Abstract

O jato de plasma tem sido proposta como um método terapêutico novo para o câncer. actividade anti-cancro de plasma tem sido relatado para envolver disfunção mitocondrial. No entanto, o que compostos gerados por plasma está associada a este processo anticancro e o seu mecanismo de acção permanecem obscuros. Aqui, nós relatam que os efeitos terapêuticos do resultado plasma de ar de geração de espécies de oxigênio /nitrogênio reativas (ROS /RNS), incluindo H

2O

2, Ox, OH

-, • O

2 , NOx, conduzindo à despolarização da membrana mitocondrial e potencial de acumulação de ROS mitocondrial. Simultaneamente, ROS /RNS activar c-Jun NH

cinase 2-terminal (JNK) e cinase p38. Como consequência, o tratamento com jactos de ar de plasma induz a morte apoptótica em células HeLa humanas do cancro do colo do útero. O pré-tratamento das células com antioxidantes, JNK e inibidores de p38, ou JNK e siRNA p38 revoga a despolarização da membrana mitocondrial potencial e prejudica a morte celular por apoptose induzida por plasma de ar, o que sugere que o ROS /RNS gerado por vias de sinalização de desencadeamento de plasma que envolvem a JNK e p38 e promover a perturbação mitocondrial, o que leva a apoptose. Portanto, a administração de plasma de ar pode ser uma estratégia viável para eliminar as células cancerosas

Citation:. Ahn HJ, Kim KI, Hoan NN, Kim CH, Lua E, Choi KS, et al. (2014) Segmentação células cancerosas com reativas de oxigênio e espécies de nitrogênio gerados pelos atmosférica de pressão de ar Plasma. PLoS ONE 9 (1): e86173. doi: 10.1371 /journal.pone.0086173

editor: Xianglin Shi, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de setembro de 2013; Aceito: 06 de dezembro de 2013; Publicação: 21 de janeiro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Ahn et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos subsídios da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia do financiados pelo governo da Coreia (MSIP) (2012M3A9B2052871, 2010-0.018.546, 2011-0.030.043). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o plasma é frequentemente referido como o quarto estado da matéria em adição ao sólido, líquido e gasoso. O plasma é bastante semelhante ao do gás em que uma proporção das partículas é ionizado e carregada, algumas partículas electricamente neutra, e alguns são radicais quimicamente activados. Plasma pode ser categorizada como “plasma térmico (ou quente)” ou “plasma não térmico (ou frio).” Numerosas técnicas usando plasma foram investigados e implementado com sucesso em certas aplicações industriais. Recentemente, aplicações de plasma têm sido empregadas em ciências biológicas e médicas, incluindo a coagulação do sangue [1], terapia de câncer [2], a esterilização da superfície [3], e tratamento da cárie dentária [4]. Em particular, aumentando a investigação translacional plasma no tratamento do câncer pode prometer novos efeitos terapêuticos. Além disso, é interessante notar que o plasma frio gerado à pressão atmosférica aumenta a viabilidade de aplicações médicas.

Embora o material (s) biologicamente eficaz gerado a partir de plasma e os seus alvos celulares permanecem desconhecidas, várias linhas de evidência de ligação de oxigénio reactivo espécies /azoto (ROS /RNS) para os seus efeitos biológicos. O tratamento com plasma causado a despolarização do potencial de membrana mitocondrial e a geração de ROS nas células humanas [2]. Além disso, os antioxidantes melhorada disfunção mitocondrial induzida por plasma, apoiando a noção de que as espécies oxidantes tais como ROS podem mediar os efeitos induzidos pela plasma em células de mamíferos [2]. Uma vasta gama de causas aparentemente não relacionados e complexos de disfunção mitocondrial tem mecanismos fisiopatológicos subjacentes comuns: produção e acumulação de dano mitocondrial ROS, levando ao aumento do estresse oxidativo, perda de ATP, mitophagy para controle de qualidade e eliminação de mitocôndrias danificadas e, eventualmente, a morte celular [5].

agora, é claro que ROS têm um papel de sinalização celular em muitos sistemas biológicos a partir de bactérias às células de mamíferos [6]. ROS pode activar cascatas de sinalização celular, tais como aqueles que envolvem muitas cascatas diferentes de proteína cinase activada por mitogénio (MAPK) [7], [8]. Estas incluem as quinases de stress, as quinases c-Jun N-terminal (JNK) e proteína cinase activada pelo stress (SAPK). JNK foram identificadas como uma quinase que se liga, fosforila e c-jun em Ser-63 e Ser-73 dentro do seu domínio de activação da transcrição. JNK é activada pelo tratamento das células com citocinas (por exemplo, factor de necrose tumoral (TNF) e interleucina (IL) -1) e pela exposição de células a muitas formas de stress ambiental (por exemplo, o stress osmótico, o stress redox, e radiação ) [9]. Tem sido bem estabelecido que as ROS são indutores potentes da JNK. A maioria dos relatórios sobre o resultado de activação JNK induzida ROS de ROS exógena, principalmente H

2O

2. Além disso, a acumulação de ROS induzidos por estímulos apoptóticos pode activar o SAPK p38 [10]. As JNK e p38 MAPK compartilhar vários reguladores a montante, e, consequentemente, existem múltiplos estímulos que ativam simultaneamente ambas as vias.

As ligações entre ROS sinalização e apoptose são propostas para ser mediada pela mitocôndria. Atualmente, muitos estudos têm sugerido que as mitocôndrias são o principal local de ação para JNK na apoptose. Ambos JNK1- e fibroblastos embrionários primários de murino suprimido-JNK demonstraram resistência à apoptose induzida por UV, devido a um defeito na via de sinalização da morte mitocondrial, incluindo a falta de libertação de citocromo c [11]. translocação mitocondrial de JNK ocorre em condições de estresse, tais como a exposição a UV, a radiação ionizante, ROS e RNS, e JNK assim mitocondrial-localizada oferece proximidade com gerada por mitocôndrias ROS [12], [13]. Além disso, os estímulos apoptóticos por vezes desencadear a activação p38a por uma via secundária, tal como a produção de ROS [13]

e vários outros grupos têm relatado que o plasma à pressão atmosférica, [2], [14]. – [19] e os jactos de plasma de azoto a partir de uma rede de micro-bico [20] induzir a apoptose em células cancerosas. Recentemente, o plasma foi mostrado para promover a apoptose de células cancerosas pela geração de ROS, perturbação do potencial de membrana mitocondrial e activação de proteínas da família da caspase [2]. No entanto, o componente (s) gerado pelo plasma de ar produz os seus efeitos anti-cancro e o mecanismo molecular pelo qual o plasma induz apoptose permanecem obscuros. Para este relatório, tentamos encontrar o componente (s) efetoras gerada a partir de plasma de ar e seu alvo e para elucidar o mecanismo molecular e caminho bioquímico pelo qual ele induz benefícios terapêuticos anticancerígenos. Identificamos o ROS /RNS como efetores chave de plasma de ar, que têm como alvo a mitocôndria e leva à activação de JNK e p38 sinalização percursos.

Resultados

micro Air jato de plasma pode gerar reativas de oxigênio e espécies de nitrogênio

O sistema de micro jato de plasma operado à pressão atmosférica pode produzir espécies quimicamente activas, particularmente de oxigênio e nitrogênio átomos [21]. Neste estudo, foram empregues primeira análise de espectro de emissão óptico para identificar as partículas e os radicais gerados pelo sistema de plasma de ar (Figura 1-A-b), que podem mediar os efeitos de plasma de ar de células cancerosas [2], [22]. espectroscopia de emissão óptica (OES) foi realizado sobre uma ampla gama de comprimentos de onda de 280 nm a 920 nm com um espectroscópio de emissão óptica (SV 2100, K-MAC) (Figura 1C). As linhas de emissão dominantes ilustrar a presença de iões de oxigénio excitados (O

2

+) a 500-600 nm e oxigénio atómico (O I) em 777 e 844 nm (Figura 1c). Além disso, as espécies reactivas detectados associados com azoto são moléculas excitadas azoto (N

2 segundo sistema positivo e N

2 primeiro sistema positivo) nas gamas de 300-390 e 610-710 nm, e moléculas de azoto ionizados (N

2

+ primeiro sistema negativo) na gama de 390-480 nm, e de azoto atómico (Ni), em 747, 822, e 868 nm (Figura 1C). Estes resultados indicam OES que o jacto de plasma de micro ar pode desempenhar um papel importante na produção de várias espécies de oxigénio e azoto reactivos (ROS e RNS, respectivamente).

(a), fotografia do sistema de jacto de microplasma fabricada. A inserção é uma apresentação esquemática da tubeira de micro jacto de plasma. (B) Fotografia de micro jacto de ar gerado plasma à pressão atmosférica. (C) espectro de emissão óptica de jet micro ar plasma durante a descarga.

extracelular e intracelular ROS e RNS foram gerados pela exposição do plasma do ar

Uma dica que ROS e RNS pode mediar a efeitos anticancerígenos de plasma de ar foi sugerido pelo nosso estudo anterior relatando que o plasma de ar induzida apoptose, acompanhada pela geração de ROS e RNS e diminuir o potencial de membrana mitocondrial (MMP) em células do cancro do colo do útero [2]. Além disso, a produção de ROS e RNS por jacto de plasma tem sido recentemente estudados [23], e é consistente com os espectros de emissão de plasma induzida pelo ar (Figura 1C). Portanto, bioquimicamente analisada a produção de ROS e RNS, a sua entrega na fase líquida do meio de cultura celular, a migração e sequencial de ROS e RNS em células (Figura 2).

(A) Níveis de extracelular H

2O

2 foram determinados em cultura ou não-cultura (Medium apenas) sobrenadantes, com (AP) ou sem tratamento de plasma de ar (-tratados não). O sobrenadante da cultura foi recolhido nos tempos indicados após o tratamento com plasma de ar (AP). AP 0 (min) indica sobrenadante colhido imediatamente depois do tratamento de plasma. A concentração de H

2O

2 no sobrenadante da cultura foi determinada por comparação com um H

2O

2 curva de calibração padrão, a seguir à incubação com o reagente de Amplex Ultrared (

n =

5). (B) produção e /ou a penetração através da membrana plasmática de ROS incluindo H

2O

2, OH

-, e • O

2 na matriz intracelular seguinte jacto de plasma a ar comprimido (AP) foram determinado utilizando a sonda ROS-sensíveis H

2DCFDA (

n

= 5). A fluorescência das células não tratadas (não-tratado) foi arbitrariamente definido como 1. (c) níveis de NO extracelular foram determinados em não-cultura (na ausência de células HeLa, e superiores) cultura (na presença de células HeLa, inferior ) sobrenadantes nos momentos indicados após plasma de ar exposição jet pelo ensaio de Griess (

n

= 10). (d) Os níveis de NO intracelular foram avaliados usando DAF-FM. Os dados são apresentados como a média ± S.E.M. (

n

= 10).

Em primeiro lugar, procurou determinar se o tratamento com plasma de ar induziria a geração de H

2O

2 no sobrenadante da cultura (Figura 2a ). O sobrenadante da cultura foi recolhido nos tempos indicados após tratamento com plasma de ar e a concentração de H

2O

2 no sobrenadante da cultura foi analisado por comparação com H

2O

2 curva de calibração padrão. H

2O

2 foi gerado a cerca de 26,93? M, imediatamente após o tratamento com jactos de plasma e a concentração de ar no sobrenadante da cultura diminui rapidamente dentro de 1 h. No entanto, H

2O

2 em meio de cultura por si só não diminuiu mais lentamente até que se segue 1H tratamento com plasma, em comparação com o nível no sobrenadante da cultura. Em 3 h, os níveis de H

2O

2 foram semelhantes nos sobrenadantes de cultura de células HeLa e apenas em meio. H

2O

2 foi apenas detectada no sobrenadante da cultura, em 3 h após tratamento com plasma (Figura 2a). Estes resultados sugerem que o plasma do ar pode gerar e sequencialmente entregar H

2O

2 para o meio. Além disso, a razão para a diminuição inicial rápida do H

2O

2 gerado por plasma de ar no sobrenadante da cultura em comparação com o que em meio não-cultura pode ser que as células de promover a eliminação de H

2O

2. Para testar esta possibilidade, nós monitoramos os níveis de H

2O

2 em sobrenadante de cultura e meio não-cultura por si só seguir H

2O

2 tratamento (Figura S1a). Quando as células HeLa foram tratados com 2 mM de H

2O

2, H

2O

2 foi igualmente detectado em ambos os sobrenadante de cultura e meio não-cultura imediatamente após o tratamento. No entanto, em 3 h após a H

2O

2 tratamento, H

2O

2 foi apenas detectada (aproximadamente 100 uM) no sobrenadante da cultura, mas o nível manteve-se a aproximadamente 670 ^ M em não- meio de cultura (Figura S1a). Com base nesse resultado, especula-se que as células podem eliminar H

2O

2 gerada pelo plasma de ar, levando a uma diminuição acelerada em H

2O

2 no sobrenadante da cultura.

a seguir, acompanhou a geração de ROS intracelulares incluindo H

2O

2, radicais hidroxila (OH

-) e oxigénio atómico (• o

2), na sequência de tratamento de plasma, utilizando H

2DCFDA (Figura 2b). Após o tratamento de plasma de ar, níveis de ROS intracelulares aumentaram aproximadamente 2,7 vezes (2,73 ± 0,13). Este elevado nível diminuído até 3 horas após tratamento com plasma e recuperado quase para o nível basal não tratado em 24 horas (Figura 2b). Estes dados sugerem que o tratamento de plasma induz a geração de ROS intracelular.

Em seguida, avaliou-se o plasma a ar pode resultar na geração de RNS extracelulares e intracelulares (Figura 2C e D, respectivamente). Imediatamente após o tratamento com plasma, níveis de NO extracelulares foram elevados a aproximadamente 13,28 mm em ambos não-cultura e dos meios de cultura (Figura 2c). Por 3 h após o tratamento com plasma, níveis de NO em extracelulares não-cultura e meios de cultura diminuiu rapidamente para cerca de 8,26 ou 5,8 mm, respectivamente (Figura 2C). Em pontos de tempo mais tarde do que 3 h, a extracelular NÃO nível em meio não-cultura foi mantida, enquanto a extracelular NÃO nível no meio de cultura foi continuamente reduzida para cerca de 1,28 mM em 24 h após tratamento com plasma (Figura 2c), o que indica que as células podem absorção ou remover NÃO extracelular gerado pelo plasma.

de modo semelhante, os níveis intracelulares de nO nas células tratadas com plasma foram aumentadas em aproximadamente 1,8 vezes (1,75 ± 0,20) ou 2,3 ​​vezes (2,28 ± 0,07) em 1 h e em 18 h após tratamento com plasma de ar, respectivamente, em comparação com aqueles em células não-tratadas. O elevado nível intracelular NÃO foi mantida até às 24 horas (dados não apresentados) após o tratamento com plasma e recuperado quase para o nível basal não tratado em 48 horas (Figura 2D e a Figura S1B), semelhante aos níveis de ROS depois de tratamento com plasma (Figura 2b). Ar plasma induzido um aumento maior e mais durável em NO do que a induzida por H

2O

2 (Figura 2d e Figura S1b-C). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que o tratamento com plasma induz a geração de NO extracelular e intracelular.

Para apoiar esse plasma de ar gerada níveis de ROS e RNS em células de mamíferos, examinamos se antioxidantes atenuar a induzida por plasma ROS /RNS geração medindo os níveis de ROS e RNS em células HeLa a seguir ao tratamento com plasma na presença de antioxidantes. Em primeiro lugar, testou-se a bem conhecida NAC antioxidante tiol [24] pode afectar a concentração de H

2O

2 em sobrenadantes de cultura a seguir ao tratamento de plasma de ar (Figura 3a). Em combinação com o jato de plasma, cultura de células HeLa ou médio só foi pré-tratados com NAC. NAC induziu a rápida diminuição de H

2O

2 a cerca de menos de 4,13 ± 1,67 ^ M em 15 min após o tratamento com plasma, semelhante aos níveis observados em 2 h após o tratamento de plasma sem NAC (figura 3a), o que sugere que NAC pode aliviar a induzida por plasma de ar H

2O

2 geração. A seguir, analisou se os antioxidantes podem diminuir a geração induzida por plasma de ar de intracelular ROS (Figura 3b). Para fazer isso, nós avaliamos os níveis de ROS seguintes pré-tratamento com NAC antioxidante ou cPTIO e exposição ao plasma de ar. Ambos NAC e cPTIO poderia atenuar a geração de ROS intracelulares induzidos por plasma de ar (Figura 3B). Curiosamente, a atenuação clara de geração de ROS intracelular por cPTIO, um anti-oxidante eficaz de RNS, tais como óxido nítrico (NO

•), levou à especulação de que o plasma de ar pode gerar RNS, bem como de ROS e da geração intracelular de ROS pode ser ligada à geração de RNS.

(a) Níveis de extracelular H

2O

2 foram determinados em cultura ou não de cultura (meio apenas) com sobrenadantes de tratamento com plasma de ar na presença (AP + NAC) ou ausência (AP) do NAC antioxidante (

n

= 5). NAC foi adicionado 1 h antes do tratamento de plasma. O sobrenadante da cultura foi recolhido nos tempos indicados após o tratamento com plasma de ar. AP 0 (min) indica sobrenadante colhido imediatamente depois do tratamento de plasma. (B) geração de ROS incluindo H

2O

2, OH

– e, • O

2 na matriz intracelular seguinte jato de plasma de ar (AP) foram determinados utilizando a sonda ROS-sensíveis H

2DCFDA (

n

= 5). As células foram pré-tratadas com os antioxidantes NAC ou cPTIO para 1h e, em seguida, expostos ao ar plasma (AP + NAC ou AP + cPTIO) ou H

2O

2 (H

2O

2 + NAC ou H

2O

2 + cPTIO). Nos tempos indicados a seguir ao tratamento de plasma de ar, as células foram recolhidas. A fluorescência das células não tratadas (não-tratado) foi arbitrariamente definido como 1. (c) níveis de NO extracelular foram determinados em não-cultura (na ausência de células HeLa, e superiores) cultura (na presença de células HeLa, inferior ) sobrenadantes nos momentos indicados após plasma de ar exposição jet pelo ensaio de Griess (

n

= 10). Médio na presença ou ausência de células HeLa foram pré-tratados com NAC ou cPTIO durante 1 h antes da exposição ao plasma ou H

2O

2. (d) Os níveis de NO intracelular foram avaliados usando DAF-FM. Os dados são apresentados como a média ± S.E.M. (

n

= 10).

Nós ainda determinar se os antioxidantes podem diminuir a geração induzida por plasma de ar de RNS. Verificou-se que o NO cPTIO antioxidante promovida diminuições no nível extracelular NO induzida por plasma em ambos os sobrenadante de cultura e meio não-cultura (Figura 3c). Em contraste, NAC teve pouco efeito sobre os níveis de NO induzida extracelulares do plasma em ambos cultura e meio não-cultura (Figura 3c). Consistente com os resultados, não extracelular, C-PTIO mas não NAC pode diminuir significativamente a geração de RNS intracelulares por plasma de ar (Figura 3D e Figura S1B). A atenuação específica das RNS induzida por plasma de ar por cPTIO (o antioxidante eficaz RNS) e atenuação das RNS

2O

2-induzidas H por ambos NAC (o antioxidante eficaz ROS) e cPTIO (Figura 3D) sugerem que o plasma do ar pode gerar RNS diretamente, mas o H

2O

2 induzida pela geração RNS pode ser mediada pela via (s), envolvendo intermediários ROS. Tomados em conjunto com os dados de geração de ROS e RNS (Figuras 2-3), nossos resultados indicam que o plasma do ar pode gerar sobrenadantes de cultura extracelular e intracelular ROS e RNS em e para o ambiente celular.

plasma Air ativa JNK e p38 MAPK mediada por sinalização de via

para determinar se ROS e RNS gerada pelo plasma do ar pode atuar como moléculas de sinalização e quais vias de sinalização estão envolvidos neste transdução, temos procurado por cascatas de MAPK que são conhecidos por estarem implicados nas vias de sinalização em resposta ao estresse oxidativo, tais como ROS, RNS, UV, e irradiação ionizante. Para fazer isso, testamos se o ROS /RNS gerada pelo plasma de ar induz JNK, p38 e /ou ativação ERK. Foram realizadas análises de imunofluorescência e immunoblotting para avaliar a fosforilação destas quinases induzidas por H

2O

2 e a sua activação em resposta ao tratamento com plasma de ar (Figura 4 e Figura S2). A exposição ao plasma de ar altamente induzida por activação de JNK, em comparação com a sua activação modesto por H

2O

2 (Figura 4A e Figura S2a), sugerindo que a sinalização podem ser evocados por plasma de ar e pode, consequentemente, activar um JNK mediada via de transdução de sinal. Quando as células foram tratadas com plasma ou H

2O

2 na presença de um inibidor de JNK (SP600125), a activação da JNK foi revogada como esperado, em 1 h após o tratamento com plasma ou H

2O

2 (Figura 4A e Figura S2a). Além disso, a NAC foi capaz de reduzir a activação de JNK por plasma ou H

2O

2 (figura 4A, painel de baixo), indicando que algum tipo de sinal de stress oxidativo pode ser evocada pelo plasma.

(a) a fosforilação de JNK após o tratamento com jato de plasma de ar ou H

2O

2 foi analisada por meio de imunofluorescência e immunoblotting utilizando anticorpo anti-fosfo JNK. A quantidade equivalente de proteínas totais de JNK é mostrado como um controlo de carregamento quantitativo para JNK fosforilação. (B) A fosforilação de p38 induzida por plasma de ar foi visualizado por imunotransferência utilizando um anticorpo anti-fosfo-p38. As proteínas p38 totais comparáveis ​​são mostrados como um controlo de carga para a fosforilação da p38. (C) Variação do estado de fosforilação de ERK não foi detectado após o tratamento com plasma de ar ou H

2O

2.

Em seguida, examinámos a activação de p38 por plasma e se NAC poderia afectar a activação de p38 induzida por plasma. De um modo análogo ao da JNK, plasma de ar evocado a fosforilação da p38 e esta fosforilação induzida por plasma foi parcialmente melhorada por NAC, indicando que o sinal induzido por plasma de ar pode activar a via de sinal mediada por p38 e pode ser um tipo de sinal oxidante (Figura 4b e Figura S2B). Em contraste, o plasma teve pouco efeito sobre a fosforilação de ERK1 /2 (Figura 4C). Estes dados, em conjunto, sugerem que o plasma do ar pode evocar sinais intracelulares e sequencialmente ativar vias de transdução de sinal intracelular mediadas via JNK ou p38.

plasma Air induz a acumulação mitocondrial ROS e disfunção mitocondrial

As mitocôndrias são uma importante fonte de geração de celular ROS [25] e estresse oxidativo incluindo H

2O

2 pode iniciar o colapso da transmembrana mitocondrial potencial (Δψm) [26]. Em um relatório anterior, verificou-se que o colapso do potencial transmembrana mitocondrial (Δψm) é induzida por N

2 ou plasma do ar [2]. Para ver se o plasma podem induzir acumulação de ROS mitocondrial, medimos superóxido mitocondrial após o tratamento de plasma utilizando MitoSox, um corante fluorogénico para a detecção selectiva de superóxido na mitocôndria de células vivas (Figura 5A). superóxido mitocondrial em células aumentou após tratamento com plasma de ar ou H

2O

2. Além disso, o nível de superóxido mitocondrial em células tratadas com plasma de ar (4,32 ± 0,05) era aproximadamente 2 vezes maior do que em

2O

2 tratados com células H (2,36 ± 0,23) a 6 h pós-tratamento com plasma (Figura 5a). Após este tempo (ou seja, 6 h pós-tratamento), a superóxido mitocondrial acumulada nas células tratadas com plasma diminuíram, enquanto que a superóxido acumulada na mitocôndria de H

2O

2-tratados células persistiu até 24 h (2,45 ± 0,39) (Figura 5a). Estes resultados sugerem que o plasma do ar pode provocar a acumulação de ROS incluindo superóxido na mitocôndria.

(a) a produção mitocondrial de ROS foi avaliada usando a sonda específica para mitocôndrias Mitosox seguinte H

2O

2 ou ar tratamento por plasma. O ROS mitocondrial em células não tratadas (não-tratado) foi arbitrariamente definido como 1. As células foram colhidas nos tempos indicados a seguir ao tratamento de plasma de ar e analisadas por citometria de fluxo. (B) As células foram pré-tratadas com os anti-oxidantes (NAC ou cPTIO) ou inibidores de cinase (SP600125 ou SB203580) durante 1 h e, em seguida, exposta ao plasma de ar (AP + NAC, AP + cPTIO, AP + SP ou AP + SB) ou H

2O

2 (H

2O

2 + NAC, H

2O

2 + cPTIO, H

2O

2 + SP ou H

2O

2 + SB). As células foram colhidas nos tempos indicados a seguir ao tratamento de plasma, e os níveis de ROS mitocondrial foi medido (

N

= 5). A fluorescência das células não tratadas (não-tratados) foi arbitrariamente definido como 1. (c) O potencial de membrana mitocondrial foi avaliada usando a sonda específica para mitocôndrias JC-1 com ou sem ar plasma ou H

2O

2, (

n

= 5). A fluorescência em células HeLa não tratadas foi arbitrariamente definida como 1.

Além disso, examinamos se os antioxidantes podem atenuar a acumulação de superóxido mitocondrial induzida por plasma de ar. NAC ou cPTIO foi capaz de diminuir a produção de superóxido mitocondrial (Figura 5b). Como plasma de ar activa JNK e vias de sinalização mediadas por p38 (Figura 4a-b e Figura S2), a possibilidade de que os processos de transdução do sinal activada por plasma estão envolvidas na acumulação de ROS mitocondrial foi investigada. Descobrimos que o SB203580 inibidores da quinase e SP600125 foram capazes de minar mitocondrial geração de superóxido induzida por plasma (Figura 5b), o que implica que o plasma pode induzir a produção de ROS na mitocôndria em uma JNK- e forma dependente da p38.

Devido plasma ar induzido a geração de celular ROS /RNS (Figura 2) e mitocondrial ROS (Figura 5a) e o colapso do potencial transmembrana mitocondrial (Δψm) [2], examinamos se ROS /RNS poderia estar ligada ao plasma do ar disfunção mitocondrial induzida por tratamento de células HeLa com plasma de ar na presença do NAC antioxidantes ou cPTIO. Monitorou-se o potencial transmembranar mitocondrial (Δψm) a seguir ao tratamento de plasma, na ausência ou presença de NAC ou cPTIO, utilizando a sonda específica para as mitocôndrias de JC-1. plasma de ar ou H

2O

2 tratamento induziu o aumento da intensidade de fluorescência verde /vermelho (cerca de 3,3 vezes ou de 2,1 vezes, às 12 horas e 2,9 vezes ou de 3,6 vezes a 24 h, respectivamente), confirmando que tanto o plasma e H

2O

2 podem induzir uma diminuição na Δψm (Figura 5c). NAC ou cPTIO mostrou efeitos parcialmente melhoramento na redução da Δψm induzida por plasma ou H

2O

2 tratamento (Figura 5c), o que sugere que o plasma induzida por ar ROS /RNS pode desempenhar um papel na disfunção mitocondrial. Uma vez que os processos de transdução de sinal subjacentes à redução induzida por plasma na Δψm são desconhecidos, determinou-se se os inibidores de JNK e p38 poderia atenuar o dano mitocondrial induzida por plasma. De um modo semelhante, os inibidores de JNK e p38 (SP600125 ou SB203580) foram capazes de atenuar os efeitos de plasma e H

2O

2 na diminuição Δψm, ainda que não resultem em condições normais Δψm (Figura 5c). Estes resultados sugerem que o plasma de ar produz ROS /RNS, conduzindo à activação da via de transdução de sinal de JNK ou p38. Simultaneamente, ROS /RNS parecem induzir o colapso da Δψm, que é parcialmente mediado através de JNK e p38 transdução de sinal

ROS geração /RNS induz a morte celular por apoptose induzida por plasma através da activação de JNK e celular mediada por p38 transduções de sinal e disfunção mitocondrial

para determinar a morte celular induzida por plasma de ar, primeiro testada a possibilidade de que as ROS /RNS foram responsáveis ​​pela morte de células de cancro induzido por plasma de ar por tratamento de células HeLa com plasma de ar na presença dos antioxidantes NAC ou cPTIO. O pré-tratamento com NAC e cPTIO atenuada morte celular induzida por plasma (49,5% ± 2,2% e 38,86% ± 4,2%, respectivamente, Figura 6A e Figura S3), corroborando que ROS /RNS está implicado na morte celular induzida por plasma. Porque não há nenhum bom controle para RNS semelhante ao uso de H

2O

2 como controlo canônico para ROS, nós também testou se NaNO

3 poderia induzir a apoptose, envolvendo plausivelmente NO e RNS gerada a partir de NaNO

3. NaNO

3 promoveu morte celular em concentrações mais elevadas do que H

2O

2 (Figura S3-S4). De acordo com este resultado, a razão NaNO

3 não induz a morte celular eficaz é que ele não consegue gerar RNS eficazes /ROS diferente de plasma de ar ou H

2O

2 (Figura S4).

agentes de (a) e (NAC Antioxdizing cPTIO) ou inibidores de cinase (SP600125 e SB203580) parcialmente resgatados da morte celular induzida por plasma. Os dados são apresentados como a média ± S.E.M. (

n

= 10). (B) a morte celular induzida por plasma foi parcialmente revogada em JNK1 /2 (siJNK1 /2) ou p38 (sip38) células knockdown. Para monitorar a morte celular induzida por plasma, o ensaio de viabilidade celular baseado no ATP foi realizada na presença de controlo, JNK1 /2, p38 ou ARNsi. Os dados são apresentados como a média ± S.E.M. em triplicado de três experiência independente (

n

= 3). A viabilidade celular da população de células HeLa não tratadas foi arbitrariamente definida como 100%. Imunotransferência com anti-JNK e p38 anticorpos foi feito para confirmar knockdown. * P 0,01, ** p 0,05. (C) – (d) Ar plasma induzida Bax translocação para a mitocôndria. O plasma ou

células

2 tratados com 2O H foram incubadas durante 6-24 h. Após 6-24 horas de incubação, as células foram fixadas em 3,7% de formaldeído. Bax (verde) foi corado anticorpo anti-Bax e MitoTracker foi usada para coloração de mitocôndrias (vermelho). Bax (verde) e de fluorescência mitocondrial (vermelho, MitoTracker) foram avaliados, 6 h (d) e 24 h ((C) e (D)) após a exposição ao plasma de ar durante 5 min por microscopia confocal. Bax foi difusamente distribuídas em células não tratadas (não-tratado). No entanto, após o tratamento com plasma, Bax foi localizada para a mitocôndria, baseada na sobreposição das imagens de fluorescência e Bax Mitotracker (fusão, amarela). DAPI foi utilizado para coloração nuclear (azul). barra branca foi a ampliação média de imagem (10 mM). (E) Lance formado um complexo com o pró-apoptótica de Bcl-xL após tratamento de plasma. (F) a morte celular induzida diferencial plasma Air no A549 adenocarcinoma de pulmão humano e linhas de células de fibroblastos de pulmão MRC5 normais. As células A549 e MRC5 foram tratados com jactos de plasma de ar e, em seguida, incubadas durante mais 24 h. Após a colheita e células coradas com anticorpo anti-anexina V-FITC e PI, a morte celular foi avaliada por citometria de fluxo. Os valores representam a média (S.E.M) a partir de três experiências independentes. (G) Uma proposta de modelo para o plasma do ar apoptose induzida por jet em células HeLa através da produção de ROS /RNS, invasão de células, a activação das vias de transdução de sinal, e danos mitocondrial.

Para investigar o papel do JNK e p38 MAPK em vias de morte celular por apoptose induzida por plasma de ar, que empregue seus inibidores específicos, SP600125 (inibidor de JNK) e SB203580 (inibidor de p38 MAPK). Quando as células foram pré-tratadas com SP600125 ou SB203580 antes da exposição jacto de plasma a ar comprimido, a população de morte celular por apoptose foi reduzida para 59,3% ± 2,3% e 52,0% ± 9,7%, respectivamente, em comparação com a morte celular induzida pelo jacto de plasma sozinho (85,4 ± 3,4%) (Figura 6a e Figura S3), sugerindo que a transdução do sinal através da JNK e p38 é parcialmente envolvido na morte celular induzida por plasma. Para obter mais detalhes sobre os papéis de JNK e p38 durante a morte celular induzida por plasma, a viabilidade celular das células JNK- ou com depleção de p38 foi analisado a seguir ao tratamento de plasma por medição de ATP a partir de células viáveis. Descobrimos que a redução induzida por plasma na viabilidade celular foi atenuada por JNK1 /2 ou p38 siRNA siRNA (Figura 6b).