Abstract

Fundo

câncer de pulmão de células não pequenas (NSCLC) é um heterogêneo grupo de doenças com uma série de alterações genéticas e proteômica. c-CBL é uma ubiquitina ligase e o adaptador molécula E3 importante na homeostase normal e câncer. Foram determinadas as variações genéticas de c-

CBL

, relação com receptores tirosina-quinase (EGFR e MET), e funcionalidade em NSCLC.

métodos e resultados

Usando formalina de arquivo parafina -Fixed incorporado (FFPE) extraído ADN genómico, mostra-se que mutações de c-CBL ocorrer de forma somática de cancros do pulmão. mutações c-CBL não eram mutuamente exclusivas de mutações Met ou EGFR; no entanto, eles foram independentes da p53 e KRAS mutações. Na análise normal de pares /tumor, houve perda significativa da heterozigosidade (LOH) para o c-

CBL

lugar (22%, n = 8/37) e nenhuma destas amostras revelaram qualquer mutação na cópia remanescente de c-CBL. O c-

CBL

LOH também se correlacionou positivamente com o EGFR e mutações MET observado nas mesmas amostras. Usando selecione mutações somáticas c-CBL, como S80N /H94Y, Q249E e W802 * (obtido a partir Caucasiano, amostras de Taiwan e Africano-americanos, respectivamente) transfectado em linhas celulares de NSCLC, houve aumento da viabilidade celular e motilidade celular.

Conclusões

Tomando a taxa de mutação de c-global CBL ser uma combinação de mutação somática e missense LOH, é evidente que o C-CBL é altamente mutados nos cancros do pulmão e pode desempenhar um papel essencial no pulmão tumorigênese e metástase

Citation:. Tan Y-HC, Krishnaswamy S, Nandi S, Kanteti R, Vora S, Onel K, et al. (2010) CBL é alterada frequentes em cancros do pulmão: sua relação com mutações no MET e EGFR tirosina quinases. PLoS ONE 5 (1): e8972. doi: 10.1371 /journal.pone.0008972

editor: Joseph Najbauer, City of Hope National Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 28 de outubro de 2009; Aceito: 09 de janeiro de 2010; Publicação: 29 de janeiro de 2010

Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da declaração Creative Commons Public Domain que estipula que, uma vez colocado no domínio público, este trabalho pode ser livremente reproduzido, distribuído, transmitido, modificado, construído em cima, ou de outra maneira usado por qualquer pessoa para qualquer finalidade lícita

Financiamento:. financiado pelo National Institutes of Health (NIH) /National Cancer Institute (NCI) subvenções: 5RO1CA125541-03, 3RO1CA125541-03S109 , 5RO1CA129501-02, 3RO1CA129501-02S109, 1R21CA140003-01, MARF, V-Foundation, Cancer Research Foundation e americanos Respiratory Health Association of America (RS) e concede NSC96-2628-B-006-048-MY3 do Conselho Nacional de Ciência , Taiwan. Esta pesquisa foi apoiada pelo Programa de Investigação Intramural do NIH, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer. Os agenices financiamento não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

introdução

Em os EUA sozinhos, a cada ano cerca de 219,400 pessoas são diagnosticadas com câncer de pulmão, dos quais mais de 145.000 deles sucumbem à doença [1]. Este número é aproximadamente equivalente às taxas de mortalidade combinada de cancros da mama, da próstata, do cólon, do fígado, do rim e melanoma [1]. Além disso, o prognóstico é geralmente pobre e a taxa de sobrevivência de cinco anos é inferior a 15%. Há também diferenças étnicas significativas para o cancro do pulmão, e o resultado é pior para os negros em relação aos brancos. As diferenças de gênero também são impressionantes com as mulheres que têm significativamente melhor prognóstico em relação aos homens. Há uma série de alterações genéticas que podem ocorrer no cancro do pulmão. Como um exemplo, no NSCLC, mutações no KRAS, p53, EGFR e MET foram identificados. Muitas dessas vias, especialmente Receptor tirosina quinases (RTKs) são controlados por c-CBL.

CBL

(Casitas B-linhagem linfoma) é um gene de mamífero localizado no cromossoma humano 11q23.3 [2] e está envolvido na sinalização celular e ubiquitinação de proteínas [3]. proteínas CBL pertencem à classe dedo anelar da ligases de ubiquitina (E3) e há três homólogos

c-CBL

,

CBL-b

,

CBL-3

[4 ]. O

c-CBL

e

genes CBL-B são ubiquamente expressa com os níveis mais altos em tecidos hematopoiéticos [5].

c

-CBL consiste em quatro regiões que codificam para domínios de proteína funcionalmente distintas: a ligação de tirosina quinase N-terminal de domínio (TKB), a região ligante, o domínio dedo anelar catalítica, a região rica em prolina e do c (UBA) -terminal de domínio associado a ubiquitina que também se sobrepõe com um domínio leucina-zipper (LZ) [3]. Ambos os domínios TKB dedo anelar e são essenciais para a ubiquitinação induzida pelo ligando de RTKs [6], [7], [8], [9]. O domínio dedo anelar é necessário para o recrutamento de E2 enzimas conjugação de ubiquitina. O domínio TKB inclui feixe de quatro hélices (4H), uma mão EF-biding de cálcio, e um domínio SH2 modificado, que se liga aos resíduos de fosfotirosina [3], [10], [11], [12]. Além disso, a região rica em prolina de c-CBL pode associar-se com o domínio SH3 de Grb2, o que pode indirectamente recrutar C-CBL para RTKs através da proteína adaptadora GRB2 [7], [13], [14].

c-CBL também se liga ao EGFR e atua como o E3 que tem como alvo EGFR para ubiquitinação e degradação. Além disso, a CBL dessensibiliza de sinalização de EGF e opõe-se a proliferação celular induzida por EGF [15]. activação EGF também parece activar a tirosina-quinase SRC, que fosforila C-CBL e por sua vez activa a ubiquitinação e degradação do EGFR [16], [17], [18]. Um estudo recente mostra que a endocitose defeituoso de EGFR é caracterizado por um mutante de deleção e o L858R ponto de mutação, pelo que a sua associação com c-CBL e ubiquitinação subsequente são prejudicados [19]. Recentemente, as primeiras mutações de c-CBL humanos foram relatados em pacientes com leucemia mielóide aguda (LMA) [20]. A R420Q mutação inibe tipo fms da tirosina-cinase 3 (FLT3) internalização e ubiquitinação [20].

Não só pode actividade E3 ser importante na oncogénese, C-CBL tem uma função dupla, mas separada, tal como uma molécula de transdução de sinal . Nós mostramos anteriormente que o C-CBL é importante na ligação CRKL e BCR /ABL em células hematopoiéticas. Além disso, pode ligar-se e modulam as funções de citoesqueleto por ligação a proteínas como a talina e a paxilina. O domínio TKB é importante na ligação a uma série de moléculas, e, em seguida, eles funcionam na transdução de sinal.

Dado o papel crucial na homeostase da CBL normal e cancro, a hipótese de que ele pode ser mutado em cancros do pulmão. Neste estudo, relatamos c-CBL mutações somáticas novos S80N /H94Y, Q249E e W802 * em caucasianos, os doentes com cancro do pulmão de Taiwan e afro-americanos, respectivamente. Expressando estas mutações em linhas celulares de NSCLC levar a um aumento da proliferação celular e a motilidade. Mostramos que as mutações c-CBL ocorrer com ou sem TEM ou mutações EGFR, mas são mutuamente exclusivos de um LOH no c-

CBL

lócus. Além disso, c-

CBL

LOH está associada a mutações EGFR TEM ou. Nós, portanto, a hipótese de que mutações c-CBL pode contribuir para o potencial oncogénico do TEM e do EGFR no cancro do pulmão.

Métodos

Declaração de Ética

O consentimento por escrito em todas as pesquisas sobre humana indivíduos foi obtido a partir do Institutional Review Board, Universidade de Chicago e abrange todas as pesquisas realizadas em laboratório. O que se segue é a sua informação de contato: Institutional Review Board, The University of Chicago, McGiffert Hall, 5751 S. Woodlawn Ave., 2º andar, Chicago, IL 60637. consentimentos informados por escrito foram recebidas de todos os pacientes cujas amostras de tecido foram usados ​​para este estudo .

Amostras de tecido

tecido canceroso

pulmão e tecidos pulmonares normais adjacentes emparelhados foram obtidos a partir de 50 caucasianos, 29 afro-americanos e 40 pacientes de Taiwan com NSCLC que foram recrutados na Universidade de Chicago Hospital (Chicago , EUA) (caucasianos e pacientes afro-americano) e Taipei Veterans general Hospital de Taiwan (Taiwan pacientes), após a obtenção de autorização Institutional Review Board adequado e consentimento informado dos pacientes. Fora de 119 amostras, 77 eram homens, 38 eram mulheres e quatro eram desconhecidos com a idade no momento do diagnóstico variando de 47 a 90 anos. Em termos de tipos de tumores, 53 eram adenocarcinoma, 32 eram carcinoma de células escamosas e 34 eram carcinoma de grandes células. 49 foram a fase I, 14 eram estádio II, 34 eram estádio III, e 13 foram estádio IV (Tabela S1).

Cultura de Células

Humano pulmão de não pequenas células de carcinoma de células A549 e H358 foram mantidas em DMEM e meio RPMI-1640, respectivamente. células 293T de rim embrionário humano foram cultivadas em DMEM. Os meios foram suplementados com 10% de soro fetal bovino, 100 unidades /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). As células foram cultivadas a 37 ° C numa incubadora humidificada contendo 5% de CO

2.

C-

CBL

Gene análise mutacional

Os exões 2-16 de c –

gene CBL

foram amplificados individualmente por reação em cadeia da polimerase (PCR). Os iniciadores estão listados na Tabela S2. As condições de PCR foram de 1 ciclo de 95 ° C durante 5 minutos; 35 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos, 58 ° C durante 30 segundos e 72 ° C durante 2 minutos; e um ciclo de 72 ° C durante 10 minutos. Os produtos da PCR foram tratados com ExoSAP-IT (Corporação USB, Cleveland, OH) e sequenciados pelo Big-Dye Terminator Química (Applied Biosystems, Foster City, CA). A sequenciação foi realizada na cadeia de codificação para a frente com a confirmação de

C-CBL

alterações realizadas por sequenciação da cadeia inversa bem. Cromatogramas foram analisados ​​para mutações usando Mutation Surveyor v2.61 (Softgenetics, State College, PA).

plasmídeo Constrói e Site-Directed Mutagênese

A de tipo selvagem c-

CBL

inserto de cDNA foi subclonado no vector de expressão utilizando pAlterMax

Xho I e

Sal

locais de enzimas de restrição I (Promega, Madison, WI). Usando este plasmídeo parental pAlterMax-c-

CBL

, o domínio TKB mutação dupla (S80N /H94Y), a mutação pontual (Q249E), eo C-terminal de ponto de mutação W802 * de c-

CBL

foram criados utilizando os seguintes iniciadores: 5′-GCTGGCGCTAAAGAATAACCCACCTTATATCTTAGAC-3 ‘e 5′-CTACCAGATACCTACCAGTATCTCCGTACTATCTTGTC-3′ para a mutação dupla S80N /H94Y; 5’-CTTTACCCGACTCTTTGAGCCCTGGTCCTCTTTGC-3 ‘para Q249E, e 5′-CAGCTCCTCCTTTGGCTGATTGTCTCTGGATGGTGATC-3’ para W802 * juntamente com os seus iniciadores complementares utilizando o kit QuickChange Site-Directed Mutagenesis XL (Stratagene, La Jolla, CA) de acordo com as instruções do fabricante. As construções foram confirmadas pelas mutações pontuais por sequenciamento de DNA padrão de ambas as vertentes.

perda de heterozigosidade (LOH) Análise

Cinco microssatélites no cromossomo 11 (3 em 11q em ou a menos de 200 kb para cima ou a jusante do C-

foram seleccionados CBL

gene e os marcadores de controlo 2 em 11p) para análise (Tabela S3). marcadores microssatélites estabelecidos e respectivas sequências de primers foram selecionados do banco de dados GeneLoc (https://genecards.weizmann.ac.il/geneloc/index.shtml, Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). Os iniciadores foram personalizados e cada iniciador directo foi marcado por fluorescência na extremidade 5 ‘com FAM, PET, NED, ou VIC (Applied Biosystems). temperaturas de emparelhamento de iniciadores e pontuações duplex foram avaliados com NIST Ferramentas Primer (https://yellow.nist.gov:8444/dnaAnalysis/primerToolsPage.do; Instituto Nacional de Padrões e Tecnologia, Gaithersburg, MD). Os iniciadores foram verificadas através da realização de PCR com ADN de controlo (isolado a partir de células TK6) e a resolução dos produtos em géis de agarose. As bandas foram visualizadas com um transiluminador UV. O ADN genómico foi extraído de amostras de tumor e tecido pulmonar normal emparelhado. Os iniciadores foram agrupados em multiplex combinações mostradas na Tabela S4. Marcador D11S929 serviu como um controlo interno para verificar a consistência em PCRs e de picos de eletroforese capilar. Multiplex PCR foram realizadas num volume de 10 uL que continha 1 ul de DNA genómico (20-50 ng), 0,5 uM de cada iniciador (1,0 uM total para cada par de iniciadores), 400 uM de dNTP, 1x tampão de PCR contendo MgCl

2, e 0,2 L

Taq DNA polimerase

. O PCR foi realizado no Sistema de PCR GeneAmp 9700 da ABI sob as seguintes condições: 5 minutos a 94 ° C; 30 ciclos de 30 seg a 94 ° C, 1 min a 60 ° C, 1 min a 72 ° C; e 5 min a 72 ° C. Os produtos de PCR foram separados por electroforese capilar num analisador de ADN ABI 3130XL. Cromatogramas foram analisados ​​com Scanner Peak 1.0 e 3.7 GeneMapper software (Applied Biosystems) para alterações alélicas. A área dos picos produzidos pelos produtos de PCR de ADN foi quantificado para cada alelo. A relação entre as áreas alélicas foi calculada para cada tumor e amostra de DNA emparelhado normal. Quando o qLOH (razão alélicas para os picos tumorais dividida pela razão alélica da amostra normal emparelhado) foi ≤0.5 ou ≥2.0 para C-

CBL

e pelo menos um outro marcador de 11q em pelo menos duas experiências separadas, a amostra foi considerada como tendo um desequilíbrio alélica e interpretada como LOH. As amostras foram avaliadas em pelo menos duas experiências separadas e amostras mostrando LOH prospectivo em C-

CBL

repetido uma terceira vez, o que incluiu um novo marcador de controlo em

BAX

lócus (dados não mostrados) sobre cromossoma 19 para verificar a integridade da amostra de ADN.

a transfecção de c-

Cbl

Construções

a linha de células A549 foi transfectado utilizando o Fugene� HD (Roche, Nutley, NJ) reagente, de acordo com as instruções do fabricante. Oito ug de DNA plasmídeo, contendo ou não inserção (vector vazio), de tipo selvagem c-

CBL

, S80N /H94Y c-

CBL,

Q249E c-

CBL

ou W802 *

CBL

foi utilizado para transfecção numa placa de cultura de 6 poços. As células foram colhidas 48 h após a transfecção e analisados ​​para a expressão.

c-

CBL

Knockdown

c-

CBL

knockdown foi realizada utilizando transdução lentiviral usando MISSÃO partículas de transdução de lentivírus (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, 1 x 10

5 H358 células /poço foram semeadas em placas de 6 poços e infectados no dia seguinte com c-

CBL

lentiviral constrói shRNA. Para gerar linhas celulares de knockdown C-CBL estáveis, foram seleccionadas as células durante 2 dias com 1 ug /ml de puromicina. os níveis de C-CBL foram determinados utilizando lisados ​​de células inteiras por imunotransferência com anti-anticorpo CBL (Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, CA).

Ensaio de viabilidade celular

As células foram transfectadas tal como descrito acima em do ensaio de transfecção. Quarenta e oito horas após a transfecção, a viabilidade das células foi avaliada através de exclusão com Trypan Blue.

Cura Ensaio

células A549 da ferida foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas durante 48 h, até 100% confluentes . O meio foi então mudado e as células foram transfectadas como descrito no ensaio de transfecção. Doze horas após a transfecção, um arranhão reto foi feita através da camada de células utilizando uma pipeta de 1 ml de ponta. As células foram então suavemente lavadas com 1 x PBS para remover os restos celulares e o meio foi substituído. As fotografias foram tiradas da zona da ferida a cada 12 h até 48 h.

Análise Western Blot

Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram recolhidas e lavadas duas vezes em 1X PBS, depois lisadas em gelo tampão de lise frio (0,5 M de Tris-HCl com pH 7,4, 1,5 M de NaCl, 2,5% de ácido desoxicólico, EDTA 10 mM, 10% de NP-40, DTT 0,5 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 1 mM, 5 ug /ml de leupeptina, e 10 ug /ml de aprotinina) durante 5 minutos. O lisado foi centrifugado a 13000 rpm durante 20 minutos a 4 ° C, e o conteúdo de proteína do sobrenadante foi medido. Os lisados ​​celulares totais (50 ug /poço) foram separadas por electroforese em SDS-PAGE e os geles transferido para membranas de nitrocelulose (Whatman, Piscataway, NJ). As membranas foram bloqueadas com leite em pó a 5% não gordo em solução salina tamponada com fosfato contendo Tween-20 (PBST) (PBS 1X, 0,1% de Tween-20) durante 1 h à temperatura ambiente e incubadas com o anticorpo primário adequado, a 4 ° C durante a noite. As membranas foram então lavadas três vezes com PBST e sondaram-se com peroxidase de rábano apropriado (HRP) -conjugated anticorpo secundário durante 1 h à temperatura ambiente. As membranas foram novamente lavadas três vezes em PBST e as bandas foram visualizadas usando reagente de quimioluminescência Ocidental blot (BioRad, Valência, CA) num sistema de documentação de gel Chemidoc (BioRad, Valência, CA). Os anticorpos foram obtidos a partir de Santa Cruz Biotechnologies e utilizados nas seguintes diluições (c-CBL, 1:5000; c-MET, 1:5000; EGFR, 1:5000; ubiquitina, 1:1000; HA, 1:5000 e p- actina, 1:10,000).

Citometria de fluxo

análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo. Aproximadamente 2 x 10

6 células foram cultivadas em meio contendo 10% de FBS. As células foram recolhidas por tratamento com tripsina /EDTA, lavadas com PBS 1X três vezes e fixadas com gelo frio de 70% de etanol durante 2 h. As células foram novamente lavadas com PBS frio e coradas com uma solução que contém iodeto de propídio /ml 25 ug, 200 ug /ml de RNase A, e 0,1% de Triton X-100 durante 30 minutos no escuro. análise do ciclo celular foi realizada utilizando um fluxo de goiaba APC-96 (citómetro goiaba Technologies, Millipore, Billerica, MA).

A ubiquitina ligase Actividade

células 293T foram mantidas em cultura em DMEM suplementado com 10 % de FBS e 1% de penicilina (100 unidades /ml) e estreptomicina (100 ug /mL) foram transfectadas com 0,2 ug de EGFR-pcDNA3 e 2 ug marcada com HA C-

CBL

constrói como indicado usando fosfato de cálcio de acordo o protocolo do fabricante (Profecção, Promega, Madison, WI). Vinte e quatro horas após a transfecção, as células foram jejuadas durante a noite em DMEM suplementado com FBS a 0,5%, e, em seguida, tratadas com ou sem EGF (100 ng /ml) durante 15 min. As células foram recolhidas e lavadas duas vezes em ortovanadato de sódio 0,2 mM de PBS gelado contendo então lisadas em tampão de lise gelado (Tris 10 HCl mM, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 1% Triton X-100, 10% glicerol, ortovanadato de sódio 2 mM e inibidores de protease). Os lisados ​​foram limpos de detritos por centrifugação a 16.000 g durante 10 min a 4 ° C. imunoprecipitações EGFR foram realizados em 200 pg de ligado clarificado utilizando 250 ng de coelho-anti-EGFR e Proteína A Sepharose G Plus /durante a noite a 4 ° C. As precipitações foram lavadas 5 vezes em tampão de lise antes da fervura em tampão de Laemmli. Eluições foram coradas imunologicamente com anti-ubiquitina e EGFR. Vinte microgramas de ligado clarificado foram imunologicamente para cada um dos c-

CBL

construções usando anti-HA.

Análise Estatística

As taxas de mutação entre os diferentes grupos foram comparados utilizando exato de Fisher teste. Para as variáveis ​​contínuas, comparações entre os grupos foram realizadas usando análise de variância (ANOVA) seguido pelo ajuste do Sidak para comparações múltiplas. Experimentos envolvendo medições repetidas ao longo do tempo foram analisados ​​utilizando ANOVA com o ajuste Greenhouse-Geisser para os graus de liberdade. As análises foram realizadas utilizando o software STATA (v10.1) (Stata Corporation, College Station, TX).

Resultados

c-

CBL

Gene As mutações no cancro do pulmão

Para investigar o papel do c-

CBL

no cancro do pulmão, analisamos seu DNA genômico no tumor e amostras normais emparelhados retirados de várias etnias. As amostras de tumor de pulmão representada caucasianos (n = 50), os afro-americanos (n = 29) e Taiwan (n = 40) pacientes com câncer de pulmão. Concebemos 12 pares de iniciadores para sequenciar a região de codificação de C-

gene CBL

que abrange os exões de 2 a 16 (Tabela S2). Foram identificadas 8 mutações somáticas únicos em c-

exons CBL

entre 8 pacientes diferentes. Uma variação L620F, uma conhecida SNP (rs2227988) no exão 11 foi também detectada. Mais importante, os oito novas mutações não sinónimas foram confirmadas por sequenciação de ambas as cadeias C-

ADN genómico CBL

obtido a partir de amostras de tumores do pulmão (Tabela 1). Além disso, nenhum dos 8 mutações foram detectadas em tecido normal correspondente, indicando que estes eram mutações somáticas. Quatro variações de nucleotídeo único sinônimas (SNVS) também foram identificados, mas não foram usados ​​ainda neste estudo.

Três dos 8 mutações não sinónimas novos foram localizados no TKB (ligação de tirosina quinase) domínio ( S80N, H94Y, e Q249E), um no domínio dedo anelar (V391I), uma na região rica em prolina (72515_72517 do ATG), e três na região C-terminal (W802 *, R830K, e A848T) do C CBL-proteína (Figura 1A e Figura S1). Na Figura 1B, que mostram cromatogramas modelo de amostras representativas.

(A) Representação esquemática dos vários mutantes de c-CBL no que diz respeito aos diferentes domínios funcionais. Três mutações: S80N, H94Y, Q249E foram localizados no domínio TKB; V391I foi localizado no domínio dedo anelar; 72515_72517 do ATG (uma deleção não frameshift) e L620F (um conhecido SNP, rs2227988) foram localizados na pro-região rica e W802 *, R830K, e A848T foram encontrados na região C-terminal de c-CBL. Os números apresentados representam as posições de aminoácidos. Associação de mutações de c-CBL entre diferentes populações étnicas é mostrada na tabela (∧ conhecido SNP). (B) Os exemplos representativos de cromatogramas de sequenciação da região de mutação em indivíduos normais (N) e de tumor (T) amostras. As setas indicam a mutação heterozigótica na amostra tumoral. (C) Perda de análise Heterozigosidade (LOH) de 37 tumores e amostras normais pareados de pacientes de Taiwan. Um valor de 0,5 indica um LOH no c-

CBL

lócus. (D) Esquema do cromossoma 11 marcadores escolhidos para análise de LOH e exemplos representativos de análise cromatograma LOH. Após a amplificação usando cromossomo 11 primers microssatélites específicos, o produto de PCR foi separado por eletroforese capilar e bandas foram quantificados de acordo com a intensidade.

11q LOH de c-

CBL

Gene

tumor de pulmão pareado e as amostras normais de tecido pulmonar de pacientes de Taiwan (n = 37) foram investigados para LOH. Oito (21,6%) apresentaram LOH no c-

CBL

locus no cromossomo 11 e 29 amostras (78,4%) revelaram contribuição alélica normal nas marcadores microssatélites (Figuras 1C e D).

c-CBL mutações em diferentes grupos étnicos

o c-CBL mutante duplo S80N /H94Y foi encontrado no mesmo paciente e a taxa de mutação geral para c-CBL em tumores de pulmão foi de 6,7% (8/119). A frequência de mutação c-CBL foi maior no carcinoma de grandes células (14,7%; 5 de 34 pacientes), seguido pelo carcinoma espinocelular (6,3%; 2 de 32 pacientes) e o mínimo foi observada em adenocarcinoma (AD) (1,8%; 1 de 53 pacientes), embora estas taxas não foram estatisticamente significantes (p = 0,292). taxas de mutação foram 6,0% entre os caucasianos (0 de 20 em AD; 0 de 10 em SQ e 3 de 20 em LC), 13,8% em afro-americanos (1 de 10 em AD; 1 de 10 em SQ; e 2 do 9 em LC) e 2,5% (0 de 23 em AD; 1 de 12 em SQ; e 0 de 5 em LC) na população de Taiwan. Além disso dois pacientes de Taiwan com cancro do pulmão (um escamoso e um adenocarcinoma) tiveram o conhecido SNP L620F. As diferenças étnicas não foram estatisticamente significativas, no entanto, o poder de detectar diferenças foi baixa.

Mutações no

TEM

e

EGFR Como pode ser co-Associated com c-CBL Alterações

uma vez que os asiáticos do leste com cancro do pulmão têm uma maior frequência de

EGFR

e

MET

mutações em tumores de pulmão [21], [22] mutações, nós também determinada em

EGFR

e

TEM

nas mesmas amostras de coorte de Taiwan e compararam os resultados com os observados c-

CBL

alterações (LOH e /ou mutações). Nas 37 amostras testadas, não havia nenhuma sobreposição entre c-

CBL

mutações e c-

CBL

LOH (Figura 2). Dos três mutantes de c-CBL (incluindo o conhecido L620F SNP, rs2227988), uma das amostras tinham uma mutação MET (N375S) e o outro tinha uma mutação do EGFR (L858R). Entre as 8 amostras que tinham um LOH no c-

CBL

locus de 5 tinha uma mutação adicional no MET (N375S) e 2 tiveram um

EGFR

exão 19 eliminação. Vinte e seis amostras não tinham nem c-

CBL

mutação nem c-

CBL

LOH (3 pacientes tiveram uma c-

CBL

mutação, mas não c-

CBL

LOH). Entre estas 26 amostras 9 tinha uma mutação MET (8 N375S, 1 L211W), 13 tinham um

EGFR

mutação (7 exon 9 exclusão, 6 L858R) e 4 não tinha outra mutação TEM ou EGFR. Assim, a taxa de mutações Met ou EGFR entre os pacientes com LOH no c-

CBL

loco (7 de 8) foi semelhante ao observado em pacientes sem c-

mutação ou LOH CBL ( 22 de 26 pacientes) (p = 0,99). Esses 4 pacientes sem mutação identificada na c-

CBL

,

TEM

ou

EGFR

representou 10,8% dos 37 pacientes analisados ​​na coorte de Taiwan paciente. Por outro lado, 89,2% dos pacientes com cancro do pulmão de Taiwan têm uma mutação identificável em qualquer c-

CBL

,

TEM

ou

EGFR

ou uma combinação dos três genes (Figura 2) . Além disso, determinou-se

p53 Comprar e

KRAS

mutações nestes coortes de Taiwan. Dois

p53 Comprar e 1

KRAS

mutação foram detectados. O single

KRAS

mutação sobreposto com um

p53

mutação. Este paciente também teve a

EGFR

exão 19 exclusão, mas não tinha c-

CBL

mutação. O outro

Exemplo de p53

mutação tinha uma c-

CBL

LOH com a mutação N375S MET concorrente. Assim, nas amostras de Taiwan analisados,

p53 /KRAS

mutações e c-

CBL

mutações eram mutuamente exclusivas (dados não mostrados).

37 amostras de Taiwan foram analisadas para mutações no c-

CBL

,

TEM

e

EGFR

e para a análise de LOH no c-

CBL

lócus. Os dados mostram 21,6% (8/37) tiveram LOH, enquanto que 8% (3/37) tinham uma mutação c-CBL (incluindo o conhecido SNP L620F), estas amostras eram mutuamente exclusivas. Além disso, 5 de 8 amostras LOH também conheceu mutação N375S e 2 tiveram

EGFR

exão 19 eliminação. Nas amostras com c-

CBL

mutação, uma mutação N375S também conheceu enquanto outro tinha mutação EGFR L858R. Em amostras que não abrigam qualquer c-

CBL

mutação (70%, 26/37), 22 tiveram tanto um

TEM

ou um

EGFR

mutação e apenas 4 não têm uma mutação em qualquer um desses 3 genes.

funções celulares de c-

CBL

Alterações no Contexto da Lung Tumorigênese

a. actividade E3 está intacta nas proteínas c-CBL mutantes.

Para investigar se as diferentes mutações de c-CBL afectar a actividade E3, o EGFR foi escolhido como um substrato modelo para a função C-CBL E3. Todos os mutantes de c-CBL testados ubiquitinação do EGFR activado semelhante à proteína c-CBL-tipo selvagem melhorada. Este resultado demonstra que a actividade catalítica dos mutantes de c-CBL não é diminuída quando o EGFR foi o substrato. (Figura 3A).

(A) C-CBL mutantes não alteram a ubiquitinação do EGFR. As células foram co-transfectadas com o EGFR e diferentes mutantes de c-CBL foram estimuladas com EGF, imunoprecipitados com anticorpo anti-EGFR e colocados a hibridar com anticorpo anti-ubiquitina. Immunoblot com o anticorpo anti-EGFR serviu como o controlo de IP, enquanto o blot anti-HA foi utilizado como o controlo de entrada. viabilidade (B) celular foi medida pela exclusão do azul de Tripano e comparado com o controlo de vector vazio. C-CBL de tipo selvagem (WT) e mutantes S80N /H94Y, Q249E, e W802 * mostrou 66,7%, 132,3%, 120,8% e 147,9%, respectivamente, a viabilidade celular em células A549 48 h após a transfecção. Experimentos foram realizados em triplicata e os dados médios é mostrado. As barras de erro indicam o desvio padrão. os níveis de vários mutantes (C) a expressão da proteína foram analisadas por Western blot utilizando anticorpo C-CBL. análise (D) do ciclo celular de diferentes mutantes c-CBL 48 h após a transfecção em células A549.

B. Efeito sobre a viabilidade celular de cancro do pulmão.

Determinou-se o efeito de um mutante c-representativo CBL de cada uma das três origens étnicas na viabilidade de células de cancro do pulmão em linhas celulares. S80N /H94Y mutação dupla, Q249E e W802 * foram identificados em amostras de tumor de pulmão obtidos a partir de uma caucasiana, um taiwanês e um Africano-Americano, respectivamente. Tal como descrito nos métodos, o de tipo selvagem c-CBL (WT) e as acima três mutantes foram expressas após cloná-los em pAlterMax vector em células A549. Estas células expressam níveis relativamente baixos basais de c-CBL endógenos (dados não mostrados). A eficiência de transfecção foi comparável entre os diferentes grupos e o número de células transfectadas com c-

CBL

de tipo selvagem construção foi cerca de 70% em comparação com células de controlo que foram transfectadas com o vector vazio. As células transfectadas com S80N /H94Y, Q249E e W802 * c-CBL construções mutantes resultaram num aumento do número de células viáveis ​​que era 132,3%, 120,8% e 147,9% superior, respectivamente, em relação às células de controlo vector vazio transfectadas e significativamente diferente do seu meio natural -type construir (p = 0,022, p = 0,049 e p = 0,008, respectivamente) (Figura 3B). níveis relativos de proteína c-CBL em lisados ​​de células totais preparados a partir de amostras obtidas a partir de uma experiência paralela foi determinado. Os níveis de proteína c-CBL em amostras representativas de células vetor transfectadas untransfected e vazios foram comparáveis ​​e aqueles que representam o c-CBL WT e os mutantes três c-CBL foram comparáveis ​​(Figura 3C).

C. Efeito sobre o ciclo celular.

Para investigar se o aumento na viabilidade celular em diferentes mutantes de c-CBL são devidas a um aumento da proliferação celular, foi realizada uma análise do ciclo celular. As células A549 foram transfectadas com o C-CBL WT ou os três mutantes diferentes: S80N /H94Y, Q249E e W802 *. O transfectante vector vazio foi utilizado como um controlo. Quarenta e oito horas após a transfecção análise do ciclo celular foi realizada como descrito em materiais e métodos. Não houve alteração significativa no subG1, G1 ou fase S do ciclo celular entre os diferentes mutantes em comparação com a construção de WT (p = 0,64, p = 0,40 e p = 0,28, respectivamente). A fase G2 /M do ciclo celular mostraram um aumento no número de células para os três mutantes, S80N /H94Y, Q249E e W802 *, quando em comparação com o WT mas mais uma vez a diferença não foi estatisticamente significativa (p = 0,25) (Figura 3D ).

D. Efeito sobre a motilidade celular.

Para investigar o efeito da expressão dos três mutantes acima c-CBL sobre a migração celular, foi realizada ensaio de cicatrização da ferida tal como descrito em materiais e métodos. O fechamento do zero ou a ferida foi monitorizada nos tempos 0, 12, 24, 36, e 48 h. (Figura 4A). Em todas as amostras, que representam as células transfectadas com os mutantes, a abertura da ferida era muito menor do que o observado na amostra que representavam células transfectadas com c-CBL WT (p 0,001). Também determinamos a taxa de fechamento da ferida para todos os cinco grupos. Às 48 h, do tipo selvagem c-CBL transfectantes mostrou 61,1% ferida aberta enquanto os /H94Y, Q249E e W802 * mutantes S80N mostrou 18,7%, 23,9% e 34,3% ferida aberta, respectivamente (p 0,001). (Figura 4B)

(a) ensaio de cicatrização de feridas foi realizada em células A549 transfectadas com WT c-CBL ou diferentes mutantes. vector vazio (EV) foi utilizada como um controlo. imagens representativas (Brightfield e contraste de fase) de cada ponto de tempo são mostrados.