Resistência

Abstract

para tratamento de progesterona é um grande obstáculo no tratamento de cancro do endométrio avançado e recorrente. Fenretinida é um retinóide sintético, que foi avaliado em ensaios clínicos como um agente terapêutico e quimio-preventiva do cancro. Fenretinida foi estabelecido para ser citotóxica para muitos tipos de células cancerosas. No presente estudo, demonstramos que fenretinide diminuiu a viabilidade celular e apoptose induzida em células de Ishikawa, que são uma linha de células de cancro do endométrio, de forma dependente da dose

in-vitro

. Este efeito

foi encontrado para ser

independente de ácido retinóico via de sinalização do receptor nuclear.

Além disso

, mostrámos que esta indução da apoptose pela fenretinida pode ser causada pelo aumento da absorção de retinol através de Stra6. O silenciamento de Stra6 foi demonstrado para diminuir a apoptose, que foi inibida pela expressão knockdown de Stra6 em células de Ishikawa. Resultados de um

in-vivo

estudo demonstrou que injeções intraperitoneais de fenretinide em tumores de câncer de endométrio (criado usando células de Ishikawa) em ratos inibiu o crescimento do tumor de forma eficaz. A imuno-histoquímica de tumores ratos mostrou uma diminuição na expressão de Ki67 e um aumento da caspase-3 clivada coloração após o tratamento fenretinida quando comparado com os ratinhos tratados com veículo. Coletivamente, nossos resultados são os primeiros a estabelecer a eficácia da fenretinide como um agente anti-tumoral para o câncer endometrial ambos

in-vitro

e

in-vivo

, fornecendo uma justificativa valioso para iniciar mais estudos pré-clínicos e ensaios clínicos utilizando fenretinide para o tratamento de cancro do endométrio

Citation:. Mittal N, Malpani S, Dyson M, Ono M, Coon JS, Kim JJ, et al. (2014) Fenretinide: um novo tratamento para o cancro endometrial. PLoS ONE 9 (10): e110410. doi: 10.1371 /journal.pone.0110410

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 19 de fevereiro de 2014; Aceito: 15 de setembro de 2014; Publicação: 23 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Mittal et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Os financiadores não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Estes estudos foram apoiados por fundos generosas de John e Diane O’Donnell (a divisão de Ginecologia Oncológica, NU) e Biologia Reprodutiva Divisão, NU. Estudos também foram apoiados por K12HD050121 ea Carreira de Desenvolvimento Award ASRM, que foram entregues a Mary Ellen Pavone. Suporte Grant Center (NCI CA060553) foi utilizado para a incorporação, de corte e coloração de tecidos tumorais. NU celular Imagem Facility foi generosamente apoiado pelo NCI CA060553 CCSG P30, que foi atribuído ao Robert H Lurie Comprehensive Cancer Center of

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução.

o câncer endometrial é o câncer ginecológico mais prevalente nos Estados Unidos, com uma estimativa de 49,560 novos casos e 8190 – mortes ocorridas em 2013 [1]. A probabilidade de uma mulher ser diagnosticado com este cancro durante a sua vida é de cerca de um em cada 38 [2]. A incidência desta neoplasia órgão reprodutor aumentou em uma média de 1,1% por ano entre 2004 e 2008 e as taxas de mortalidade também aumentaram, em média, 0,3% por ano de 1998 a 2007 [3]. A cirurgia, quimioterapia e terapia de radiação são três principais abordagens estabelecidas para o tratamento de carcinoma do endométrio [4], [5]. A remoção cirúrgica do útero e adjuvante resultado de terapia em uma maior do que 90% de taxa de sobrevivência cinco anos. Recorrência devido à resistência à quimioterapia ou radioterapia apresenta outro grande desafio para os profissionais de saúde. Por conseguinte, é de extrema importância para identificar novos e eficazes tratamentos para o cancro do endométrio.

Clinicamente, progestinas, incluindo Megace (acetato de megestrol) têm sido utilizados para tratar doenças malignas do endométrio, devido ao efeito antagonista da progesterona sobre a acção do estrogénio . Progestinas são usados ​​como agentes primários para tratar a doença em estágio avançado ou recorrente, aqueles que não são bons candidatos para a cirurgia e em mulheres mais jovens que gostariam de preservar sua fertilidade futura. Uma resposta completa pode ser conseguida quando a terapia de progestina é utilizada em mulheres com hiperplasia endometrial e bem diferenciadas adenocarcinoma do endométrio; No entanto, a eficácia da terapia de progestina gotas com um aumento da gravidade da doença. Além disso, as recidivas podem ocorrer uma vez a terapia de progesterona está parado [6], [7].

Em busca de agente terapêutico direcionado contra o câncer endometrial, anterior

in-vitro

estudos do nosso laboratório demonstraram marcada inibição da proliferação de linha celular de cancro do endométrio Ishikawa pelo ácido retinóico (RA) e o composto agonista de AR AM580 [8]. No entanto, a sua utilização clínica tem sido, até agora, limitada pelo seu perfil de efeitos secundários desfavoráveis ​​[9]. RA e seus derivados (ou compostos naturais ou sintéticos) têm um papel reconhecido na regulação do crescimento celular, diferenciação e apoptose. RA tem o potencial para o tratamento e prevenção de cancros [10], [11]. Retinol (a forma dominante de retinóides no corpo humano) deve ser convertido em ácido retinóico para mostrar a sua actividade biológica. A fonte primária de AR é vitamina A na dieta, o que é levado para cima no intestino e empacotado como ésteres de retinil no fígado. Estes ésteres de retinil são secretados para a circulação ligado a proteína de ligação do retinol (RBP) e subsequentemente tomado em células através de

Stra6

(estimulado por RA 6), um receptor da superfície celular crucial para a RBP [12]. Anteriormente, o nosso laboratório mostrou que Stra6 é o principal regulador de absorção de retinol no endométrio e que a diminuição da expressão de este gene na endometriose pode contribuir para a diminuição (17-beta) desidrogenase expressão 2 (HSD17β2) ARNm hidroxiesteróides [13], que conduz para níveis persistentemente elevados de estradiol. Mostrámos também que os retinóides diminuir a produção de estrogénio por indução da expressão em células de Ishikawa HSD17β2 do endométrio [14].

Stra6 é o principal receptor de superfície celular responsável pela absorção de retinol. Uma vez dentro da célula, o retinol pode ser oxidado para a RA mais biologicamente activa por álcool desidrogenases. RA é, então, dirigido a partir do citoplasma para receptores específicos de hormona nuclear RA (RARs) e os receptores de retinóide X (RXRs) por duas proteínas de transporte intra-citoplasmático, proteína de ligação RA especificamente celular 2 (CRABP2) e ácido gordo de proteína ligante 5 (FABP5 ) [15]. Finalmente, o RA não utilizado é metabolizado e eliminado para fora das células pela família CYP26 de enzimas [16].

[retinamida N-4-hidroxifenil (4-HPR)] Fenretinida, um derivado sintético de todo-trans ácido retinóico possui a capacidade de iniciar a apoptose celular, mesmo em linhas de células resistentes a ATRA com o benefício adicional de ter um perfil de efeitos colaterais menores. Estudos em humanos mostraram que os principais efeitos colaterais incluem diminuição da adaptação à escuridão dos olhos, da pele e da mucosa secura, prurido, urticária, desconforto gastrointestinal e alteração às superfícies oculares. Estes efeitos secundários são relativamente frequentes, mas suave. Como tal, está a emergir como um dos agentes antitumorais mais promissores [17]. Estudos têm demonstrado que fenretinida pode induzir citotoxicidade em várias linhas celulares de cancro humano in

in vitro

[18] – [23]. Clinicamente, fenretinida tem sido usado tanto como um agente quimiopreventivo em mama [24], da bexiga [25] e da mucosa oral de cancros [26], e como um agente quimioterapêutico em cancros [28] e adultos pediátricos [27], [29] – [31]. O mecanismo de acção de fenretinida induzida morte celular não tenha ainda sido completamente elucidadas. No entanto, tem sido proposto que os seus efeitos inibidores pode ser mediada por ambos os mecanismos independentes de ácido retinóico receptor-dependente e [17].

O presente estudo investigou o potencial terapêutico de fenretinida como um agente antitumoral, bem como seu potencial mecanismo de acção contra o cancro endometrial ambos

in-vitro

e

in-vivo.

Materiais e Métodos

declaração Ética

Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo animal Care Northwestern University e do Comitê Use.

endometrial células cancerosas cultura

linhas de células epiteliais endometrial Ishikawa (uma simpática oferta do Dr. Masato Nishida Hospital Nacional Kasumigaura , Tsuchiura, Ibaraki, Japão) foram obtidos a partir de células humanas malignas epiteliais do endométrio [32]. As células Ishikawa foram cultivadas em monocamadas a 37 ° C, 5% de CO2 numa incubadora mistura de DMEM e F12 (01:01) meio com soro a 5% de bovino fetal (FBS), 1% de piruvato de sódio e 1% de penicilina-estreptomicina, higromicina solução de antibióticos (Life Technologies, Grand Island, Nova Iorque).

pequeno ARN interferente (siRNA) knockdown

células Ishikawa foram cultivadas a cerca de 80% de confluência, em seguida, transfectadas com um ARNsi de controlo negativo nontargeting (siCTL) ou siRNAs contra Stra6 (Life Technologies) a 30 concentração nm usando Lipofectamine RNAiMAX de acordo com as recomendações do fabricante (Life Technologies). As células transfectadas foram tratadas com DMSO ou 6 fenretinida uM (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), solução a 60 horas pós transfecção. As células foram recolhidas após 24 horas de tratamento e processados ​​para PCR em tempo real ou transferência de Western.

A viabilidade celular ensaio

Prestoblue (Life Technologies) de reagente a viabilidade das células foi usada para estimar a viabilidade celular. Prestoblue é um resazurina – solução permeável à base de membrana que, após redução, se converte em resorufina, um composto fluorescente vermelha que pode ser medido quantitativamente para determinar a viabilidade das células [33]. As células Ishikawa foram semeadas (5 × 10

3 células por poço) em placas de 96 poços e cultivadas durante 24 horas a 37 ° C. As células foram então privadas de soro durante 16-18 horas [34], [35]. As células foram então cultivadas em meio fresco e tratado com diferentes concentrações de fenretinida e acetato de megestrol (Sigma-Aldrich) durante 24 h a 37 ° C. A citotoxicidade de fenretinida e acetato de megestrol foi medido através da adição do reagente de Prestoblue de acordo com as instruções do fabricante. O sinal de fluorescência foi medido para determinar a viabilidade celular no leitor de placas Synergy HT da Bio-Tek com o software KC4 3,4 a 530/590 nm.

análise Western blot

células Ishikawa foram tratados com diferentes concentrações de fenretinida e acetato de megestrol (Sigma-Aldrich) ou veículo, lisadas em RIPA [Tris 50 mM, pH 8.0,150 mM de cloreto de sódio, 1,0% de Triton X-100, 0,5% desoxicolato de sódio, 0,1% de SDS (dodecil sulfato de sódio ) suplementado com inibidores da protease e da fosfatase (Sigma-Aldrich). Limpar lisados ​​foram obtidas após centrifugação a 14.000 rpm durante 15 minutos, e a concentração de proteína foi medida utilizando o kit micro BCA (Thermo Scientific, Rockford, Illinois). As proteínas foram resolvidas por electroforese em dodecil sulfato de sódio-gel de poliacrilamida sobre NOVEX NuPAGE 4-12% Bis-Tris géis (Life Technologies) e transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (Whatman, GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ). As membranas foram bloqueadas com leite em pó a 5% sem gordura durante uma hora à temperatura ambiente e hibridados com anticorpos primários específicos para a PARP clivada total e [poli (ADP-ribose) polimerase], caspase-9 caspase-9 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) durante a noite a 4 ° C. As bandas de proteína foram visualizadas usando um reagente de quimioluminescência aumentada kit de detecção ECL Super Signal Oeste Femto (Thermo Scientific) após hibridação com um anticorpo de cabra anti-coelho, o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano (Cell Signaling Technology). As membranas foram retirados com Restaurar Ocidental Tampão de descascamento Blot (Thermo Scientific) e sondaram-se com o beta-actina (β-actina) anticorpo (Sigma-Aldrich) para controlo de carga de proteína.

PCR em tempo real

o ARN total foi isolado a partir de células de Ishikawa utilizando Qiagen RNAeasy Kit (Qiagen, Valencia, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. A pureza e concentração de RNA extraído foi determinado usando o ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop). 1 ug de ARN foi transcritos de modo inverso com o super mistura de ADNc Q-script (Quanta Biosciences Inc., Gaithersburg, MD, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. PCR quantitativo em tempo real foi realizado com a detecção ABI 7900 Sequência e os sistemas de expressão de genes ABI Poder Syber verdes (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). O mRNA foi quantificado utilizando iniciadores específicos, disponíveis comercialmente para Stra6, CRBP1, CYP26A1, CRABP2, FABP5, RAR-α, RAR-β, e RXR-α (Quiagen) e o gene GAPDH de limpeza (Tecnologias de ADN integrado, Chicago, IL). A mudança vezes na expressão foi calculada usando o método ΔΔCt [36] com o GAPDH como um controlo interno. As PCRs foram realizadas num ABI Prism 7000 Sequence Detection System (Applied Biosystems) durante 40 ciclos (95 ° C durante 15 s, 60 ° C durante 1 minuto) após 10 minutos de incubação a 95 ° C.

Xenoenxerto rato modelo

ratinhos nus atímicos CD-1 fêmea (4-5 semanas de idade, Charles River Laboratories International Inc., Wilmington, MA) foram mantidas em condições livres de patógenos específicos com base nas diretrizes estabelecidas pela Northwestern University, animal Care institucional e Comitê de Uso. Os ratos foram ovariectomizadas e, uma pelota de estradiol (1,7 mg /pelota, 60 liberação dia) (Innovative Research of America, Sarasota, Florida) foi implantado por via subcutânea. células de linha celular de cancro do endométrio humano de Ishikawa (2 x 10

6 /0,1 ml) foram suspensas em PBS 01:01 /Matrigel (BD Biosciences, San Jose, Califórnia) e injectadas subcutaneamente em ambos os flancos direito e esquerdo de cada murganho os tumores foram deixados crescer e uma vez que os tumores atingiram 50-150 mm

3 (que ocorreu em cerca de 2 semanas), os ratinhos foram divididos em 4 grupos: 1. 2. veículo, acetato de megestrol, 3 fenretinida (Tocris Bioscience, Bristol , Reino Unido) e acetato de megestrol Fenretinida +. pelotas de megestrol actate (21 mg, libertação de 21 dias para 1 mg /dia) (Innovative Research of America) foram implantados subcutaneamente. Os ratos receberam 120 mg /kg de fenretinida a um volume de 10 ml /kg de peso corporal, 5 vezes por semana durante 3 semanas através de injecção intraperitoneal. Os ratinhos de controlo foram tratados da mesma forma com i.p. injecções de 5% de etanol em solução de cloreto de sódio a 0,9% contendo 1,65 mg /ml de albumina de soro bovino. Não houve evidência de toxicidade local ou sistémica, após administração i.p. tratamento com a dose administrada [37] (Fig. S2). Os ratos foram pesados ​​e os tamanhos do tumor foram medidos com calibradores duas vezes por semana ao longo de todo o curso do tratamento. Os ratinhos foram sacrificados utilizando CO2 e asfixia os tumores foram ressecados. Os tecidos tumorais de murganhos foram pesados, em seguida, incorporada num bloco de parafina e sujeitas a imuno-histoquímica ou hematoxilina e eosina (H E) de coloração. Os volumes dos tumores foram calculados utilizando a fórmula:.

Onde “a” é o mais curto dos dois eixos perpendiculares [35]

Imunohistoquímica

Os tecidos foram fixados em formalina, embebidos em parafina , e 4 uM secções de tecido foram cortadas. Depois de-parafinização de secções de tecidos, recuperação de antigénio induzido pelo calor foi realizada num tampão de citrato de sódio 10 mM (pH 6,0) com 0,05% de Tween (Sigma) durante 20 minutos numa panela de pressão. As lâminas foram deixadas arrefecer durante 30 minutos à temperatura ambiente e foram então lavadas em TBS-T durante 5 minutos. O kit Dako EnVision HRP IHC foi usada (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA). A actividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peróxido de hidrogénio (3%) durante 10 minutos seguido de 2 lavagens com TBS-T durante 10 minutos. Para imunomarcação de Ki67, locais de ligação não específicos foram bloqueados com bloco de proteína, e as secções de tecido foram então incubadas com o anticorpo primário de Ki67 (Dako) durante a noite a 4 ° C numa câmara humidificada. anticorpo secundário anti-rato foi então aplicada às secções de tecido, durante 1 hora à temperatura ambiente e depois lavadas em TBS-T durante 5 minutos duas vezes. Para a caspase-3 clivada, as proteínas não específicas foram bloqueadas com 5% de soro de burro normal, incubadas com caspase-3 (Cell Signaling Technology) durante a noite, em seguida, um protocolo do kit ABC (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA) foi seguido. solução de DAB foi usado para desenvolver a cor, e hematoxilina de Mayer foi usada para contracoloração das secções. O hidróxido de amónio a 28% foi utilizada como um reagente azulados. As secções foram desidratadas através de 2 mudanças de 95% etanol, 2 mudanças de etanol a 100%, e 3 mudanças de xileno e, em seguida montado sobre a cobertura desliza com Cytoseal XYL meios de montagem (Richard-Allan Scientific). As lâminas foram visualizadas usando Zeiss vertical Axio TissueFAXS versão 3.5.5120.120 escopo (TissueGnostics GmbH, Viena, Áustria).

A análise estatística

Todos os dados quantitativos são expressos como valores médios ± erro padrão, e diferenças significativas foram determinadas por ANOVA de uma via utilizando GraphPad Prism6. Um valor probabilidade de

P

. 0,05 foi utilizado como critério de significância estatística

Resultados

Fenretinide diminui a viabilidade celular e aumenta a apoptose de células de cancro do endométrio Ishikawa

in vitro

O tratamento de células de Ishikawa com fenretinida viabilidade celular significativamente inibida e aumento da apoptose de um modo dependente da dose (Figuras 1A 1D). Fenretinida de 6 a 20 uM causou uma diminuição de 38% a 99%, respectivamente, a viabilidade celular e aumento da apoptose, como é evidente pelo aumento nos níveis de proteína de caspase clivada -9 e clivado-PARP, em comparação com as células tratadas com veículo. Fenretinida foi encontrado para ser tóxico para as células em doses mais altas do que duas concentração uM, após 24 horas de tratamento (dados não mostrados). A fim de determinar os efeitos de Megace, células Ishikawa foram tratados com Megace sozinho em diferentes concentrações e em combinação com fenretinida durante 24 horas e a viabilidade celular apoptose foram avaliados. Megace não têm qualquer efeito sobre a viabilidade celular e apoptose Ishikawa até 10 uM, tanto individualmente como em combinação com 6 uM fenretinida (Fig.1b, 1C 1E). Estes resultados sugerem que o fenretinide reduz a viabilidade das células e induz a apoptose em células de Ishikawa

in-vitro

tornando-se um candidato promissor para testar a sua eficácia

in-vivo

.

Ishikawa as células foram tratadas com DMSO (Veh), (a) 2-20μM fenretinida, (B) Megace 0.1-10μM ou (C) uma combinação de Megace + fenretinida durante 24 horas e a viabilidade celular foi medida utilizando o reagente Prestoblue. Os dados são apresentados como a mudança em unidades de dobragem de fluorescência relativa de amostras tratadas de DMSO e representam a média ± SEM de 4-5 experiências independentes. Um asterisco indica uma significativa (*

P

0,05) diminuição da viabilidade celular em células de Ishikawa tratados com fenretinida, em comparação com o grupo tratado com DMSO. (D) As células Ishikawa foram tratadas com DMSO (Veh) ou fenretinida 1-10μM que induziu apoptose de um modo dependente da dose dentro de 24 h de tratamento, como demonstrado pelo aumento da caspase-9 clivada e os níveis de proteína clivada-PARP através de Western blotting. (E) O tratamento de células de Ishikawa com Megace não tem qualquer efeito sobre estes marcadores de apoptose. Actina foi utilizado como controlo de carga. Borrões são representativos de 3 experiências independentes.

Fenretinide exerce um aumento na captação de retinol via Stra6 e CRBP1

Para determinar o efeito da fenretinide sobre o ácido retinóico via de sinalização no cancro endometrial, tempo real de RT PCR foi realizada. Os níveis de ARNm de Stra6, CRBP1 e CYP26A1 aumentou significativamente com o tratamento fenretinida [Fig.2 (A-C)]. O ARNm destes genes permaneceu inalterado com o tratamento Megace sozinho ou em combinação com fenretinida [Fig.3 (A-C]. No entanto, fenretinida não têm qualquer efeito sobre os níveis de ARNm de genes de receptores nucleares (RAR-a, RAR-p , α RXR-), ou as proteínas de transporte intra-citoplasmático CRABP2 e FABP5 (Figura S1).

o ARN total foi isolado a partir de células de Ishikawa tratados com DMSO (Veh) ou fenretinida 0.25-10μM durante 24 h e o expressão de genes envolvidos na absorção de retinol foi medida por RT-qPCR. os dados são apresentados como a mudança vezes na expressão de ARNm relativa de células fenretinida tratados a partir de células de amostras tratadas de DMSO e representam a média ± SEM de 3 experiências independentes. um asterisco indica uma significativa ( *

P

0,05) aumento na expressão de ARNm de (a) Stra6, (B) CRBP1 e (C) CYP26A1 genes em células de Ishikawa tratados com fenretinida, em comparação com grupo tratado com DMSO

O ARN total foi isolado a partir de células de Ishikawa tratados com DMSO (veículo), Megace, fenretinida e uma Megace combinação de ambos e fenretinida. expressões relativas de ARNm de (A) Stra6, (B) e CRBP1 CYP26A1 (C) foram analisadas com RT-qPCR. Os dados são apresentados como a mudança de dobragem em expressões relativas de ARNm a partir de amostras tratadas de DMSO e representam a média ± SEM de 5 experiências independentes. Um asterisco indica uma significativa (*

P

0,05). Aumento na expressão de ARNm destes genes em células tratadas com fenretinida Ishikawa ou células Megace + fenretinida, em comparação com as células tratadas DMSO

Stra6 knockdown influências fenretinida mediada por apoptose em células endometriais Ishikawa

Stra6 é o receptor principal do retinol da superfície celular nas células responsáveis ​​pela absorção de retinol. Para estabelecer se Stra6 é essencial para fenretinide apoptose induzida em células de Ishikawa, expressão Stra6 endógena foi derrubado usando siRNA. Como mostrado na Fig. 4A, fomos capazes de knockdown significativamente (76%) a expressão de Stra6 em células de Ishikawa. Knockdown de Stra6 ab-roga a apoptose induzida fenretinida em células de Ishikawa (Fig. 4B), conforme mostrado por níveis diminuídos de caspase-9 clivada e PARP clivada quando Stra6 está silenciada. Estes resultados suportam fortemente a nossa hipótese de que Stra6 é crucial para fenretinide apoptose induzida em células de Ishikawa endometriais.

células Ishikawa foram transfectadas com 30 nM siCTL (nontargeting controle negativo siRNA) ou siSTRA6. (A) O ARN total foi isolado a partir de células não tratadas de Ishikawa em 3 dias consecutivos de pós transfecção e a expressão do gene de Stra6 foi medido por RT-qPCR. Os dados são apresentados como a mudança vezes na expressão de ARNm de Stra6 em relação siSTRA6 células transfectadas e células transfectadas siCTL e representam a média ± SEM de 5 experiências independentes. Um asterisco indica uma significativa (*

P

0,05) decréscimo na expressão de ARNm de Stra6. (B) As células transfectadas Ishikawa foram tratadas com DMSO (Veh) ou 6μM fenretinida durante 24 h depois e imunotransferência foi realizada para os marcadores de apoptose. a expressão do gene de Stra6 knockdown fenretinida inibiu a apoptose induzida em células de Ishikawa, como demonstrado pela diminuição dos níveis de proteína de caspase-9 clivada e PARP clivada pela. Borrões são representativos de 3 experiências independentes

Fenretinide inibe a progressão do tumor:. Um rato modelo de xenotransplante

Initial

in-vitro

observações sugerem que a atividade anticâncer de fenretinide pode surgir a partir do seu potencial de promover a apoptose em células tumorais. Para examinar esta actividade anti-tumoral de fenretinida

in vivo

, os murganhos foram enxertados com tumores subcutâneos. Fenretinida tratamento suprimiu significativamente a progressão do tumor em ratinhos, em comparação com ratinhos tratados com veículo (Figura 5B), com base na mudança vezes no tamanho do tumor. As reduções no volume do tumor também foram significativas em Megace tratada, bem como Megace + fenretinida tratados (Figura 5B), em comparação com ratinhos tratados com veículo. Além disso, os ratos pareciam tolerar fenretinida e Megace tratamentos sem sintomas aparentes de toxicidade ou perda grave de peso corporal, em comparação com o grupo tratado com veículo (Figura S2).

(A) ratos CD-1 fêmea ovariectomizados nus foram injectados com células de Ishikawa em ambos os flancos e pellets de estrogénio foram implantados. Os tumores foram deixados crescer durante 2 semanas. Após 2 semanas de estabelecimento do tumor, os ratinhos foram tratados com veículo (20 ratinhos), Megace (19 ratinhos), fenretinida (21 ratinhos) ou Megace + fenretinida (20 ratos) e os tumores foram colhidos após 3 semanas de tratamento. (B) Imagens de tumores extirpados representativos de cada grupo. (C) A mudança vezes no volume do tumor (desde o dia 1 de tratamento de dia do sacrifício) de veículo, fenretinde, meagce ou ambos fenretinida + ratinhos tratados foi representada graficamente Megace após 3 semanas de tratamento. Os dados são apresentados como médias ± min no máximo de duas experiências diferentes. Os valores de p indicam uma inibição significativa por fenretinida, Megace ou Megace + fenretinida tanto no crescimento do tumor (* P 0,05). A maior diminuição do tamanho do tumor foi observada nos ratinhos tratados apenas com fenretinida.

O tratamento com fenretinida diminui a proliferação e aumenta a apoptose em tumores ratos

O efeito de fenretinida na proliferação de células e a apoptose foi avaliada por imuno-histoquímica e H e a coloração de secções de tumor endometrial Ishikawa após 3 semanas de tratamento. (Fig.6). A proliferação das células, tal como medido pelos níveis de proteína Ki67, diminuiu com o tratamento com fenretinida. Os níveis de caspase-3 (um marcador de apoptose), eram negligenciáveis ​​nos tumores dos ratinhos tratados com veículo, enquanto que mais de coloração era evidente nos tumores dos ratinhos tratados fenretinida. Tomados em conjunto, estes dados indicam que o desenvolvimento do tumor foi suprimido por Ishikawa fenretinida através da sua capacidade para inibir a proliferação de células e aumento da apoptose de células de Ishikawa tanto

In-vitro

in-vivo

.

tumores extraídos foram fixados em formalina, embebidos em parafina e seccionadas. (A) H E coloração e coloração imuno-histoquímica com o anticorpo anti-Ki67 (marcador de proliferação) e caspase 3 (marcador de apoptose) de secções inteiras de xenoenxertos de tumor anti-clivada. (B) As imagens estão a 100

μ

m.

Discussão

Fenretinide já foi demonstrado ser uma alternativa terapêutica e quimiopreventivo eficaz na mama e ovário cancros [17]. O presente estudo demonstra a utilização de fenretinide como um possível agente anti-tumoral contra o câncer endometrial usando tanto

in-vitro

e

in vivo estudos

. Fenretinida diminuiu a viabilidade celular do cancro endometrial humano de Ishikawa através da indução de apoptose, como demonstrado por um aumento em marcadores de morte celular (caspase-9 clivada e PARP). Ele também inibiu o crescimento do tumor

in vivo

, como visto por uma diminuição na proliferação celular (Ki67) e um aumento da apoptose (caspase-3), em xenoenxertos de tumor ratinhos. Além disso, mostrámos que os efeitos antitumorais de fenretinida são mediados por um aumento na absorção de retinol, com um aumento da expressão de Stra6 observado nas células tratadas fenretinida.

Recentemente, estudos por Carrera et ai demonstraram o papel de Stra6 em respostas de morte celular p53 mediada em células normais e cancerosas, que é semelhante aos nossos resultados de pesquisa e considerou ser independente da activação a jusante de metas RA [38]. Demonstraram que a transfecção com Stra6 induzida uma quantidade significativa de apoptose em células cancerosas de ovário sensíveis RA (especificamente PA-1 e A1847), bem como em HCT116 insensível células cancerígenas do cólon RA. Além disso, os autores descobriram que Stra6 transfecção induzida tanto uma supressiva pró-apoptótica e tumor afeta. Estas descobertas, juntamente com os resultados de nosso estudo sugerem que a indução Stra6 pode ter um potencial papel na supressão do tumor.

literatura anterior sugere uma interação no sucesso do tratamento de células cancerosas com drogas quimioterápicas e seu potencial para desencadear vias apoptóticas. Ainda não é claro se os efeitos biológicos de agentes quimioterapêuticos são mediados por uma interacção directa com os receptores de retinóides nucleares ou através de vias independente dos receptores nucleares novos [39]. Nós descobrimos que o tratamento de células de Ishikawa com fenretinida resultou na apoptose celular através da indução de caspase-9, caspase -3 e PARP. A indução destas vias apoptóticas também foi observado no cancro da mama [17] e do ovário [40]. Curiosamente, um teste de prevenção do cancro da mama fase III em mulheres na menopausa demonstrou que o tratamento com fenretinide diminuiu a incidência de neoplasias malignas de mama segundo e cancros do ovário [41].

Em contraste com o nosso presente estudo, outros estudos têm demonstrado que análogos RA também pode atuar pela ativação de receptores nucleares. Especificamente, a proliferação de células de Ishikawa foi diminuído e apoptose foi induzida através de sinalização RA envolvendo activação RAR /RXR [8].

As progestinas têm sido muito utilizados em mulheres em idade reprodutiva que querem preservar sua fertilidade, bem como em avançado e casos de cancro do endométrio recorrentes que não podem ser tratados com agentes anti-cancerígenos, no entanto, 30% ou mais doentes com cancro do endométrio resistência à exposição às terapias hormonais, limitando o uso de terapia de progestina [42]. No presente estudo, Megace sozinho não induziu apoptose em nosso modelo de cancro do endométrio, nem potenciar a actividade anti-tumoral de fenretinide

in-vitro

ou

in-vivo

.

as limitações do presente estudo são o uso de um único modelo do rato e do uso de células endometriais Ishikawa cultivadas em vez de células de cancro do endométrio primários. Usando a cultura primária é difícil devido à incapacidade para crescer células de cancro primário do estroma sem factores. Mais estudos são necessários para estabelecer a capacidade antitumoral do fenretinide em diferentes linhas celulares de cancro do endométrio e modelos de mouse tumor.

Em conclusão, demonstramos que fenretinide diminui a viabilidade celular, aumenta a apoptose, e provoca uma redução no tamanho do tumor. Acreditamos que a apoptose induzida por fenretinida por causa de um aumento na absorção de retinol, especialmente por aumento da expressão do gene de Stra6. Acreditamos que este estudo é um dos primeiros a demonstrar que fenretinide tem um potencial anti-tumoral contra o cancro endometrial. Acreditamos que os futuros ensaios pré-clínicos e clínicos são necessários para validar o seu potencial como um novo candidato terapêutico possível para o tratamento de câncer endometrial.

Informações de Apoio

Figura S1.

O tratamento de células de Ishikawa com fenretinida na 0,25-10

μ M

concentrações durante 24 horas, não alterou a expressão de genes de receptores nucleares do ácido retinóico. Os dados são representativos de médias ± erro padrão de três experiências diferentes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0110410.s001

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Figura S2.

tratamentos tanto com fenretinide ou Megace não têm efeito sobre o peso corporal do rato. Os pesos corporais foram medidos a partir do veículo tratada ou grupos de drogas tratados de ratos duas vezes por semana durante todo o rime experimento

doi:. 10.1371 /journal.pone.0110410.s002

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