Abstract

O gene TP53 é encontrado para ser mutado em 50% de todos os cânceres. A proteína p53, produto do gene TP53, é uma proteína multi-domínio. É constituída por um domínio de ligação de ADN do núcleo (DBD), que é responsável pela sua ligação e transcrição de genes alvo a jusante. As mutações na proteína p53 são responsáveis ​​pela criação de condições cancerosas e são encontrados para estar ocorrendo com uma frequência alta na região de DBD de p53. Algumas destas mutações também são conhecidos por serem sensíveis à temperatura (

TS

) na natureza. Eles são conhecidos por apresentar parcial ou forte ligação com o DNA no intervalo de temperatura (298-306 K). Considerando que, em 310 K e acima mostram perda completa na ligação. Analisamos as mudanças na ligação e no comportamento conformacional em 300 K e 310 K para três dos

ts

-mutants

viz

., V143A, R249S e R175H. simulações QM-MM têm sido realizados sobre o tipo selvagem e os acima mencionados

ts

-mutants por 30 ns cada. A estimativa adequada de energia livre de ligação para um determinado número de ligações de hidrogênio de interface foi calculado usando o método da máxima verossimilhança, como descrito por Chodera et. ai (2007). Este parâmetro tem sido observado para ser capaz de imitar a afinidade de ligação da p53

TS

-mutants a 300 K e 310 K. Deste modo, a correlação entre MM-GBSA energia livre de ligação e ligações de hidrogénio formada pela interface resíduos entre p53 e DNA revelou a natureza dependente da temperatura destes mutantes. O papel dos diedros da cadeia principal foi obtido através da realização de análise de componentes principais diedro (APC). Esta análise sugere que as variações conformacionais nas principais diedros da cadeia (

φ

e

ψ

) do p53

ts

-mutants pode ter causado redução na estabilidade global da proteína. A exposição a solventes das cadeias laterais dos resíduos de interface foram encontrados para impedir a ligação da p53 ao ADN. Área solvente Accessible Superfície (SASA) também provou ser uma propriedade crucial para distinguir os conformadores obtidos a 300 K e 310 K para as três

ts

-mutants do tipo selvagem a 300 K.

Citação: Koulgi S, Achalere a, Sonavane U, Joshi R (2015) Investigando DNA Encadernação e conformacional variação de temperatura sensíveis Mutantes câncer p53 Usando QM-mM simulações. PLoS ONE 10 (11): e0143065. doi: 10.1371 /journal.pone.0143065

editor: Freddie Salsbury Jr, da Universidade Wake Forest, Estados Unidos

Recebido: 24 Julho, 2015; Aceito: 30 de outubro de 2015; Publicação: 18 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Koulgi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de informação de apoio

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a via p53 desempenha um papel crucial para a supressão de tumor eficaz, que ativa os genes em resposta ao estresse celular [1, 2]. Mutações em p53 no entanto, dificulta esta via por comprometer a atividade funcional do p53 [3]. Em quase 50% dos cancros humanos, são observadas mutações na proteína p53 [4, 5], [6]. A maioria destas mutações são encontrados no domínio de ligação a DNA específica de sequência núcleo (DBD) de p53 [7-10]. Estas mutações são conhecidos por afectarem a estabilidade termodinâmica das DBD e a proteína inteira também. A estrutura cristalina de p53 revela que uma grande

β

sanduíche fornece um andaime para uma região conservada DBD. Esta região consiste de um DBD motivo ciclo-folha-hélice e duas grandes laços amarrados por um ião de zinco (Fig 1A) [11]. A actividade de ligação a ADN de p53, envolve a associação de ião de zinco, que é conhecido por formar um complexo tetraédrico coordenação com CYS 176, 238 O CYS Cys 242 179 e seus resíduos da proteína. O ião zinco desempenha um papel importante na estabilização das alças associadas com o seu complexo tetraédrico e correcta de ligação da p53 ao sulco menor do ADN específica em células intactas [12, 13]. Embora a maior parte dos resíduos no ADN do domínio de ligação de p53 são altamente susceptíveis a mutações, existem sete pontos quentes onde mutações ocorrem a uma frequência muito alta [14-19]. Compreender a consequência estrutural e funcional destas mutações tem sido de grande interesse em estudos de câncer [14], [20].

Desde a metade dos cânceres humanos estão associados a mutações em p53, cancro futuro terapêutico estratégias estão a ser alvo para drogas que estabilizam o domínio do núcleo p53 mutante [10]. No entanto, muitas investigações experimentais sobre mutantes hot spot têm revelado a sua dependência da temperatura para a ligação de ADN de afinidade [21-23]. Nas últimas duas décadas extensos esforços experimentais têm sido focados para compreender o sensível à temperatura (

TS

) natureza dos vários mutantes de p53 e o seu mecanismo conformacional [21-24] [25, 26]. A primeira investigação experimental detalhado sobre

ts

-p53 mutantes relatados por Zhang et. ai. e Friedlander et. ai. ter explicado seu DNA ligação a 310 K [21, 22]. Eles observaram que a 298 K

ts

-mutants mostra a capacidade que é destruído irreversivelmente na aquecimento a 310 K [22] vinculativo. Com estas experiências era evidente que os mutantes p53 hot spot V143A, R248Q, R249S, R273H excepto R175H foram capazes de se ligar ao DNA no sub-intervalo de temperatura fisiológica (298-306 K) e perdem a sua ligação completamente a 310 K. A ligação de estabilidade e de conformação membros dessas

ts

-p53 mutantes também têm sido estudados por ligação de anticorpos monoclonais como PAB 1620 e PAB 1801 [21, 22]. Da mesma forma, um dos trabalhos de Bullock et. ai. mostraram que o uso de calorimetria de varrimento diferencial ou espectroscopia leva a desnaturação irreversível do domínio do núcleo p53 mutante com alterações da temperatura [23]. Experimentos em mutantes de p53 em várias faixas de temperatura têm encontrado para recuperar algum nível de transativação quando expressa a temperaturas reduzidas [21, 24]. Com base na temperatura de dobragem quantitativa dependente de resíduos de p53 e estudos de ligação de DNA, mutantes de p53 foram classificadas em classes distintas [25]. extenso trabalho feito por Shiraishi et. ai. mostrou o mecanismo dependente da temperatura intra-molecular de cerca de 2000 mutantes missense. Ele também incluiu o estudo de transativação em 303 K e 310 K [26]. dependente da temperatura p53 mutantes parcialmente inactivos foram relatados para actuar mecanismo de reactivação por amifostina em levedura [27]. Experiências recentes em células de cancro da mama lobular revelaram atividade funcional sensível à temperatura de mutantes p53 e há papel no caminho evolutivo clonal [28].

Apesar de profunda observação experimental sobre a atividade de ligação ao ADN de

ts

-mutants de p53 muito poucos estudos teóricos e computacionais têm sido focados para entender este fenômeno. simulação de dinâmica molecular é um estado atual do método da arte para sondar os meandros das relações estrutura-funcional de biomoléculas. Ele também complementa as observações experimentais, dando uma visão sobre interações nível atômico. No passado recente, algumas análises têm sido relatados usando simulações de dinâmica molecular para investigar temperatura comportamento sensível de mutantes câncer p53. Tan e colaboradores analisaram a mutação missense de DBD a 310 K com base na correlação estabilidade DBD com estrutura de sequência e contactos moleculares neles [29]. Uma correlação abrangente estabilidade também foi proposta com base em dados clínicos e funcionais [29]. Recentemente, o efeito fenotípico de polimorfismos de nucleotídeo único não-sinônimas no gene TP53 foi estudada usando simulações de DM em proteínas p53 mutantes e WT [30]. Nas outras simulações MD mão no mutante R248Q revelaram a natureza sensível à temperatura deste mutante no DNA de ligação interação e seu comportamento dinâmico [31]. No entanto, há uma necessidade de investigar mais profundamente, de modo a fixar o ponto a estrutura de relações funcionais

TS

-mutants. Como uma tentativa Este artigo apresenta o estudo de simulação QM-MM na temperatura mutantes p53 dependentes. O complexo de coordenação de zinco é muito importante para a ligação a ADN de p53, tal como explicado anteriormente [12, 13]. É difícil sustentar este complexo de coordenação em simulações MD clássicos. Portanto, em muitos dos estudos de simulação anteriores sobre p53, diferentes estratégias como átomo manequim, ligado e campo de força abordagem modificada têm sido utilizados para manter o complexo de coordenação de zinco [32-34]. Da mesma forma, no presente estudo, foi feita uma tentativa para preservar este complexo tratando-o com a mecânica quântica (MQ) em vez de aplicar quaisquer restrições forçadas. Executando QM em uma porção importante, tais funcional da proteína ajudaria na imitando o comportamento biológico real [35]. O uso da abordagem QM-MM para manter o complexo de coordenação de zinco foi incorporada em um de nossos estudos anteriores sobre os mutantes p53 [36]. Assim, a manutenção do complexo de coordenação de zinco foi a única intenção de introduzir o tratamento quântico.

O objetivo deste artigo é dar uma visão sobre as variações de conformação e o DNA propriedades de

ts

-p53 variantes. Três conhecido

ts

-mutants

viz

., V143A, R249S e R175H foram estudados por meio de simulações QM-MM. A natureza sensível à temperatura foi estudada em duas temperaturas

viz

., 300 K (temperatura ambiente) e 310 K (temperatura fisiológica).

V143A, R249S e R175H são mutantes estruturais e são conhecidos para distorcer a estabilidade conformacional da p53-DBD. V143A encontra-se na

β

-sandwich região do motivo ciclo-folha-hélice do p53-DBD, que é responsável pela ligação de ADN grande ranhura (Fig 1B). Este

ts

-mutant é conhecido para criar cavidades no núcleo hidrofóbico, formado devido ao

β

-sandwich. Também desestabiliza drasticamente o domínio do núcleo de p53 por uma diferença de 4 kcal /mol [14]. V143A ser um

TS

-mutant liga-se melhor do que o tipo selvagem p53 a 300 K. No entanto, esta capacidade de ligação está completamente ausente, a 310 K [21].

R249S encontra-se na ligação de DNA superfície, a cadeia lateral da arginina 249 está envolvido na estabilização do circuito L3 que é uma parte do domínio de ligação ao ADN menores-ranhura (Fig 1B). Esta arginina em se substituído por serina leva a uma conformação não nativa de L3 circuito que afecta mais de ligação a ADN. R249S

ts

-mutant é conhecido por apresentar parcial de ligação ao DNA a 300 K enquanto que o mesmo é completamente abolida em 310 K [22].

R175H está localizado perto do zinco ion complexo tetraédrico , que é responsável pela ligação secundária em associação com dois grandes laços L2 e L3 (figura 1B) do sulco. Supõe-se que esta

TS

-mutant perturba a região de ligação do zinco. quantidade mínima de estudos estruturais estão disponíveis para este

ts

-mutant. A sua natureza dependente da temperatura mostra que a 300 K há uma redução na ligação ao DNA que, mais tarde, perde-se a 310 K. A compreensão completa da natureza dependente da temperatura destes mutantes exige extensa análise conformacional. Assim, este artigo trata das variações de ligação estruturais e de DNA que ocorrem nestes três

ts

-mutants

viz

., V143A, R249S e R175H.

Métodos

Preparação do Sistema

as coordenadas para a estrutura começando foram selecionados a partir da cadeia B e todo o DNA de cadeia dupla de PDB ID 1TSR [11]. Cada mutante câncer foi preparado por considerar esta estrutura como referência usando o

xleap

módulo de AmberTools 1.5 [37]. O ião de zinco estava presente num complexo de coordenação tetraédrica com CYS 176, Cys 238, CYS HIS 242 e 179. A distância de ligação e ângulo de informação para o complexo tetraédrico foram obtidos a partir do trabalho relatado por Lu et ai. no ano de 2007 [32]. Todo o complexo p53-ADN-zinco foi inicialmente neutralizado por adição de iões de Na +, seguido de solvatação explícita usando o modelo de água TIP3P [37]. A solvatação foi realizada dentro de um octaedro, a distância mínima entre o soluto (complexo ADN-p53) e a borda da caixa de simulação era 12

A

. A topologia e as coordenadas para todas as variantes de p53 foram gerados utilizando o campo de força âmbar FF03 [37]. O tamanho do sistema para cada um dos variantes de p53 foi de aproximadamente 63.300 átomos.

simulações QM-MM

Em cada sistema do ADN de p53-solvatado, o complexo de coordenação de zinco foi retida na forma não-ligado, utilizando o método da mecânica quântica (QM). O resto do sistema de simulação tinha sido tratada utilizando abordagem mecânica molecular (MM). Portanto, a cada minimização, rampa de temperatura, de equilíbrio e de produção protocolos de execução foram simulações QM-MM. O método PM3 [38] foi seleccionado para a região do QM que, o campo de força âmbar FF03 foi aplicada à região do MM [37]. A carga total da região de QM foi considerado +2 atribuindo à carga no íon zinco. Os títulos que contêm átomos de hidrogênio na região de QM e MM foram constrangidos usando o algoritmo AGITAÇÃO [39]. O conjunto canónico, NVT foi aplicada, em que o número de átomos de volume da caixa, e a temperatura de cada um dos sistema foram mantidas durante toda a simulação [40]. A interface QM-MM foi tratado de acordo com a abordagem átomo de ligação com os parâmetros padrão pré-definido [41-43]. As simulações foram realizadas em um intervalo de tempo de 2 fs usando dinâmica de Langevin e uma frequência de colisão de 0,1 ps

-1 [40]. O contorno periódicas Condição (PBC) foi aplicada para realizar a dinâmica de volume constante. O método de partículas malha Ewald (PME) foi empregado com um não-ligado cut-off de 12

A

. A minimização foi realizada em duas fases. Inicialmente, o solvente foi minimizado utilizando o método de descida mais acentuada para 20000 passos. Seguido por, a p53-ADN-Zn complexo de ser liberado para a minimização nos próximos 50000 passos. O protocolo de simulação era idêntico para todas as variantes de p53 até esta etapa. No entanto, como as simulações foram feitas a duas temperaturas diferentes

viz., 300 K e 310 K, a temperatura foi realizada aumentando para 40 ps cada obter estas temperaturas, respectivamente. Um equilíbrio durante 2 ns e uma campanha de produção, para 30 ns cada, foi realizada para todas as variantes de p53 a 300 K e 310 K. A âmbar 10 pacote de simulação foi utilizado para todas as simulações. seis simulações geral QM-mm foram realizadas compreendendo p53 do tipo selvagem, a 310 K, V143A a 300 K e 310 K, R249S, a 310 K e R175H a 300 K e 310 K. Os dados de WT e R249S a 300 K foi obtido do nosso trabalho anterior [36].

Estas simulações foram ainda analisados ​​utilizando diferentes módulos [44] AmberTools 1.5. O módulo cpptraj e MMGBSA AmberTools de 1,5 foi usada para calcular os parâmetros de ligação de hidrogénio e de energia livre para as simulações. Uma ferramenta chamada GeoPCA, foi usada para realizar diedro APC [45]. PCA é uma técnica estatística multivariada que representa um conjunto de variáveis ​​correlacionadas como componentes principais ortogonais. Estes componentes principais ajudar na análise da variabilidade presente em qualquer dado. APC prova ser uma ferramenta muito útil para investigar os diferentes tipos de movimentos locais que são responsáveis ​​pelas alterações conformacionais em proteínas simulados. Além disso, o solvente área de superfície acessível (SASA) foi calculada utilizando o programa NACCESS [46].

Resultados e Discussão

Efeito no DNA ligação de p53

ts

-mutants

a capacidade de ligação do ADN de todas as variantes de p53 foram estimada pelo cálculo da mudança na energia livre de ligação e o número de ligações de hidrogénio (hbonds) formados pelos resíduos de interface entre a p53 e ADN. Os valores de energia livre foram calculados usando o módulo de MMPBSA AmberTools 1,5 [44]. A mudança na energia livre foi calculado da seguinte forma: (1) (2) AE

gás

, (

com

,

rec

,

lig

) é a energia mecânica molecular e ΔG

sol

(

com

,

rec

,

lig

) é a energia de solvatação calculada por generalizadas Born (GB) modelo de solvatação para o complexo, receptor e ligando, respectivamente. Estes dois termos contribuir para a parte entalpia do cálculo da energia livre. O TΔ S

(

com

,

rec

,

lig

) termo mostra a contribuição entrópica para a energia livre calculada. cálculo de entropia ser fortemente computação intensiva, foi ignorado para os cálculos de energia livre. Portanto, a seguinte equação foi utilizada no presente trabalho, (3) No entanto, a energia livre de MM-GBSA com e sem a contribuição entrópica foi calculada para os últimos 10 ns das simulações (S1 e S2 Figs). Os valores de energia livre, observada uma tendência semelhante em ambos os casos. Assim, TΔ S

(

com

,

rec

,

lig

) que atribui à parte entropia de energia livre não foi incluído nos termos de energia livre calculado. Estes valores de energia livre foram optimizadas para obter uma estimativa adequada de energia livre para determinado número de hbonds entre p53 e DNA usando o método da máxima verossimilhança [47]. A equação utilizada para calcular a estimativa adequada de energia livre foi a seguinte, (4) (5) é a estimativa ideal de ΔΔ

G

ligamento

(

opt

ΔΔ

G

ligamento

) para o número k de hbonds interface entre p53 e DNA [47]. Considerando que,

x

n

é a Δ Δ G

ligamento Compra de número instantâneo n e

δ

2

x

k

é a medida de incerteza observado nos valores de energia livre

x

n

com o número k da interface de hbonds (Eq 5).

o número de hbonds foram calculados utilizando o módulo cpptraj de AmberTools 1.5 [44]. O ponto de corte para a distância de ligação doador-receptor e ângulo foi considerada 3

A

e 135 °, respectivamente. Os hbonds formados pelos resíduos de interface oito

viz

., Lys 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 e 283 ARG com o DNA foram considerados como os hbonds interface para todas as variantes de p53. Além disso, em um dos nossos trabalhos anteriores, um tipo semelhante de abordagem foi utilizada com base no MM-GBSA energia livre de ligação e os hbonds formadas entre p53 e DNA. Esta comparação revelou a diferença no DNA propriedade do tipo selvagem, câncer e salvamento mutantes de p53 [36] vinculativo. Da mesma forma, a análise realizada neste trabalho representa a estimativa ideal de MM-GBSA energia livre de ligação (

opt

ΔΔ

G

ligamento

) específico para as ligações de hidrogênio formado pela resíduos da interface.

opt

ΔΔ

G

ligamento

foi calculada para o tipo selvagem (WT) e todos os três

ts

-mutants de p53 em 300 K e 310 K. O toda trajetória de 30 ns foi considerado para esta análise. A comparação entre o

TS

-mutants com WT a 300 K e 310 K tem sido representada na Fig 2. A Fig 2A e 2D apresenta os resultados para V143A WT e a 300 K e 310 K, respectivamente. Observou-se que a 300 K, os valores de energia livre foram menores para V143A em comparação com WT, o que sugere uma melhor ligação em V143A (Fig 2A). Por outro lado, foi observado para enfraquecer a 310 K (Figura 2D). Fig 2B e 2E mostra a energia livre de ligação de R249S e WT a 300 K e 310 K, respectivamente. foi claramente observado que em ambas as temperaturas, os valores de energia livre para R249S foram maiores do que a do WT. A Fig 2C e 2F mostra a comparação entre R175H e WT a 300 K e 310 K, respectivamente. Aqui, mais uma vez R175H apresentaram valores mais elevados de energia livres do que WT em ambas as temperaturas.

Estas observações obtidas de cálculo do

opt

ΔΔ

G

ligam

com base na ligação de hidrogénio, mostra que todos os três

TS

-mutants perdem a sua afinidade de ligação, a 310 K, quando em comparação com WT. No entanto, mostra V143A ligação melhorada do WT em 300 K, que também foi relatado por experiências em

ts

-p53 mutantes

viz

., Friedlander et. al (1996), Bullock et. ai (1997, 2000) e Zhang et. ai. (1994) [22], [23], [25], [21]. Estes estudos experimentais também sugerem que R249S e R175H ligar fracamente a 300 K, mas a atividade está completamente perdido em 310 K. Assim, os resultados obtidos para R249S e R175H do estudo simulações discutidas neste artigo, concorda com as observações relatadas nesses estudos experimentais [22], [23], [25], [21].

para adicionar suporte a estas observações num lote de MM-GBSA derivados ΔΔ

G

ligamento

contra o tempo foi fornecido nos dados complementares como S3 Fig. Uma comparação da temperatura destes

ts

-mutants também foi fornecido nos dados complementares como S4 Fig. Estes resultados também complementar os achados experimentais mencionados acima relatados no

ts

-mutants de p53.

opt

ΔΔ

G

ligamento

sendo um parâmetro, calculada estatisticamente, viria a ser mais significativo com grande número de observações. Assim, uma simulação idêntico para WT a 300 K foi realizada durante 30 ns e instantâneos foram capturados cada 10 ps que aumenta os pontos de dados para 6000 instantâneos. S5 Fig mostra a comparação for

opt

ΔΔ

G

ligamento Compra de WT a 300 K com 3000 (Run1) e 6000 (Run1 + Run2) instantâneos, respectivamente.

Temperatura de estabilidade mutantes sensíveis e cadeia principal diedros

o

ts

-mutants de p53 são conhecidas para induzir perda de ligação ao DNA, bem como a distorção estrutural do DBD p53. A fim de proporcionar uma visão sobre as mudanças estruturais que ocorrem devido às mutações principais diedros da cadeia

φ

e

ψ

foram submetidos a Análise de Componentes Principais (PCA). APC prova ser uma ferramenta muito útil para investigar os diferentes tipos de movimentos locais que são responsáveis ​​pelas alterações conformacionais em proteínas simulados. As principais cadeias de diedros (

φ

e

ψ

) foram utilizados como reacção coordenadas eo PCA foi realizada utilizando GeoPCA [45]. O principal componente 1 (CP1) e 2 (PC2) foram calculados para os mutantes e do tipo selvagem. As parcelas para PC2 contra PC1 tenham sido fornecidos nos dados suplementares de S6-S9 Figs. S6 e S7 Figs mostra a distribuição de confórmeros baseado em PC1 e PC2 de

φ

diedros a 300 K e 310 K, respectivamente. Da mesma forma, S8 e S9 figuras mostram a distribuição de confórmeros baseado em PC1 e PC2 de

ψ

diedros a 300 K e 310 K, respectivamente. A variação observada no PC1 e PC2 para ambos

φ

e

ψ

ângulos em todos os casos foram dadas em S10 Fig. Pode ser visto que tanto o

φ

e

ψ

ângulos mostraram maior variação nos valores PC2 em ambas as temperaturas.

O

φ

diedros mostrou alterar em PC2 com o aumento da temperatura para a WT e todos os três mutantes de p53. No entanto, para

ψ

diedros exceto para WT todos os três

ts

mutantes não apresentaram variação significativa em relação à temperatura. A fim de observar as implicações desta mudança em

φ

e

ψ

diedros na estabilidade global da proteína, o Δ

G

proteína

foi plotados contra os valores PC2 para WT e cada um dos p53

ts

-mutants (Figuras 3 e 4). Figuras 3 e 4 explicam a distribuição da população dos conformadores baseado em PC2 de

φ

e

ψ

ângulos wrt a energia livre da proteína total (Δ G

proteína

), respectivamente. A análise foi realizada em instantâneos capturados em cada 10 ps para os últimos 10 ns da simulação. Figura 3A e 3D mostra a distribuição de WT e V143A a 300 K e 310 K, respectivamente. A distribuição da população de espectáculos V143A se sobrepõem com o WT em ambas as temperaturas. WT e V143A atingir a conformação cis a 300 K, que deriva ainda mais gradualmente para a região trans em 310 K. No entanto, o Δ G

proteína

valores aumentaram em 310 K para ambos, em comparação com 300 K. Fig 3B e 3E descreve a distribuição para R249S e WT a 300 K e 310 K, respectivamente. A 300 K, WT atinge os cis e R249S é dispersa na região trans com valores de energia livre mais elevadas. A 310 K, R249S tende a preencher o formulário de cis com energia livre maior do que WT em 310 K e auto em 300 K. Fig 3C e 3F reflete o comportamento dos R175H em comparação com WT a 300 K e 310 K, respectivamente. A população parece estar fortemente espalhados ao longo de toda a gama de

φ

com energia livre valores superiores a WT em ambas as temperaturas.

Estas observações sugerem que, para V143A o conformações tendem a preencher a mesma região com valores de energia livre semelhantes como visto no WT em 300 K e 310 K. Assim, inferindo conformações semelhantes obtidas pela

φ

ângulos em V143A e WT em ambas as temperaturas. No entanto, para R249S o

& Phi

ângulos poderia indicar com sucesso as conformações geometricamente opostos obtidos a 300 K e 310 K em comparação com WT e auto. Em que, a 310 K os valores de energia livre foram maiores do que a WT, com uma diferença de 1000 kcal /mole. A rigidez adquirida pelos

& Phi

ângulos em R249S a 310 K pode ter levado ao aumento da energia livre que infere perda de estabilidade. R175H não mostrou conformação dominante particular, adquirida pelos

& Phi

ângulos como a população parecia estar completamente espalhar. No entanto, em ambas as temperaturas R175H pareceu ser menos estável do que a WT, em termos de energia livre da molécula de p53. Portanto, Fig 3 infere que o aumento da temperatura induz alteração no

φ

ângulos para WT, V143A, R249S e R175H que por sua vez reduz a sua estabilidade.

Figura 4A e 4D mostram a

ψ

ângulos de distribuição para WT e V143A a 300 K e 310 K contra o Δ G

proteína

. As conformações tanto WT e V143A parecem estar dispersos e abrangem os níveis de energia gratuitos similares. No entanto, em 310 K do WT tende a povoar a região cis enquanto V143A continua a ser espalhada. Os níveis de energia livre em 310 K foram similares tanto para V143A e WT e maior do que o que foi observado em 300 K. Fig 4B e 4E fala sobre a distribuição conformacional de WT e R249S a 300 K e 310 K, respectivamente. A 300 K, a população é espalhada em toda a gama de

ψ

mas os valores de energia livre são mais elevados em comparação com WT. A 310 K, o comportamento dispersa de R249S foi mantido em níveis de energia até mesmo superior gratuito em comparação com auto e WT. Fig 4C e 4F descreve a distribuição da população por R175H a 300 K e 310 K, respectivamente. A 300 K, os conformadores para R175H foram espalhados em toda a gama de -180 ° a 180 ° e em maior nível de energia livre em comparação com WT. A 310 K, os confórmeros tendem a aglomerar em cis e trans para regiões R175H, embora os níveis de energia livre são mais elevadas do que a do WT. No geral, para todos os três mutantes

ψ

ângulos levou a conformações que aumentar a energia livre da molécula de p53, a 310 K, em comparação com WT e-se a 300 K.

No caso de WT tanto o

φ

e

ψ

ângulos apresentaram alteração com o aumento da temperatura. V143A, R249S e R175H mostrou mudanças no

φ

distribuição angular com aumento dos valores de energia livre por 200 kcal /mole em 310 K em comparação com 300 K. No entanto, no caso de todos os três

ts

-mutants

ψ

distribuição ângulo era semelhante em ambas as temperaturas, mas os valores de energia livre parecia ser mais elevado por 200 kcal /mol a 310 K. Estas distribuições de confórmeros com base na energia livre da molécula de p53 e PC2 dos principais diedros da cadeia sugere que ou

φ

ou

ψ

ou ambos pode ser responsável pela mudança na sua estabilidade. Por conseguinte, a distribuição conformacional baseado em diedros da cadeia principal e a energia livre da molécula de p53 ajuda para deduzir essa temperatura pode induzir alterações na estrutura global da p53. Esta adaptação de diferentes conformações a temperatura mais elevada induz a perda de estabilidade em V143A, R249S e R175H em termos de energia livre.

Efeito da temperatura sobre resíduos de interface de

ts

-mutants

DBD de p53 é conhecida por ter duas regiões distintas que contribuem para a ligação ao ADN

viz., o motivo ciclo-folha-hélice e loops 2, 3 com zinco co-ordenação complexo. Estas duas regiões consiste em oito resíduos importantes

viz

., Lys 120, SER 241, ARG 248, ARG 273, ALA 276, CYS 277, ARG 280 e 283 ARG, que desempenham um papel crucial na formação de p53-DNA interacções. A fim de verificar o efeito da temperatura sobre a sua participação na actividade de ligação ao DNA, cadeia lateral área de solvente superfície acessível (SASA) e da contribuição da energia livre na ligação foram calculados para estes oito resíduos. Esta análise foi realizada durante os últimos 10 ns das simulações.

exposição a solventes de resíduos de interface.

Houve vários estudos relatados em modelos de sistemas de proteínas diferentes que discutem a exposição a solventes como um dos factores determinantes para a manutenção da estabilidade da proteína [25, 48, 49]. Especialmente no caso de p53 qualquer alteração da sua exposição a solventes é conhecido por desempenhar um papel importante na definição de estabilidade dos seus mutantes [25]. No entanto, a exposição dos resíduos ocultos tende a desestabilizar a proteína mais em comparação com aqueles que se encontram na superfície da proteína. A fim de investigar estes resultados experimentais, a cadeia lateral SASA para os resíduos de interface oito foram calculados.

A Fig 5 descreve a cadeia lateral média SASA para todos os oito resíduos de interface a 300 K (Figura 5A) e 310 K (Figura 5B). As barras de erro nestes dois algarismos indicam os valores de desvio padrão. O comportamento de cadeia lateral SASA para cada um dos oito resíduos de interface w.r.t tempo para todas as variantes de p53 de 300 e 310 K foram fornecidos em dados suplementares (S11-S18) Figs. Considerando WT a 300 K o mais próximo conformação nativa da proteína p53, a comparação de outros variantes de p53 foi discutido aqui. A diferença nos valores de SASA têm sido relatados em parênteses. Sempre que esta diferença de SASA foi maior do que o desvio padrão da variante de p53, foi considerado como sendo estatisticamente significativo. V143A teve quatro dos oito resíduos

viz

., Lys 120, ARG 273, CYS 277 e 280 ARG com mais exposto (10-30

A

2) cadeias laterais em 300 K e 310 K de WT em 300 K. destes quatro, exceto para ARG 273 os três restantes mostraram estatisticamente significativa diferença SASA. A exposição solvente para ARG 248 a 300 K foi menor do que a WT a 300K (20

A

2), que foi encontrado para aumentar em 310 K. No entanto, este aumento da SASA para ARG 248 a 310 K foi acompanhado por grande desvio padrão (aproximadamente 20

a

2). Os três restantes resíduos

viz

., SER 241, ALA 276 e 277 CYS diferia ligeiramente (menos de 15

A

2), em comparação com WT em 300 K. R249S tinha seis ai. ai. ai.