Abstract
In vitro modelos baseados em células
de câncer de pulmão são frequentemente empregados para estudar a invasão e os mecanismos por trás metástase. No entanto, esses modelos muitas vezes estudar apenas um tipo de célula com bidimensionais (2D) culturas de células em monocamada, que não refletem com precisão a complexidade da inflamação
in vivo
. Aqui, foi empregue um modelo de gel tridimensional (3D) de colagénio de co-cultura de células, que contém células humanas de adenocarcinoma de pulmão (HCC), as células de fibroblastos de pulmão humanos (MRC-5), e macrófagos. meios de cultura celular e as imagens das células foram recolhidos, e metaloproteinase de matriz-1 (MMP-1) e a produção do factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) foi monitorizado, sob diferentes condições de cultura celular. Descobrimos que simulam condições de hipoxia e /ou privação de soro induzida secreção elevada de VEGF no modelo de co-cultura 3D
in vitro
, mas não MMP-1; a morfologia de HCC no 2D versus o sistema de co-cultura 3D foi extremamente diferente. MMP-1 e VEGF foram segregadas em níveis mais elevados em grupos de células mistas em vez de grupos mono-cultura. Portanto, incorporando as células de câncer de pulmão, fibroblastos e macrófagos podem refletir melhor os mecanismos fisiológicos metástase em comparação com sistemas mono-cultura. As células do tumor do estroma, macrófagos e células de fibroblastos podem promover a invasão e metástase, que também fornece uma nova direção para a concepção de terapias orientadas para destruir o estroma dos tecidos tumorais
Citation:. Liu Xq, Kiefl R, Roskopf C, Tian F, Huber RM (2016) Interações entre as células do cancro do pulmão, fibroblastos e macrófagos em co-culturas em 3D eo Impacto na MMP-1 e VEGF Expressão. PLoS ONE 11 (5): e0156268. doi: 10.1371 /journal.pone.0156268
editor: Pankaj K. Singh, University of Nebraska Medical Center, United States |
Recebido: 27 de setembro de 2015; Aceito: 11 de maio de 2016; Publicado em: 27 de maio de 2016
Direitos de autor: © 2016 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel
financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Relatórios de neoplasias pulmonares remontam tão longe como a antiguidade, e por meados do século XX, o câncer de pulmão tornou-se epidemia e foi firmemente estabelecida como a principal causa de mortes relacionadas ao câncer na América do Norte e na Europa, na sequência a introdução de cigarros baratos, produzidos em massa [1]. Actualmente, o cancro do pulmão é o tipo mais comum de câncer em todo o mundo, sendo responsável por mais de 1,35 milhões de casos por ano [2]. Apesar dos avanços significativos no tratamento das fases iniciais da doença, as taxas de sobrevivência para estágios avançados de cancro do pulmão permanecem baixos; a maioria dos pacientes com câncer de pulmão estágio final morrem no prazo de 18 meses após o diagnóstico [3]. O acúmulo de evidências demonstra que enquanto a maioria dos pesquisadores de câncer se concentrar exclusivamente em células de câncer de pulmão, há um crescente reconhecimento de que o microambiente do tumor (TME) e as interações tumor-estroma desempenham papéis importantes durante o processo de estabelecimento do cancro do pulmão, invasão e metástase. O estroma do tumor composto por tanto da matriz extracelular (ECM) e componentes celulares. O ECM inclui proteoglicanos secretadas que desempenham ambas um papel estrutural e de sinalização celular. Os componentes celulares incluem células do sistema imunológico, f ibroblastos associados a cancro (FAC), células endoteliais, adipócitos, células derivadas da medula óssea, miofibroblastos, fibroblastos e [4]. estudos genômicos funcionais identificaram assinaturas genéticas que são prognóstico para o cancro do pulmão de não-pequenas de sobrevivência (NSCLC), incluindo genes que codificam proteínas ECM-[5], que destaca o papel do estroma no prognóstico do paciente e sobrevivência.
neste estudo, optou-se por investigar MMP-1 e VEGF como indicadores da interacção entre as células tumorais e estromais, porque ambos foram claramente ligada à invasão tumoral e metástase. Estudos anteriores demonstraram que as MMPs têm um papel saliente no cancro [6]. MMPs pode degradar várias proteínas associadas com a ECM. Como resultado, as células tumorais podem mover-se mais facilmente durante os processos de invasão e metástase. MMP-1 pertencente à família de MMP e é conhecida como colagenase ou gelatinase, que degrada o colagénio IV e é aumentada em células de cancro altamente metastáticas [7]. O VEGF foi identificado e isolado como um mitogénio específico de células endoteliais, que tem a capacidade de induzir a angiogénese fisiológica e patológica essencial para o estabelecimento de novos vasos sanguíneos [8, 9]. Em um tumor sólido, durante o processo de expansão, as partes centrais da hipóxico do tumor se tornar, que promove a produção de VEGF e, por conseguinte, a proliferação do tumor [10]. Além disso, estudos recentes demonstraram que as actividades induzida por VEGF em células tumorais incluem invasão tumoral e metástase [11].
A maioria dos grupos de pesquisa têm utilizado monocamadas de células cultivadas em plásticos de cultura de tecidos, que são menos complexo, menos adaptável, e não muito representativo do fisiológico extracelular microambiente presente nos seres humanos [12]. Quando as células são cultivadas sobre as superfícies de plástico rígidos de frascos de cultura, elas só podem crescer longe do plástico de uma maneira 2-dimensional (2D). Além disso, muitos estudos indicam que as culturas de células em 2D pode não reflectir adequadamente a complexidade fisiológica do tecido real, e a sua utilização em ensaios baseados em células em certa medida, pode resultar em erros na previsão de respostas específicas do tecido. As células cultivadas em formatos 2D sofrer proliferação e diferenciação-des então, consequentemente, perder as suas funções essenciais [13]. Em contraste, as células cultivadas numa matriz 3D são dramaticamente diferente em termos de proliferação, diferenciação, morfologia e funcionalidade celular [14, 15]. Neste estudo, foi estabelecido um modelo de co-cultura organotípica composto de células de adenocarcinoma de pulmão (HCC), fibroblastos de pulmão (MRC-5), e as células imunitárias (macrófagos), que não só permite a exploração das interacções entre as células tumorais e do estroma células, mas também representa um modelo que é mais reflexivo das condições atuais
in vivo
.
Materiais e Métodos
cultura celular
Todos os celulares linhas foram fornecidas pelo Laboratório V Clínica médica da Universidade Ludwig-Maximilians. células MRC-5 foram cultivadas em Meio Essencial Mínimo de Eagle (LGC Standards GmbH, Wesel, Alemanha). Para fazer com que o meio de crescimento completo, que adicionado soro fetal de bovino (FBS) numa concentração final de 10%. células de carcinoma hepatocelular foram cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de FBS (Biochrom AG, Berlim, Alemanha). Os macrófagos foram cultivadas em M-12 K forma de Ham (LGC Standards GmbH, Wesel, Alemanha) suplementado com 100 U /ml de penicilina, 100 mg /ml de solução de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina (PAA).
3D modelo de co-cultura em gel de colagénio
Antes da preparação do gel de colagénio, as células foram descongeladas e diluídas até 2 x 10
5 células por poço. A proporção de células foi estabelecida como se segue: 5: 5: 1 CHC: MRC-5: macrófagos. Para ensaios de Western blot, as células foram colocadas em 2 x 10
5 e 1 x 10
6 células por grupo. Para preparar os geles, colagénio (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha), estéril 10X tampão fosfato salino (PBS), a água destilada estéril (DDQ
2O), e NaOH 1 N estéril foram misturadas em gelo. O volume total de gel de colágeno foi calculada da seguinte forma:.
Em um tubo estéril misturar o dH
2O, 1N NaOH e 10X PBS
A concentração final de colagénio foi de 1 mg /ml, e 0,5 ml foi distribuído por cada prato de cultura de compartimento e imediatamente colocado em gelo. As células foram então semeadas no gel de colagénio, que foi pipetada várias vezes para misturar bem. Os géis foram removidos a temperatura ambiente onde solidificou rapidamente. As culturas foram então incubadas a 37 ° C num incubador humidif içado, durante 30-40 minutos, ou até que um gel firme foi formado. Cada compartimento prato, em seguida, recebeu um volume total de media 1,0 ml de cultura.
Western blot
sobrenadantes de cultura celular foram coletadas em 48 h. tubos Vivaspin (Sartorius Stedim Biotech GmbH, Goettingen, Alemanha) foram utilizadas para recolher as proteínas a partir do sobrenadante, que tinha um peso molecular superior a 30 kDa. As concentrações de proteína foram medidas com um estojo de não interferência ensaio de proteína (Calbiochem, EMD Bioscience Inc., Darmstadt, Alemanha), utilizando albumina de soro bovino (BSA) a curva padrão (Bio-Rad Laboratories, Munique, Alemanha) |
An-MMP-1 anti anticorpo produzido em ratos foi usado (Sigma-Aldrich St. Louis, EUA) com um anti-murganho secundário anticorpo IgG de cabra-HRP (Santa Cruz Biotechnology Inc., Heidelberg, Alemanha). 40 ug de proteína de cada amostra foi diluída com tampão de amostra, enquanto DDH
2O foi adicionado a um volume final de 35 ul. As membranas foram bloqueadas em tampão de bloqueio à temperatura ambiente durante pelo menos 1 h e depois incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. Os anticorpos primários foram diluídos 1: 200 em tampão de bloqueio. As membranas foram incubadas com diluída a 1: 5000 de anticorpos secundários conjugados com HRP durante 1 hora à temperatura ambiente, no dia seguinte. As imagens foram analisadas usando o leitor de imagem de software LAS-R (Leica Microsystems, Alemanha). IOD (valores de densidade óptica integrada) foram gerados /analisados com o software Gel-Pro Analyzer (Media Cybernetics EUA).
HCC e células de macrófagos
células foram lavadas duas vezes utilizando pré-aquecido (37 ° C) PBS para remover todo o meio de cultura celular residual. Em seguida, adicionaram-se 10 ml pré-aquecido (37 ° C) solução de trabalho CFDA SE celular Tracer (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha). As células foram então incubadas durante 15 minutos a 37 ° C. Em seguida, substituiu a solução de carga com meio fresco, pré-aquecido e incubou-se as culturas durante mais 30 minutos a 37 ° C. Esta técnica coradas HCC, células de macrófagos, e células MRC-5 no modelo de gel de colagénio 3D descrito anteriormente. Após 48 h de co-cultura, as morfologias celulares foram observadas por microscopia confocal.
As secções congeladas de géis de colágeno corados com falotoxina e DAPI
Foram preparadas secções congeladas após 48 h de gel de colágeno 3D co-cultura, e as amostras foram montadas em lamelas à temperatura ambiente durante 30 min. As amostras foram então lavadas três vezes com PBS durante 3 min de cada vez. As amostras foram então fixadas em formaldeído a 3,7% em PBS durante 10 minutos à temperatura ambiente. As amostras foram então lavadas três vezes com PBS. Cada lamela foi em seguida colocada numa placa de petri de vidro e extraiu-se com uma solução de 0,1% de Triton X-100 em PBS durante 3 a 5 minutos e lavou-se novamente três vezes com PBS. Quando a coloração com os falotoxina fluorescentes (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha), que diluída 5 ul da solução metanólica em 200 ul de PBS para cada lamela de serem coradas. Para reduzir inespecífica coloração de fundo com estes conjugados, nós adicionamos 1% BSA à solução mancha. As lamelas, onde, em seguida, colocados em solução de coloração, durante 20 minutos à temperatura ambiente. Após a coloração, lamelas foram lavadas três vezes com PBS. A contracoloração foi realizada com DAPI (Invitrogen, Darmstadt, Alemanha). solução de DAPI foi diluída para 300 nM em PBS, e cerca de 300 ul desta solução de coloração DAPI foi adicionado à preparação lamela, cobrindo completamente as lamelas. As lamelas foram incubadas durante 1-5 minutos e lavadas três vezes em PBS durante 10 min. As amostras foram então fotografadas usando um microscópio de fluorescência. As amostras foram secas ao ar, montado, e armazenado no escuro a 2-6 ° C.
Elisa
sobrenadantes de cultura celular foram recolhidas a diferentes pontos de tempo e armazenado a -20 ° C . A MMP-1 Kit ELISA humana (Sigma-Aldrich St. Louis, EUA) e VEGF DuoSet ELISA Kit (R . D Systems GmbH Wiesbaden, Alemanha) foram usadas para medir os níveis destas proteínas de acordo com as instruções do fabricante
Estatísticas
Todos os experimentos foram realizados em triplicado para um mínimo de três experiências independentes. O software SPSS 19.0 pacote (International Business Machines Corporation) foi usado para análise estatística. Os dados estão representados como a média ± desvio padrão. As diferenças entre dois grupos foram comparados através de um
t-
teste. Quando três ou mais grupos foram analisados, foram utilizados ANOVA one-way e Pearson correlações ou teste SNK.
P Art 0,05 denota uma diferença estatística.
Resultados
A expressão de MMP-1 em 3D mono ou modelos de câncer de pulmão co-cultura
HCC, MRC-5, e macrófagos co grupos -cultura, juntamente com células MRC-5, HCC, e grupos mono-cultura de macrófagos foram cultivadas em FBS a 10% e o
2, tal como descrito nos métodos. Cada grupo tinha 2 x10
5 células inoculadas, e o rácio de HCC, MRC-5, e os macrófagos no grupo co-cultura foi de 5: 5: 1, e o grupo HCC e MRC-5 de co-cultura foi de 1 :. 1 |
Depois de 48 h, a expressão de MMP-1 na HCC, MRC-5, e do grupo co-cultura de macrófagos (1337,00 ± 42,43) foi maior do que no HCC e MRC-5 co- grupo de cultura (1166,25 ± 56,21), que também foi maior do que o grupo mono-cultura MRC-5 (991,50 ± 19,09) e foi significativamente maior do que o HCC (284,00 ± 18,38) e macrófagos (98,50 ± 7,12) grupos mono-cultura. HCC e grupos mono-cultura de macrófagos exibiu quase nenhuma expressão de MMP-1. MMP-1 foi significativamente maior nos grupos de co-cultura do que os grupos mono-cultura (n = 3,
P
0,05, Quadro 1 e Figura 1A, detectado por ELISA).
(a) Expressão de modelos de cancro de pulmão de co-cultura de MMP-1 em 3D mono- e às 48 h, detectadas por ELISA. A expressão de MMP1 em HCC MRC-5 macrófago grupo de co-cultura foi maior do que no carcinoma hepatocelular MRC-5 grupo co-cultura, ou MRC-5 /grupos mono-cultura /macrófagos HCC. Houve quase nenhuma expressão de MMP1 no grupo mono-cultura /macrófagos HCC. (B) A expressão de MMP-1 em mono- e 3D modelo de cancro de pulmão de co-cultura a 48 h detectados por Western blotting. Na Fig 1B, um, o peso molecular da MMP-1 é de 52 kD. A partir da esquerda para a direita, as pistas são: HCC grupo mono-cultura (2 x 10
5 células); MRC-5 do grupo de mono-cultura (2 x 10
5 células); MRC-5 e HCC grupo co-cultura (2 x10
5 células); HCC grupo mono-cultura (1 x 10
6 células); MRC-5 e HCC grupo de co-cultura (1 x 10
6 células); MRC-5 grupo mono-cultura (1 x 10
6 células). A expressão de MMP-1 em grupos de co-cultura foi maior do que em grupos de mono-cultura (cerca de 2 x 10
5 células e 1 x 10
6 células). A expressão de MMP-1 no grupo de células 1 x 10
6 foi maior do que o
grupo de células de 2 x 10 5, independentemente de mono-cultura ou designações grupo co-cultura. Na Fig 1B, b, os valores médios IOD da mancha de Western são apresentados. (C) A expressão da MMP-1, sob diferentes condições de co-cultura. Expressão de MMP1 sob 10% de FBS e O
2 (meio de cultura celular de 10% de FBS com O
2) foi maior do que sob w /o FBS e W /o O
2 (sem FBS e sem O
2) em 7 pontos de tempo diferentes. Além disso, a tendência expressão da MMP1 sob a condição de w /o FBS e w /o O
2 continuou a declinar a partir de 120 h.
A expressão de MMP-1 foi investigada pelos western Blot. grupos HCC e MRC-5 grupos mono-cultura e o HCC e co-cultura de células MRC-5 foram divididos em 2 x 10
5 células e 1 x 10
6 grupos de células, como descrito nos métodos. A razão entre o HCC e MRC-5 do grupo de co-cultura foi de 1: 1. Descobrimos que a expressão de MMP-1 em grupos de co-cultura foi maior do que em grupos de mono-cultura, tanto na 2 x 10
5 grupo de células e 1 x 10
6 grupos de células. Além disso, a expressão de MMP-1 no
6 grupos de células de 1 x 10 foi maior do que a 2 x10
5 grupos de células, independentemente de mono-cultura ou agrupamento de co-cultura (n = 5, P 0,05, Tabela 2 e Figura 1B).
A expressão de MMP-1 num modelo de cancro do pulmão de co-cultura em 3D sob diferentes condições de co-cultura
A expressão de MMP- 1 no carcinoma hepatocelular e modelo de co-cultura-5 MRC foi analisada sob diferentes condições de cultura: 10% de FBS e O
2 (10% de meio de cultura de células de FBS com O
2), e com nenhuma (sem FBS e ó
2) para explorar o efeito de simular hipóxia e carente de condição de soro fetal bovino em MMP-1 secreção. Os sobrenadantes de cultura de células foram recolhidos separadamente a partir de modelos de colagénio de co-cultura em 3D em sete diferentes pontos de tempo de 48 a 192 h. Cada grupo tinha um número igual de células (2 x 10
5) com uma proporção de 1: 1. Descobrimos que a expressão de MMP-1com FBS a 10% e O
2 foi mais elevada do que a expressão sem FBS e O
2 para todos os sete pontos de tempo. Além disso, a MMP-1, sem expressão de FBS e O
2 diminuiu 120-192 h (n = 3, P 0,05, Tabela 3 e a Fig 1C).
A expressão de VEGF em mono ou co-cultura modelos de câncer de pulmão em 3D
HCC, MRC-5, e co-cultura de macrófagos grupos, juntamente com MRC-5, HCC, e os grupos mono-cultura de macrófagos foram cultivadas em FBS 10% e O
2, tal como descrito nos métodos. Cada grupo tinha 2 x10
5 células semeadas e a proporção de HCC, MRC-5, e macrófagos; o grupo de co-cultura foi de 5: 5: 1 e o grupo de co-cultura MRC-5 e HCC foi de 1:. 1 |
HCC, MRC-5, e de macrófagos grupos mono-cultura foram cultivadas separadamente, e Os sobrenadantes de cultura de células foram recolhidos após 48 h. Descobrimos que a expressão do VEGF no grupo mono-cultura HCC (241,97 ± 78,56) era significativamente mais elevada do que no mono-cultura de células MRC-5 (12,69 ± 5,46) e do (13,65 ± 7,44) grupos de macrófagos de mono-cultura (n = 3,
P Art 0,05, Tabela 4 e Fig 2A)
(a) a expressão de VEGF no HCC, MRC-5, e os grupos mono-culturas de macrófagos.. A expressão do VEGF no grupo mono-cultura HCC foi significativamente mais elevada do que a expressão no grupo mono-cultura de células MRC-5 /macrófagos sob 10% de FBS e O
2 condições de cultura. (B) Expressão de VEGF em CHC, MRC-5, e os grupos de co-cultura de macrófagos em comparação com o grupo de mono-cultura HCC. A expressão do VEGF no HCC MRC-5 Macrófagos grupo de co-cultura foi maior do que no HCC MRC-5 do grupo de co-cultura e o grupo mono-cultura HCC cultivadas com 10% de FBS e O
2 durante 48 h. (C) A expressão do VEGF no carcinoma hepatocelular, MRC-5, e os grupos de co-cultura de macrófagos, sob diferentes condições de co-cultura. A expressão de VEGF em células cultivadas w /o FBS (carente de FBS, mas com O
2), w /o FBS e W /O O
2 (sem FBS e sem O
2) foi maior do que em 10% de FBS ou o
2 (meio de cultura celular com 10% de FBS o
2), enquanto que a expressão de VEGF em três condições diferentes aumentou em primeiro lugar e, em seguida, diminuiu.
O HCC, MRC-5, e o grupo co-cultura de macrófagos, HCC e MRC-5 grupo co-cultura, eo grupo mono-cultura HCC (como controlo) foram cultivadas separadamente, e os sobrenadantes de cultura de células foram coletadas em 48 h. A expressão de VEGF em ambos HCC, MRC-5, e macrófagos (492,84 ± 51,43) e os grupos de co-cultura HCC e MRC-5 (429,63 ± 54,13) foi maior do que no grupo de mono-cultura HCC (208,31 ± 46,45). A expressão de VEGF no HCC, MRC-5, e o grupo de co-cultura de macrófagos foi também mais elevado do que o HCC e o grupo de co-cultura MRC-5 (n = 3,
P
0,05, Quadro 5 e Fig 2B).
a expressão de VEGF no HCC, MRC-5, e macrófagos 3D modelo de cancro do pulmão co-cultura sob diferentes condições de co-cultura
HCC, MRC grupos de co-cultura -5 e macrófagos foram cultivadas sob três condições diferentes: 10% de FBS com O
2 (meio de cultura celular de 10% FBS com O
2), 0% FBS com O
2 ( sedentos de FBS, mas com O
2), e sem ambos (sem FBS e sem O
2). sobrenadantes de cultura de células foram coletadas em dez pontos de tempo diferentes. Descobrimos que a expressão de VEGF sob condições com 0% de FBS e O
2 e sem ambos era mais elevada do que a expressão na FBS a 10% com O
2 grupo, enquanto que a tendência da expressão de VEGF em todos os três condições aumento em primeiro lugar, em seguida, diminuiu (n = 3,
P Art 0,05, Tabela 6 e Fig 2C).
2D e modelo de co-cultura 3D
Um modelo de co-cultura gel de colágeno 3D foi estabelecida (Fig 3A). meio de cultura celular permeado no gel de colagénio, e as células cultivadas foram suspensas no espaço 3D.
(A) colagénio 3D modelo de co-cultura. Figura 3A, um: 1,0 ml de meio de cultura de células permeado no gel de colagénio a partir do topo, e as células cultivadas foram suspensas no espaço 3D gel de colagénio dentro. Fig 3A, b: 0,5 ml de gel de colágeno foi firmado no compartimento prato cada cultura de forma independente. (B) morfologias celulares em modelos 2D e co-cultura 3D em 48 h. Fig 3B, uma: Imagem de células de carcinoma hepatocelular e macrófagos em modelo de co-cultura 2D. A seta indica uma célula de carcinoma hepatocelular, que é plana e não esférica. Arrowhead denota macrófagos que cercam uma célula HCC em 40X. Fig 3B, b: A imagem de células de carcinoma hepatocelular e macrófagos em nosso modelo de co-cultura 3D. Arrowhead denota uma célula HCC, que é subglobose e espinhosa. A seta indica um macrófago. Esta imagem mostra que estas células estão em contacto um com o outro, como visto com CFDA SE Rastreio em um microscópio confocal. (C) Imagens de HCC, MRC-5, e macrófagos co-culturas em 48 e 168 h em 40X. Fig 3C, uma: macrófagos células de contato e HCC ataque após 48 h de co-cultura. Pontas de seta indicam o HCC, macrófagos, e células MRC-5. Fig 3C, b: Co-cultura após 7 dias. Como se vê nesta imagem após 7 dias de cultura, as células começaram a separar e flutuar no meio, tendo perdido a sua vitalidade e morfologia celular normal. A maioria das células do CHC e macrófagos foram mortos. (D) imagens de microscopia de fluorescência de MRC-5, macrófagos, e HCC em modelo 3D. Figura 3D (superior): imagens microscópio de fluorescência de células MRC-5, de macrófagos e culturas de carcinoma hepatocelular (Figura 3D, um). As células foram coradas com DAPI (Fig 3D, c) e falotoxina (Fig 3D, b). Figura 3D (inferior): Imagens de microscopia de fluorescência de macrófagos (Figura 3D, d). As células foram coradas por DAPI (Fig 3D, f) e falotoxina (Fig 3D, e).
morfologias célula do nosso 2D e modelos 3D foram comparadas (Fig 3B). No modelo de co-cultura 2D, a forma das células de carcinoma hepatocelular era plana e não-esférica (fig 3Ba), enquanto no modelo 3D, as células de carcinoma hepatocelular foram subglobose e espinhosa (Fig 3BB). Portanto, a forma de células de carcinoma hepatocelular foi significativamente diferente entre os modelos 2D e 3D.
Além disso, as imagens das células recolhidas após 48 horas de co-cultura mostraram que os macrófagos tinha contactado e atacou as células de carcinoma hepatocelular (Figura 3ca), enquanto que após 7 dias de co-cultura, poderíamos ver as células que flutuam no meio que perdeu sua viabilidade e teve morfologias alteradas. Tanto o HCC e populações de macrófagos foram em grande parte morta (Fig 3CB). imagens de microscópio de fluorescência de secções congeladas do MRC-5, modelo de macrófagos, e HCC eo modelo de macrófagos 3D também foram coletadas (Fig 3D).
disscussion
O desafio no desenvolvimento de novas terapias direcionadas reside em estabelecer
in vitro
modelos que melhor refletem as condições presentes
in vivo
. modelos 2D primeiros forneceram uma visão mecanicista em metástase básica NSCLC. No entanto, estes sistemas modelo pode não abranger toda a gama de redundância de sinalização e /ou mecanismos compensatórios. técnicas de co-cultura de células em 3D que usam células cancerosas em combinação com células do estroma pode ser um caminho promissor para a construção de um modelo mais representativo.
Em nosso estudo, nós estabelecemos um modelo de colágeno co-cultura tridimensional com pulmão células de cancro de adenocarcinoma de pulmão, f ibroblastos, e células imunitárias (macrófagos). Este modelo foi concebido para explorar o microambiente do tumor e as interações entre câncer de pulmão e células do estroma durante o processo de invasão e metástase de câncer de pulmão. Roskelley et ai. e Mitragotri et al. descobriram que as células cultivadas numa matriz 3D mostrou propriedades significativamente diferentes em termos de proliferação, diferenciação, morfologia e função celular [14, 15]. Da mesma forma, verificou-se que a morfologia das células de adenocarcinoma de pulmão HCC foi significativamente diferente entre 2D e modelos de co-cultura 3D. No modelo de co-cultura 2D, as formas das células de carcinoma hepatocelular foram achatado e em forma de folha, que fixa na parte inferior do prato de cultura de células, enquanto que no modelo 3D, as células de carcinoma hepatocelular foram subglobose e espinhosa. Este modelo câncer de pulmão co-cultura 3D não só fornece uma matriz extracelular de células de cancro do pulmão, o que é fundamental para a sua forma e função, mas também parece melhor simular o ambiente de vida e interações celulares que ocorrem
In vivo
.
em nosso estudo, descobrimos que os níveis de MMP-1 eram quase indetectável no HCC e grupos de monoculturas de macrófagos. os níveis de VEGF foram também quase indetectável no grupo monocultura MRC-5 e macrófagos, embora tanto a MMP-1 e VEGF foram abundantemente expressas em co-culturas destas células. Estes resultados demonstram as interacções entre o cancro do pulmão e células estromais são importantes para a expressão destes marcadores de metástases. Além disso, as expressões de ambos MMP-1 e VEGF foram maiores no modelo que combina todos os três tipos de células (HCC, MRC-5 e macrófagos), ainda mais elevados do que os níveis do sistema de cultura dupla com HCC e MRC-5. Os nossos resultados também sugerem que os macrófagos em modelos de co-cultura em 3D não só aumentar a expressão de MMP-1, mas também melhorar a capacidade das células de cancro do pulmão para promover a angiogénese. No entanto, durante o processo de co-cultura, descobrimos que os macrófagos também atacou e matou células de carcinoma hepatocelular. Esta observação sugere que a função dos macrófagos em cancro do pulmão pode ser uma “faca de dois gumes”, onde eles exibem tanto anti-tumorais e efeitos promotores tumorais relevantes para a invasão, metástase, e danos nos pulmões. Alguns relatórios têm associado uma abundância de macrófagos associados a tumores (TAM), com um prognóstico do paciente pobre [16, 17]. Thomsen et al. relataram que o cigarro provoca uma reacção inflamatória nos pulmões que recruta células inflamatórias, consequentemente, alterar a secreção de citocina, de tal forma que conduz a uma predisposição para o cancro do pulmão [18]. Shaked et al. demonstraram que as células derivadas da medula óssea, tais como linfócitos, macrófagos, neutrófilos, e células mastro (MCs) são frequentemente recrutados para o pulmão em resposta a danos nos pulmões; juntamente com os fibroblastos, células endoteliais e pericitos, células imunes parecem ajudar a condicionar o microambiente tumoral (TME) [19].
deficiência de tumor microambiental de oxigénio (hipoxia) também aumenta o comportamento maligno das células cancerosas, em parte através da família de factor de indutível por hipoxia (HIF) de factores de transcrição. HIFs regular a expressão de genes EMT-, assim como promover a angiogénese, a célula proliferação, e remodelação de tecidos [20]. No presente estudo, detectamos a expressão de VEGF no HCC, MRC-5, e o grupo co-cultura de macrófagos em três condições diferentes: 10% de FBS com O
2 (condições normais), 0% FBS com O
2 (carente de soro fetal bovino, mas com O
2), e 0% de FBS, sem O2 (simulando condições de hipóxia e inanição de soro). Descobrimos que a expressão de VEGF em condições de hipoxia ou inanição de soro foi maior do que em condições normais após 72 h de co-cultura, enquanto que a tendência na expressão de VEGF mostrou um aumento inicial, seguido por uma diminuição aparente. Isto pode ser devido a morte de células ao longo do tempo HCC mediada pelos macrófagos, o que causou uma diminuição latente na expressão de VEGF. Como também implicou, além da hipóxia, condições de fome pode promover a expressão de VEGF
in vitro
. No entanto, no grupo de HCC e co-cultura de células MRC-5, o qual foi utilizado para comparar a expressão de MMP-1, sob hipóxia ou privação de soro com condições normais, não se observaram diferenças significativas na expressão. Interpretamos isso significa que nem hipóxia ou privação de soro são fatores que influenciam a expressão de MMP-1. Além disso, a expressão de MMP-1 sob estas condições declinou continuamente ao longo do experimento 120 h. Uma explicação pode ser que as células esgotou os nutrientes necessários no meio de cultura e /ou baixa tensão de oxigênio causou-los a crescer mal e /ou parado divisão celular.
É hora de os reconsiderar os modelos 2D atuais usados para testar terapias de câncer de pulmão como o microambiente do tumor, presença de células estromais, componentes da matriz extracelular e moléculas de sinalização influenciar muito a aparência, saúde e atividades das células cancerosas. Propomos que a melhor abordagem seria a de engenharia terapias que também são dirigidas contra as células de tumor e de estroma microambiente, que também são importantes para a metástase e angiogénese. Terapias que visem única e trabalham diretamente em células de câncer de pulmão pode não ser tão eficaz, porque eles não conseguem tratar os factores-chave envolvidos na progressão tumoral. células de câncer de pulmão são heterogêneos e possuem diferentes propriedades histológicas, juntamente com o fato de que eles são geneticamente instáveis durante a progressão da doença; todos estes são principais razões para o fracasso dos tratamentos de câncer de pulmão que se concentram em alvos muito específicos em células de câncer de pulmão. Além disso, um elevado nível de resistência a drogas normalmente acompanha terapias que visam directamente a células tumorais. Em resumo, vemos as vantagens de terapias dirigidas às células microambiente do tumor e de estroma: 1) que não têm como alvo um aspecto específico de células tumorais altamente variáveis, 2) se dirigem a células do estroma, que possuem um fundo genético estável e estabilidade hereditária, e 3) células estromais são menos propensas a mutações genéticas e resistência aos medicamentos, mas eles têm um impacto importante na progressão tumoral e metástase, de tal forma que inibindo a sua função pode progressão efetivamente retardar ou parar tumor /espalhando.
Conclusões
O microambiente do tumor é composto de células cancerosas, células intersticiais, citocinas e quimiocinas. Geralmente, as células intersticiais, incluindo fibroblastos, células do sistema imunológico, células endoteliais, e células imaturas são derivadas a partir da medula óssea. Concentrando-se na compreensão de como a função de células intersticiais no microambiente do tumor pode levar a melhorias em terapias anti-câncer. O nosso trabalho mostrou que a morfologia das células de CHC é significativamente diferente entre 2D e modelos de co-cultura 3D. A expressão de MMP-1 e VEGF é regulada em modelos de co-cultura 3D em comparação com modelos de monocultura, o que demonstra que as interações entre células de câncer de pulmão e células do estroma pode ter um papel significativo na possibilitar e promover metástase. No modelo de cancro do pulmão de co-cultura 3D, condições de hipoxia e fome simulados induziu a secreção de VEGF, mas não a MMP-1. Macrófagos no microambiente do tumor pode servir dois papéis em atacar células tumorais, ao mesmo tempo, upregulating vias de sinalização que ajudam na invasão tumoral e metástase.
Outlook
terapias que atingem as células do estroma tumorais pode representar uma mais eficaz abordagem para combater o cancro. No entanto, pouco se sabe sobre a interação entre células estromais e tumores;