores

suspensões de células individuais foram seleccionados usando um FACScalibur 4-laser (BD Science) e coradas com uma variedade de anticorpos contra marcadores de CD que são altamente expressos em células estaminais de cancro: anti-humano CD24-FITC, anti-humano CD26-FITC, anti-humano CD29-FITC, anti-humano CD90-FITC, anti-humano CD133-PE, anti -sangue humano de CD44-PE. células parentais, SP e não-SP foram incubadas com anticorpos específicos mencionados acima durante 1 h, e, em seguida, analisadas com citometria de fluxo após a lavagem. No caso de se estudar a capacidade de diferenciação das células SP, SP diferenciada (d-SP), as células foram obtidas após a cultura em meio completo durante uma semana. A d-SP, SP e as células parentais foram então incubadas com anticorpos conjugado com corante fluorescentes, tais como anti-GFAP e anti-PE-MAP2B-Alexa Fluor488, respectivamente, durante 1 h. As intensidades de fluorescência celular foram depois analisadas com citometria de fluxo após a lavagem. Todos os anticorpos fluorescentes foram adquiridos da BD Biosciences, San Jose, CA, EUA, com exceção do anti-humano CD24-FITC (eBioscience, San Diego, CA, EUA).

análise de transcrição reversa PCR

as células foram tratadas com Honokiol ou temozolomida durante 48 h, o ARN celular total foram isolados usando MasterPure RNA Purification Kit (Epicentre Biotechnologies, Madison, WI, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante, e depois quantificado por absorvância a 260 nm. pureza RNA foi determinada usando a relação A260 /A280 (média ≥ 1,8). O ARN total a partir de cada amostra foi primeiro transcritos de modo inverso em ADNc utilizando um kit de MMLV da Transcriptase Reversa 1-Strand cDNA Synthesis (Epicentre Biotechnologies), e, em seguida, os genes alvo foram amplificadas usando Taq DNA Master Mix da Polimerase (Ampliqon, Lars Quist, Dinamarca). As amostras foram submetidas a 30 ciclos de amplificação (a síntese de cDNA a 37 ° C durante 1 h, seguida por pré-desnaturação a 94-C durante 2 min, e a amplificação por PCR foi realizada com desnaturação a 94 ° C durante 30 seg, emparelhamento a 58- 60 ° C durante 30 seg, extensão a 72 ° C durante 1 min, e a extensão final a 72 ° C durante 10 min). Os produtos de PCR foram misturados com EZ-Vision ADN corante (Amresco, Solon, OH, EUA) e, em seguida, a electroforese em gel de agarose a 1,8%, finalmente visualizados por Sistema de UV-Visível. Os dados foram então quantificadas com programa Image J.

Western Blotting

Após o tratamento, os lisados ​​celulares foram preparados utilizando ReadyPrep kit de extracção de proteína (Bio-Rad) de acordo com as instruções fornecidas. Os lisados ​​celulares totais (20 ug) foram separadas por electroforese por gel de poliacrilamida SDS-PAGE 10% e transferidas para uma membrana de fluoreto de polivinilideno usando o sistema de transferência Bio-Rad Mini Protean-. A membrana foi colhido e ainda incubadas durante a noite a 4 ° C, com anticorpos específicos contra CD133 (St John Laboratory Ltd, Londres, Reino Unido), MGMT (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA) e tubulina (Abcam, Cambridge, MA, EUA ), respectivamente. Após incubação com anticorpos primários, as membranas colhidas foram lavadas com TBST 3 vezes e depois incubadas com o anticorpo secundário marcado com peroxidase de rábano silvestre durante 90 minutos à temperatura ambiente. Após a lavagem com TBST 3 vezes, detecção de final foi realizada com quimioluminescência aumentada (ECL) reagentes de transferência Western (Minipore) e BioSpectrum Imaging System (UVP, Upland, CA, EUA).

Avaliação do Ciclo Celular

As células foram tratadas com Honokiol ou temozolomida durante 48 h. No final da incubação, as células foram recolhidas e fixadas com etanol a 70% durante a noite e, em seguida, incubados com uma de 25 ug /PI ml, 0,5% de Triton X-100, e 0,2 ug /ml de RNase A solução durante 30 min, após lavagem com PBS frio . Finalmente, as células foram ressuspensas em 500 ul de PBS e, em seguida, analisadas por citometria de fluxo (Cytomics FC500, Beckman Coulter). Os dados foram coletados a partir de 10.000 células e avaliadas por softwares CXP.

Análise Estatística

Todos os experimentos foram realizados pelo menos três vezes e os dados são apresentados como a média ± SD. Diferenças estatisticamente significativas foram com base na comparação com os grupos não tratados, e foram calculados através de uma análise de um ou dois de variância (ANOVA) e

t

-test software estatístico de Student. Os valores de p 0,05 foram considerados significativos

Resultados

Isolamento de células laterais População (SP) a partir GBM8401 e U-87 Linhas MG celular

A proporção de Verapamil-. células SP sensíveis de GBM8401 ou U-87 MG foi analisada por citometria de fluxo com base na exclusão da ligação Hoechst 33342 corante de ADN. Como mostrado na Fig. 1, existem de 1,3 ± 0,2% e 1,7 ± 0,3% de células SP detectados em células U-87 MG e GBM8401, respectivamente. Essas células SP foram então cultivadas num sistema de suspensão com meio de cultura de células estaminais. As esferas apareceu na suspensão foram distintamente observado no dia 7-10, que pode ser colhida para testes moleculares subsequentes.

(A) A percentagem SP foi analisada em GBM8401 e U-87 MG de células através de coloração Hoechst e citometria de fluxo. As células foram incubadas com a ausência ou presença do inibidor específico verapamil (100 uM) durante 3 h. SP ensaio foi realizado seguido por coloração das células com Hoechst33342 (5 ug /ml) durante 90 min. A morfologia de GBM8401 (B) e U-87 MG (C) células parentais e SP foram monitorizados e fotografado após a realização de SP A citometria de fluxo. As células SP foram incubadas em meio condicionado sem soro durante 1 semana e observou-se a morfologia do esferóide. As células SP foram diferenciadas em células não-SP (NSP) para a cultura a longo prazo em meio contendo soro completa.

Capacidade de Diferenciação de Células SP

No caso de se estudar a diferenciação capacidade das células de SP, o (d-SP), as células diferenciadas SP foram obtidas após a cultura em meio completo durante uma semana. Como mostrado na Fig. 2 (A), células SP GBM8401 possuíam expressão muito menor de MAP2B marcador neuronal (2 ± 0,4%), indicando o seu estado não diferenciado. Quando as células foram diferenciadas GBM8401 SP às células d-SP, a expressão do marcador neuronal MAP2B tornou-se tão elevada como a das células parentais (50 ± 1,9% no parental e 55 ± 2.7%, em células d-SP). Do mesmo modo, a expressão de GFAP-marcador específico dos astrócitos (proteína glial fibrilar ácida) em U-87 MG de células SP (1,7 ± 0,2%) foi muito menor do que nas células parentais (30 ± 1,8%). Quando estas U-87 células SP MG foram diferenciados para as células d-SP, a expressão de GFAP foi marcadamente aumentada para 8 ± 1,1% (Fig. 2 (B)).

Parental, SP e SP diferenciada ( d-SP), as células foram colhidas para análise da expressão de proteína marcador específico tal como a proteína associada a microtúbulos 2B (MAP2B) em GBM8401 (a) e proteína glial fibrilar ácida (GFAP) em células U-87 MG (B). Os sinais foram ajustados pela subtração do fundo do respectivo controle isotipo.

caracterização de células GBM8401 SP com Cancer Stem marcadores da superfície celular

CD24, CD26, CD29, CD44, CD90 e CD133 tem sido amplamente utilizada para identificar CSCs de tumores sólidos [20]. A expressão destes marcadores CD nas células SP-SP e não ordenadas a partir de células frescas foram GBM8401 mostrado na Fig. 3. As expressões de CD24, CD26, CD44 e CD133 nas células SP foram significativamente (p 0,05) mais elevada do que aqueles em que as células não-SP, o grau de dobras foram de 1,8 ± 0,2, 2,5 ± 0,3, 1,7 ± 0,1 e 1,8 ± 0,2, respectivamente. Não houve diferenças significativas na expressão dos outros dois marcadores, CD29 e CD90 (dados não mostrados).

GBM8401 SP e não-SP células foram classificados e depois incubadas com anticorpos anti-marcador ou específicas de CD com controlo de isotipo para 1 h, respectivamente. Após lavagem com PBS e centrifugação, as células foram re-suspensa com PBS e analisadas por citometria de fluxo. Os histogramas de citometria de fluxo de análise de CD133 (A), CD24 (B), CD26 (C), e CD44 (D) foram mostrados. As expressões dos marcadores stemness acima em células SP foram significativamente mais elevados do que aqueles em células não-SP. No entanto, as manifestações de outros marcadores, tais como CD29, CD90, e SSEA-4, não foram aparentemente diferentes (dados não mostrados).

A expressão do gene da stemness é diferente em SP e não- SP (NSP) células

Para investigar mais a expressão diferencial de genes stemness em células SP e não-SP, examinamos a expressão de mRNA de

Oct-4

,

CD133

,

Nestin

,

β-tubulina-III

,

Notch3

,

IHH

e

SMO

em GBM8401 parental, SP e células não-SP. Excepto o

β-tubulina III

, as expressões de ARNm acima mencionados foram todos significativamente (p 0,05). Mais elevada nas células SP, em comparação com o dos pais e as células não-SP (Figura 4 (A ) e 4 (B)). Além disso, o nível de mRNA da proteína multirresistente, como

MDR1

e

ABCG2

, eo

expressão MGMT

nas células SP também foram mais altas do que as do células parentais e não-SP (Fig. 4 (a) e 4 (b)). Consistente com os dados de mRNA, os níveis de proteína de GBM CSC marcador CD133 e TMZ MGMT proteína associada a resistência eram obviamente muito mais elevado nas células SP em comparação com as células progenitoras e não-SP (Fig. 4 (C)).

análise (a) RT-PCR para as expressões dos marcadores stemness (

CD113

,

Oct-4

), marcadores de diferenciação neuronal (

nestin

,

β-tubulina III

), enzima de reparo do DNA (

MGMT

), via de sinalização stemness (

Notch3

,

IHH

,

SMO

) e genes de resistência a drogas (

ABCG2

,

MDR1

,

MGMT

). Excepto o marcador neuronal diferenciação

β-tubulina III

, todas as expressões de genes em células SP stemness foram significativamente mais elevados do que aqueles em células parental e não-SP (NSP). O

β-actina

e

GAPDH

foram utilizados como controle de carga. (B) de dados Análise quantitativa e estatística de (A) e dois experimentos semelhantes independentes. *, P 0,05, em comparação com as células parentais. (C) análise de transferência de Western para os níveis de proteína de GBM CSC marcador CD133 e TMZ MGMT proteína associada a resistência. Ambos os níveis de proteína CD133 e MGMT eram obviamente muito mais elevado nas células SP em comparação com as células progenitoras e não-SP. O Tubulin foi utilizado como controle de carga.

Honokiol Elimina SP e inibe a proliferação de células GBM8401

As células parentais e SP GBM8401 foram tratados com diferentes doses de Honokiol. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de SRB e a proporção de células SP foi analisada por citometria de fluxo. O resultado mostrou que Honokiol inibiu a proliferação de células progenitoras e SP GBM8401 de um modo dependente da dose (Fig. 5A). As células GBM8401 SP foram mais resistentes à Honokiol em comparação com as células parentais, o IC

50 foram 11,2 ± 1,1 e 5,3 ± 0,7 ^ M, respectivamente. A sensibilidade das células não-SP (PEN) para Honokiol foi semelhante à das células parentais (S1 Fig.). Por outro lado, a proporção da população SP em células parentais foi diminuída por Honokiol de 1,5 ± 0,23% para 0,3 ± 0,02% e 0,2 ± 0,02% em doses de 2,5 uM e 5 uM, respectivamente, como mostrado na Fig. 5B.

(A) GBM8401 células parentais ou SP foram incubadas com concentrações série de Honokiol durante 48 horas e a viabilidade celular foi analisada por ensaio de SRB. (B) As células foram incubadas GBM8401 com a ausência ou presença do inibidor específico Verapamil (50 uM) e Honokiol (2,5 e 5 uM) durante 48 h, respectivamente. Depois de lavadas com PBS e centrifugação, o ensaio de SP foi realizada seguido por coloração das células com Hoechst33342 (5 ug /ml) durante 90 min.

Honokiol aumenta ainda mais a citotoxicidade e apoptose induzida pela combinação de temozolomida e MGMT Inhibitor

O

6

-bg em GBM8401 SP células

Como Fig. mostra 6A, as células GBM8401 SP foram extremamente resistente superior para TMZ do que as células parentais, o IC

50 foi de 490 ± 5,3 mM e 15 ± 0,4 mm, respectivamente. resultado semelhante foi também observada nas células parentais e SP MG U-87. Como as células GBM8401 eram relativamente resistentes a TMZ do que U-87 células MG, que, em seguida, escolheu as células GBM8401 para investigar os efeitos da Honokiol nesta resistência das células SP para TMZ. Na dose de 50 uM, diminuiu apenas ligeiramente TMZ cerca de 20% da viabilidade das células SP. Co-tratamento com

O

6

–

BG (10 mM) ou Honokiol (5 M), a viabilidade celular de 50 � TMZ-tratada grupo foi ligeiramente diminuída de cerca de 80% a 60% e 40%, respectivamente (Fig. 6B). O efeito co-tratamento de 50 mM TMZ mais 10? M

O

6

-bg não poderia ser melhorada através do aumento da dose de

O

6

-bg a 20 uM (Fig. 6B). No entanto, pode ser significativamente melhorada por Honokiol de uma forma dependente da dose. A viabilidade celular foi ainda significativamente reduzido a 23% (p 0,05) e 10% (p 0,01) por Honokiol em dosagens de 2,5 uM e 5 | iM, respectivamente, em comparação com 50 pM TMZ mais 10 uM

O

grupo 6

-bg-tratados (Fig. 6C). Em consonância com isso, foram observados apenas o mínimo de efeitos apoptóticos induzidos por um único agente só foram observados e nenhum aumento substancial das percentagens sub-G1 se TMZ combinado com qualquer um

O

6

–

BG ou Honokiol. No entanto, notáveis ​​aumentos de apoptose (cerca de 30% de células sub-G1, p 0,05), enquanto as células foram tratadas com TMZ (10 mM),

O

6

–

BG (10 uM) e Honokiol (5 ^ M) em conjunto (Fig. 7). As proporções sub-G1 de células GBM8401 SP tratados com Honokiol e TMZ com ou sem

O

6

–

BG foram apresentados na Tabela 1.

(A), U-87 MG e GBM8401 células progenitoras e células SP foram tratados com várias concentrações de TMZ. Tanto as células GBM8401 e U87 MG SP foram mais resistentes à TMZ do que suas células parentais. (B) Os efeitos do

O

6

-bg (M) ou Honokiol (M) em TMZ (M) -suppressed viabilidade celular GBM8401 SP. *, P 0,05 quando comparado com o branco; #, P 0,05 quando comparado com o grupo tratado com TMZ 50 uM. Não houve diferença significativa entre cada dois grupos libra sinal. (C) Os efeitos da combinação de Honokiol e TMZ mais

O

6

-bg sobre a viabilidade celular das células GBM8401. *, P 0,05; **, P 0,01 quando comparado com o outro grupo indicado no gráfico de barras. A viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de SRB com amostras em triplicado. H, Honokiol; T, TMZ; B,

O

6

-bg.

células GBM8401 SP foram tratados com 0,05% de DMSO (A), 5 mM Honokiol (B) , 10 uM TMZ (C), 5 uM Honokiol combinada com 10 uM TMZ (D), 10? M, mais 10 uM TMZ

O

6

-bg (e) e 5? M Honokiol combinados com 10 mM TMZ mais 10? M

O

6

-bg (F) durante 72 h, respectivamente. Após a colheita, as células foram fixadas e coradas com PI, durante 30 min e o ciclo celular foi analisada por citometria de fluxo. Honokiol reforçada

O

6

-bg combinado com citotoxicidade TMZ mediada através da promoção da morte celular por apoptose. H, Honokiol; T, TMZ; B,

O

6

-bg.

Honokiol em combinação com

O

6

–

BG Além disso Inibe induzida por temozolomida Notch3 /Hes1 Cascade em células GBM8401 SP

Como mostrado na Fig. 8 (A) e 8 (B), os níveis de mRNA de

MGMT

, bem como

Notch3

e sua jusante

Hes1

foram significativamente (p 0,05) aumentou TMZ tratamento (100 uM) em comparação com o grupo de controlo. Honokiol (5 M) aboliu eficazmente as expressões induzidas TMZ de

Hes1

e

MGMT

. Na presença de

O

6

–

BG (20 mM), o nível de proteína de MGMT foi marcadamente diminuída (Fig. 8 (C)) . Quando combinado com o

O

6

–

BG (20 mM), Honokiol mais (p 0,05) diminuiu a expressão induzida pelo TMZ da

Notch3

e

Hes1

mRNAs, indicando o potencial papel da Honokiol em combinação com

o

6

–

BG para reverter a resistência TMZ em células GBM SP.

(a) análise de RT-PCR para a expressão de

Notch3

,

Hes1

e

MGMT

mRNAs em células SP. células GBM8401 SP foram tratados com 2,5 e 5 uM Honokiol (pista 2 e 3, respectivamente), 100 uM TMZ (pista 4), 100 uM TMZ mais 5 uM Honokiol (pista 5), ​​100 uM TMZ mais 20 uM

ó

6

-bg (pista 6), e 2,5 e 5? M Honokiol combinado com 100 M TMZ mais 20? M

O

6

-bg (pista 7 e 8, respectivamente) durante 48 h.

18S

foi utilizado como controle de carga. Honokiol em combinação com

O

6

–

BG elevação induzida por temozolomida Além disso suprimida da

Notch3

e

Hes1

mRNAs. (B) de dados Análise quantitativa e estatística de (A) e dois experimentos semelhantes independentes. (C) análise de transferência de Western para o nível de proteína de MGMT em células SP GBM8401 tratados com agentes, tal como descrito em (A). A tubulina foi utilizada como controlo de carga. CTL, DMSO controle simulada; H, Honokiol; T, TMZ; B,

O

6

-bg. *, P 0,05 comparado com o grupo de controlo simulado DMSO. #, P 0,05 em comparação com 100 M grupo tratado com TMZ

Discussão

O “side population” (SP) técnica é um método bem estabelecido para isolar de haste do cancro. como as células. Recentemente, Fukaya e seus colegas publicaram um artigo utilizando a técnica de SP para isolar células-tronco do câncer, como de várias linhas de células de glioblastoma humano [21]. O estudo mostrou que as células SP teve maior capacidade de efluxo de drogas, mais stemness genes expressão e maior tumorigenesity, em comparação com células não-SP. Da mesma forma, neste estudo, a SP isoladas a partir de células GBM8401 parecia ter propriedades CSC. Além de

Nestin

,

Notch-1 | e

ABCG2

, tivemos também mostrou outros genes stemness, tais como

CD133

,

Oct4

,

MGMT

e

MDR1

, foram mais expressos nas células SP, em comparação com células não-SP. Além disso, as células SP poderia diferenciar-se em diferentes fenótipos de células com marcadores de diferenciação, tais como GFAP e MAP2B. Os níveis mais elevados, obviamente, muito CD133 e MGMT proteína de células SP caracterizada ainda mais as suas propriedades de células estaminais do tipo, e, por conseguinte, o GBM8401 SP representada uma população enriquecida CSC.

Glioma CSCs poderia ser isolados e identificados por meio de marcadores de superfície celular, tais como nestina e CD133, que também foram altamente expresso nas células SP. CD133 é os marcadores de superfície celular mais comuns para a identificação de células-tronco tumor cerebral e isolamento; No entanto, as percentagens de células positivas CD133 isoladas de tecidos tumorais do cérebro humanos não foram consistentes, variou de 3% a 45% [22]. Portanto, não é convincible para caracterizar cancro de células estaminais utilizando apenas um marcador da superfície celular específico [23]. Com base nas nossas conclusões, outros marcadores tais como CD24, CD26 e CD44 também mais foram expressos em células GBM8401 SP em comparação com células não-SP, variou de 1,7 a 2,5 dobras. As propriedades de CSC células SP foram ainda confirmados pela evidência de expressão mais elevados de múltiplos marcadores stemness descritos acima.

Foi demonstrado que as células CD133-altamente expressos localizado na parte central do tumor mostrou mais resistente à TMZ em contraste com aqueles localizados na camada periférica [6]. Por conseguinte, o GBM resistente TMZ tinha sido demonstrado para conter maior proporção de CD133

+ células e as células SP resistente TMZ neste estudo também possuía maior nível de CD133.